人蜕膜细胞体外培养体系的建立

目的改良人蜕膜细胞(decidual cell)的培养方法,并对其进行特征鉴定,探讨蜕膜细胞的部分生物学特性。方法取人工流产6～8周妊娠蜕膜组织,机械法分离,复合酶消化,传代自然增殖法纯化细胞。倒置显微镜观察其大体形态及体外转化,组织学鉴定、HE染色观察其胞核情况,人催乳素(HPL)免疫组化法鉴定。流式细胞仪测定其细胞周期。结果分离培养的蜕膜细胞呈长梭形和不规则星形,95%细胞胞浆阳性表达。细胞周期显示约有59.8%的细胞处于G0/G1期。结论成功分离培养了人蜕膜细胞,方法经济、简单、获得细胞形态一致、成活率高、生长稳定,为进一步研究蜕膜细胞妊娠病理、生理改变提供了可靠的实验对象。     

人早孕蜕膜组织淋巴细胞的免疫组化研究

从免疫角度观察,妊娠是一种特殊的同种移植。人体最基本的免疫功能在于识别和排斥“非已”物质。妊娠发生时,带有父亲遗传物质的胚胎实际是同种移植物。而这种同种移植体不但不被排斥反而能在母体内顺得成长,原因何在?探索这一问题不仅具有重要的理论价值,而且对避孕,不孕,习惯性流产都有一定实际意义。本研究是用淋巴细胞的单克隆抗体,用免疫组化法进行染色,观察早孕蜕膜组织淋巴细胞的分布及抗原表达,从淋巴细胞免疫的角度,研究妊娠后,蜕膜局部免疫机能的变化,探索维持正常妊娠的免疫机理。     

20例人早孕绒毛滋养细胞的体外培养

目的建立快速、有效的绒毛滋养细胞体外培养的方法。方法采用0．25％胰酶和Ⅱ型胶原酶混合消化法消化绒毛组织,用胰蛋白酶消化传代体外培养,通过光镜对培养出的细胞进行形态评价;用细胞角蛋白和波形蛋白单克隆抗体检测细胞纯度。结果联合消化法的细胞生长迅速,接种6～8d可以传代,原代细胞生长时间明显缩短,所得细胞纯度达95％。结论联合消化法是一种较有效的人早孕绒毛滋养细胞培养方法。     

人胃癌原代细胞的甲硫氨酸依赖性研究

目的：探讨人胃癌和胃粘膜上皮原代细胞在体外不含甲硫氨酸（Met)而含同型半胱氨酸（Hcy)培养基（Met^-Hcy^ ）中能否正常生长及是否存在Met依赖性。方法：将将鲜人胃癌及胃粘膜组织制成单细胞悬液，分别置于Met^-Hcy^＋和Met^ Hcy^－培养基中培养，利用细胞计数和流式细胞分选仪检测各组细胞增殖状态。结果：人胃癌原代细胞在Met-Hcy^ 培养基中生长受抑，表现为细胞总数减少，G0，G1期细胞比例下降，S期细胞比例升高，胃粘膜细胞在Met-Hcy^ 培养基中生长正常，细胞总数及细胞周期比例未受影响。结论：人胃癌原代细胞在体外培养中表现出Met依赖性，而胃粘膜细胞则未见类似现象。     

两种人早孕绒毛滋养层细胞的原代培养方法

目的:比较两种不同方法进行人早孕绒毛滋养层细胞原代培养的异同。方法:分别用组织块培养法和3种酶联合消化法(Ⅳ型胶原酶、低浓度胰酶及DNaseⅠ)、Ficoll 400梯度密度离心法对人早孕绒毛滋养层细胞培养。结果:两种方法进行早孕滋养层细胞的培养均获得成功,其生长率比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论:组织块培养法简单易行,但细胞数量少,生长缓慢,难以完成后续实验;3酶联合消化、Ficoll 400梯度密度离心法相比较而言,可获得数量更多的活力好、纯度较高的具有不同分化功能的滋养层细胞,为进一步研究其侵袭、增殖能力等生理、病理作用提供了坚实的基础。     

