氯通道在三氧化二砷诱导鼻咽癌细胞凋亡中的作用

目的:探讨氯通道在三氧化二砷(arsenic trioxide,As_2O_3)诱导人鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡中的作用。方法:采用流式细胞术检测CNE-2Z细胞经As_2O_3作用24及48 h的凋亡率;应用膜片钳技术记录As_2O_3激活的细胞膜电流,并分析其电流特性;采用流式细胞术检测氯通道阻断剂DIDS对As_2O_3诱导的CNE-2Z细胞凋亡的抑制作用。结果:(1)5μmol/L As_2O_3能够时间依赖性地诱导的CNE-2Z细胞凋亡;(2)CNE-2Z细胞外灌流含5μmol/L As_2O_3的等渗溶液能够激活一个具有外向整流特征的电流,激活的电流无明显的时间及电压依赖性失活,翻转电位接近氯平衡电位;(3)As_2O_3激活的电流能够被氯通道阻断剂DIDS和NPPB完全抑制,细胞外灌流47%的高渗溶液能够完全抑制As_2O_3激活的电流;(4)氯通道阻断剂DIDS能够抑制As_2O_3诱导的CNE-2Z细胞凋亡。结论:As_2O_3可以激活CNE-2Z细胞的容积敏感性氯通道。氯通道在As_2O_3诱导的CNE-2Z凋亡中发挥重要作用。     

顺铂激活的低分化鼻咽癌细胞氯电流

目的： 研究抗癌药顺铂对低分化鼻咽癌细胞（CNE-2Z）氯通道的激活作用以及该电流的特性。方法：采用膜片钳技术记录顺铂激活的CNE-2Z细胞全细胞电流;离子置换法等方法分析通道的特性。结果：细胞外灌流5 μmol/L的顺铂诱发CNE-2Z细胞产生一个有明显外向优势的电流,电流的翻转电位为(-6.69 ± 0.51) mV,接近氯离子平衡电位(-0.9 mV)。该电流的激活依赖于细胞内ATP。顺铂激活的细胞膜氯通道对阴离子的通透性顺序为：I-≥Br->Cl->gluconate。氯通道阻断剂tamoxifen完全抑制该电流。结论：抗癌药顺铂可以激活一个电流特征与容积激活性氯通道相似的氯通道。     

人急性淋巴细胞白血病细胞容积激活性氯电流的研究

目的: 研究人急性淋巴细胞白血病细胞系(Molt4细胞)容积激活性氯电流。方法: 采用膜片钳全细胞方式记录细胞外低渗液(160 mOsmol/L)激活的Molt4细胞容积激活性氯电流,分析该电流的特性。结果: Molt4细胞在等渗溶液中背景电流较小且稳定,低渗溶液诱导激活容积激活性氯电流,该电流呈现较明显的外向优势,在钳制电压0 mV~±120 mV及脉冲波宽200 ms条件下,没有观察到明显的电压依赖性失活和时间依赖性失活。该电流具有容积敏感性,可被细胞外高渗刺激所抑制。氯通道阻断剂他莫昔芬显著抑制容积激活性氯电流, 对内向电流和外向电流的抑制作用无显著差异。结论: Molt4细胞膜存在容积敏感性氯通道;低渗刺激可激活该通道产生容积激活性氯电流;该通道对氯通道阻断剂他莫昔芬敏感。     

乙醇激活的鼻咽癌细胞氯电流的分子机制

 目的：研究乙醇对低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞氯通道的影响并探讨其分子机制。方法：MTT检测乙醇对细胞生长的影响;全细胞膜片钳技术记录乙醇对氯电流的影响;应用氯通道阻断剂分析该电流的特性;siRNA干扰技术分析乙醇敏感氯通道的分子本质。结果：在等渗灌流液中记录到微弱的背景氯电流,随灌流液中乙醇浓度（0.17~170 mmol/L）的升高,所激活的氯电流呈倒U型曲线状,17 mmol/L的乙醇激活电流达到峰值,电流呈较明显的外向优势,能被高渗液及氯通道阻断剂5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoic acid（NPPB）所阻断;干扰ClC-3氯通道基因表达后乙醇激活的氯电流明显减小。结论：乙醇可能通过激活CNE-2Z细胞的ClC-3氯通道,诱导氯电流的产生。     

细胞外低渗诱导大鼠胚胎心肌细胞H9c2容积激活性氯电流和调节性细胞容积回缩

目的:研究细胞外低渗诱导的大鼠胚胎心肌细胞(H9c2)容积激活性氯电流和调节性容积回缩(regulatory volumede crease,RVD)。方法:采用全细胞膜片钳技术记录低渗激活的H9c2细胞氯电流并分析电流特性;用实时活细胞影像系统拍摄细胞图像,测量细胞容积,探讨氯通道在H9c2细胞调节性容积回缩(RVD)过程中的作用。结果:等渗灌流下,可在H9c2细胞记录到一个较小的背景电流。47%低渗液灌流可迅速诱发一个具有外向优势的电流,该电流无明显时间依赖性失活和电压依赖性失活;在+80mV和-80mV电压钳制下,细胞的平均电流密度分别为(47.77±3.80)pA/pF和(-33.36±2.80)pA/pF;翻转电位为(-9.02±0.61)mV,接近氯离子的平衡电位(-0.9mV)。高渗灌流液可以完全抑制该电流。此外,该电流可被氯通道阻断剂他莫昔芬、5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸(NPPB)和ATP不同程度抑制。同时,细胞外灌流47%低渗液可诱发H9c2细胞产生RVD,100μmol/L的NPPB几乎完全抑制低渗诱发的RVD。结论:细胞外低渗刺激可以诱导H9c2细胞容积激活性氯电流和RVD。容积激活性氯通道在H9c2细胞RVD中起重要作用。     

氯通道在华蟾酥毒基诱导的鼻咽癌细胞凋亡中起重要作用

目的: 研究氯离子通道在华蟾酥毒基(CBG)诱导低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡和凋亡性容积减小中的作用。方法: 实验设立空白对照组、CBG高、中、低剂量组及CBG与氯通道阻断剂NPPB 联合作用组。Hoechst 33342染色检测细胞的凋亡率,活细胞图像分析法检测细胞容积变化,全细胞膜片钳法记录氯电流。结果: (1)CBG浓度依赖性诱导鼻咽癌细胞凋亡,高剂量CBG(8 μmol/L)诱导的细胞凋亡率为43.2％;(2)CBG可诱导细胞产生凋亡性容积减小,在CBG作用早期(50 min),细胞容积减小约9.9％。(3)CBG可激活氯通道,产生一个无明显外向优势的氯电流。(4)氯通道阻断剂NPPB可抑制CBG诱导的细胞凋亡、凋亡性细胞容积减小和氯电流。NPPB对CBG诱导的细胞凋亡和凋亡性容积减小的抑制率分别达80.1％和74.8％。结论: 以上结果提示CBG可能通过激活氯通道而诱导细胞凋亡,氯通道的激活可能在CBG抗肿瘤机制中起重要作用。     

顺铂激活的低分化鼻咽癌细胞氯电流为非钙激活氯电流*

 目的：探讨顺铂激活的低分化鼻咽癌细胞（CNE-2Z）氯通道电流是否为钙激活的氯电流。方法：采用膜片钳全细胞记录技术记录细胞内/外无Ca2+及钙通道阻断剂对顺铂激活氯电流的影响,并用高渗灌流液观察顺铂激活氯电流的容积敏感性。结果：去除细胞外液的Ca2+后,5 μmol/L顺铂能诱发氯电流,且电流大小与细胞外有Ca2+ 时无明显差异,但潜伏期与达峰时间延长。细胞内外均无Ca2+ 对顺铂激活氯电流未产生影响。钙通道阻断剂nifedipine未能抑制顺铂诱发的氯电流。但细胞外灌流高渗液几乎可完全抑制顺铂激活的氯电流。结论: 顺铂激活的氯通道开放不依赖于细胞内/外的Ca2+,该通道不是钙激活氯通道而很可能是容积敏感性氯通道。     