锌对人胚大脑皮质神经细胞原代培养细胞生长的影响

选择１４～１８周人工流产胎儿大脑神经细胞进行原代培养,观察活细胞的变化,并用神经特异烯醇化酶免疫组化染色和图象分析方法对脑神经细胞生长发育进行观察。结果：（１）神经细胞在１０～１４天时最为丰满。在实验的１～２８天锌实验组神经细胞存活数显著高于对照组（ Ｐ＜ ００１）。（２）在实验的５、７、１０、１４、２１天锌实验组神经细胞的突起数目和长度、胞体面积、周长和长短径均显著大于对照组。说明锌具有促进神经细胞生长发育作用。     

人子宫内膜细胞原代培养与间质细胞MTS比较

目的探究原代人子宫在位内膜细胞分离及培养的简易方法,比较分离培养单一间质细胞和混合培养间质细胞之间的差异。方法采用单纯胰蛋白酶,分段消化人子宫内膜组织,经过两次筛网过滤、离心纯化技术,分离、纯化人子宫内膜间质细胞(ESC)和腺上皮细胞(EEC),采用免疫荧光方法对细胞进行鉴定,采用Cell Titer96~ Aqueous One Solution Reagent(MTS)方法监测细胞之间增长速度。结果间质细胞多呈梭形或多角形,纯度可达97%以上。腺上皮细胞多似蝌蚪形或多角形,纯度可达93%以上。混合培养细胞比单一培养细胞增殖能力强。结论采用单纯胰蛋白酶分段消化法和二次筛网过滤法可成功分离子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞,具有获得细胞成活率高、生长稳定的优点,混合培养间质细胞,保留细胞间整体性,可为进一步研究子宫内膜细胞提供一定的实验基础。     

微波辐射对原代培养睾丸支持细胞的影响

目的 探讨微波辐射是否对原代培养睾丸支持细胞具有损伤效应.方法 建立原代培养睾丸支持细胞模型,经平均功率密度为30、100 mW/cm2微波辐射5 min,于辐射后6 h采用Annexin和V-PO双标、Fluo-3-AM荧光标记结合流式细胞术(FCM)和激光共聚焦显微镜(LSCM)检测支持细胞细胞周期、细胞凋亡坏死及胞内Ca2+含量的变化. 结果 30 mW/cm2微波辐射后6 h G0-G1和G2-M期细胞数明显减少(分别为62.57%±3.22%、8.25%±1.75%),S期细胞数明显增加(29.17%±4.87%),与对照组(分别为79.18%±0.24%、11.17%±0.50%、9.64%±0.62%)比较,差异有统汁学意义(P<0.05或P<0.01),但细胞凋亡和坏死率及胞内Ca2+含量无明显改变;而100 mW/cm2微波辐射后6 h G0-G1期支持细胞数明显增加(87.69%±1.32%),G2-M和S期细胞数明显减少(分别为7.41%±0.60%、4.87%±0.91%),与对照组的差异有统计学意义(P<0.01);胞内Ca2+含量及细胞凋亡坏死率明显增加,差异亦有统计学意义(P<0.05或P<0.01). 结论 100 mW/cm2微波辐射可引起培养支持细胞生长抑制及凋亡与坏死增加,胞内Ca2+升高是其损伤的重要机制.     

滋养层细胞原代体外培养体系的建立

目的改善体外分离、培养人早孕绒毛细胞滋养层细胞(cytotrophoblastCTB)的方法,并对其进行鉴定,探讨CTB的一些生物学特性。方法取人工流产6~8周妊娠绒毛,机械法分离,复合酶消化,差速贴壁法纯化细胞后继续培养。倒置显微镜观察其大体形态及体外转化,HE染色观察其胞核情况,免疫细胞化学观察细胞的细胞角蛋白18(cy-tokeratinCK18)、波形蛋白(vimentinVim)和人胎盘催乳素(humanplacentallactogenhPL)的表达。流式细胞仪测定其细胞周期。结果分离培养的CTB呈不规则多角形片状,单层铺展生长。所有的细胞都表达CK18,Vim只在部分细胞表达,hPL免疫反应阳性物质在胞浆表达。细胞周期显示约有58%的细胞处于G0/G1期。结论成功分离培养了人早孕绒毛CTB,方法简便易行,获得的细胞形态单一、生长稳定,为进一步研究CTB在妊娠生理和妊娠免疫耐受中的作用提供了实验基础。     