Otx1诱导外向钾电流并抑制小鼠神经母细胞瘤细胞增殖

目的:探讨Otx1(orthodenticle homeobox 1)蛋白在调节电压门控性钾通道中的作用,并分析其对体DNA,应用全细胞膜片钳记录N2a细胞中K+依赖的外向电流;通过电生理技术,分析Otx1对K+电流激活、失活和失活后恢复时间等参数的影响;通过细胞转染Otx1突变体,研究其对细胞增殖的影响。结果:过表达Otx1可增强电压依赖性外向K+电流,降低半失活电位,并延迟外向电流失活后恢复;星形胶质细胞瘤相关的Otx1突变体K321T和表达Kv4.2α也导致外向K+电流增强,并抑制N2a细胞的增殖。结论:Otx1可在体外培养的小鼠神经细胞中诱导电压依赖性K+电流,而K+电流可能参与细胞的增殖过程。     

ClC-3氯通道在二甲双胍抑制鼻咽癌细胞周期进程中的作用

目的:探讨ClC-3氯通道在二甲双胍抑制鼻咽癌细胞周期进程中的作用。方法:采用不同浓度二甲双胍处理低分化鼻咽癌细胞CNE-2Z,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期分布,Western blot法检测ClC-3氯通道蛋白表达,全细胞膜片钳技术检测细胞氯电流。构建高表达ClC-3氯通道蛋白的质粒pEZ-M03-ClC-3转染CNE-2Z细胞,流式细胞术检测ClC-3氯通道对细胞周期分布的影响。结果:5、10和20 mmol/L浓度的二甲双胍均可有效抑制CNE-2Z细胞的活力。10 mmol/L二甲双胍可阻抑CNE-2Z细胞周期于G₀/G₁期,并抑制CNE-2Z细胞氯电流及ClC-3氯离子通道蛋白的表达。ClC-3氯通道蛋白高表达可逆转二甲双胍对CNE-2Z细胞周期分布的影响。结论:二甲双胍抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞周期进程可能与抑制ClC-3氯通道功能和蛋白表达有关。     

敲低IK1钾通道抑制ClC-3氯通道的表达和功能

 目的: 探讨ClC-3氯通道是否为IK1钾通道的调节靶点,重点研究鼻咽癌细胞IK1钾通道对ClC-3氯通道功能及蛋白表达的影响。方法: 采用siRNA转染技术抑制低分化鼻咽癌上皮细胞(CNE-2Z) IK1 基因的表达;real-time PCR技术检测ClC-3 mRNA的表达;Western blot检测ClC-3的蛋白表达;细胞免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术检测ClC-3和IK1蛋白在细胞内分布;全细胞膜片钳记录细胞氯电流。结果: IK1 siRNA可以成功转染CNE-2Z细胞,有效抑制鼻咽癌细胞IK1钾离子通道的表达;用IK1 siRNA抑制鼻咽癌细胞IK1钾离子通道的表达后, ClC-3的mRNA表达上调而ClC-3蛋白却表达减少:在低分化鼻咽癌上皮细胞,低渗刺激可激活氯通道,产生一个较大的氯电流,在成功转染IK1 siRNA的细胞,此氯电流明显减弱。结论: 敲低IK1钾离子通道可抑制ClC-3氯离子通道的表达和功能。     

他莫昔芬对不同生长周期鼻咽癌细胞容积激活性电流的作用

 目的：研究Cl-通道抑制剂他莫昔芬（tamoxifen）对G₁期和S期鼻咽癌细胞容积激活性电流的抑制效应。方法：运用血清饥饿法或化学药物双阻断法分别将鼻咽癌低分化上皮细胞（CNE-2Z）同步化至G₁或S期，用膜片钳技术研究不同细胞周期细胞容积激活性氯通道对阴离子的通透性及他莫昔芬对CNE-2Z细胞容积激活性电流的作用。结果：47%低渗刺激下，G₁期和S期细胞产生容积激活性电流，G₁期的电流密度大于S期。10-30 μmol/L他莫昔芬能完全抑制G₁期和S期容积激活性电流，但随浓度升高，达到完全抑制效应所需要的时间缩短。G₁期或S期细胞电流被完全抑制的时间有明显差异，在相同浓度他莫昔芬作用下，G₁期细胞达到最大抑制效应时间明显短于S期细胞。 G₁期与S期细胞容积激活性氯通道对阴离子的通透性均为I->Cl->葡萄糖酸根离子，但G₁期细胞对I-的通透性高于S期，S期细胞对葡萄糖酸的通透性高于G₁期。结论：CNE-2Z细胞G₁期与S期的容积激活性电流密度及对阴离子的通透性有差异， G₁期和S期细胞对他莫昔芬敏感性不同，提示CNE-2Z细胞对他莫昔芬敏感的容积激活性氯通道在不同生长周期中表达有差异。     

Volume-activated Cl− currents in different mammalian non-excitable cell types

The existence and properties of volume-activated Cl^– currents were studied in 15 different cell types (endothelium: human umbilical vein, human aorta, bovine pulmonary artery; fibroblasts: Swiss 3T3, L, C3H 10T1/2 and COS-1; epithelium: KB3, HeLa and A6; blood cells: RBL-2H3 and Jurkat; endothelioma cells derived from both subcutaneous and thymic hemangiomas; skin: IGR1 melanoma). Volume-activated Cl^– currents with common characteristics, i.e. small conductance, outward rectification, higher permeability for iodide than for chloride and sensitivity to block by 5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoic acid (NPPB) could be elicited in all cells. The block of this current by tamoxifen and dideoxyforskolin is different for the various cell types, as well as the time course and the amplitude of the responses induced by repetitive applications of hypotonicity. Volume-activated Cl^– channels with similar biophysical properties are therefore widespread among mammalian cells. This may reflect either a single Cl^– channel that is ubiquitously expressed or a family of functionally related Cl^– channels with cell specific expression patterns.     

抑制氯通道阻抑鼻咽癌细胞周期和细胞增殖

目的:研究Cl^-通道在鼻咽癌细胞调节性容积回缩(RVD)、增殖及细胞周期分布中的作用。方法:活细胞图像分析低分化鼻咽癌细胞(CNE－2Z)RVD,用台盼蓝拒染法检测细胞存活率,MTT法检测细胞增殖能力。用流式细胞仪测定细胞周期不同时相细胞百分率。结果:Cl^-通道抑制剂硝基苯丙胺基苯甲酸(NPPB)剂量依赖性抑制RVD和细胞增殖,100μmol/LNPPB明显阻抑细胞周期进程,使细胞停滞于G₁期,G₁期细胞百分率从54%提高到71%,但对细胞存活率没有显著性影响。结论:阻抑Cl^-通道可阻滞细胞于G₁期而抑制细胞增殖。提示Cl^-通道和RVD的激活是促进细胞从G₁期进入S期和维持增殖所必需的因素。     

氯通道在不同生长周期的鼻咽癌细胞迁移中的作用

目的：研究不同生长周期的鼻咽癌低分化上皮细胞（CNE-2Z）的迁移能力及氯通道在迁移过程中所起的作用。 方法： 运用血清饥饿法、化学药物双阻断法、有丝分裂药物阻断及摇落法分别将CNE-2Z细胞同步化至细胞周期的G1、S、M期，流式细胞仪检测其同步化效果。结合应用迁移小室和图像分析法，测定迁移率。台盼蓝活细胞染色法测定药物的细胞毒性。 结果： 不同生长周期的细胞迁移能力不同，G1期细胞迁移能力最强，随后是M期， S期迁移能力最弱。氯通道阻断剂（ATP、NPPB、tamoxifen）抑制CNE-2Z细胞迁移，但不同的氯通道阻断剂对不同生长周期CNE-2Z细胞迁移的阻滞效应不相同。 结论： CNE-2Z细胞的迁移能力与其所在的生长周期密切相关，氯通道在各期CNE-2Z细胞的迁移过程中起着重要作用。