早孕绒毛外细胞滋养细胞的体外培养方法

目的:探讨改良人早孕绒毛外细胞滋养细胞原代分离培养方法。方法:建立改良的复合酶消化梯度离心法,分离培养绒毛外细胞滋养细胞,通过免疫细胞化学、Giemsa染色和细胞侵袭实验检测细胞纯度、数量及生物学活性(侵袭性),并与低浓度胰蛋白酶消化方法进行比较。结果:低浓度胰蛋白酶消化方法和改良的复合酶消化梯度离心法所得贴壁细胞量分别为(11.69±1.26)×104和(17.21±0.51)×104,两者比较有统计学差异(P<0.05);绒毛外细胞滋养细胞纯度分别为(63.20±7.12)%和(92.10±5.11)%,两者比较有统计学差异(P<0.05),穿膜细胞数分别为(36.10±3.28)和(66.20±5.17),两者比较有统计学差异(P<0.05),提示该实验室改良的复合酶消化梯度离心法所得细胞总量、绒毛外细胞滋养细胞纯度及数量均显著高于低浓度胰蛋白酶消化方法。结论:该实验室改良的复合酶消化梯度离心法获得绒毛外细胞滋养细胞纯度和数量显著提高。     

人正常早孕滋养细胞体外培养株的系统鉴定

目的 建立人早孕滋养细胞株（HPT-8）的系统鉴定方法。方法 通过光镜、扫描电镜、透射电镜、免疫组化和免疫荧光激光共聚焦的方法对体外培养出的HPT-8进行系统鉴定评价。结果 电镜下可见细胞表面微绒毛丰富；胞质丰富；内质网扩张明显，细胞间紧密的桥粒样结构连接；检测细胞胞浆中角蛋白18和波形蛋白均为阳性，细胞胞浆中角蛋白7为阳性，细胞膜上移动相关蛋白为阳性。表皮生长因子受体、滋养细胞趋化因子和胎盘碱性磷酸酶结果均阳性，而人绒毛促性腺激素和胎盘催乳素结果均为阴性。结论 通过多种方法对HPT-8进行形态、超微结构、蛋白骨架和功能指标的综合评价，可以较全面的确定体外传至72代的细胞株HPT-8为具有部分内分泌功能的滋养细胞株，为进一步开展实验研究建立细胞模型。     

猪视网膜色素上皮细胞的体外培养和鉴定

目的体外培养猪视网膜色素上皮（RPE）细胞,为眼底病研究提供细胞来源。方法胰酶消化分离猪RPE细胞后体外培养,免疫荧光法和透射电镜鉴定细胞来源。结果离体猪RPE细胞,随细胞传代次数增加,形状发生变化。免疫荧光法检测RPE细胞内特异的角蛋白,结果阳性。电镜显示RPE细胞典型结构。结论酶消化法可成功体外培养猪RPE细胞。     

成人成肌细胞的分离与体外培养

目的 建立一种优化的体外成人成肌细胞分离与原代培养方法.方法 首先用两步消化法对取自成人骨骼肌组织进行消化获取相对较纯的成肌细胞,通过差速贴壁法进行进一步的纯化,并对获取的成肌细胞进行细胞形态学观察、免疫组织化学、透射电镜鉴定及生长曲线的绘制与分析.结果 该方法可获取高纯度的成肌细胞,且在体外可快速稳定增殖.结论 该方法所获取的成肌细胞可为Duchenne肌营养不良的治疗、血友病、血栓闭塞性脉管炎(伯格氏病)、心肌梗死和慢性心衰的基因治疗的研究提供一种充足、可靠的实验靶细胞.     

巨细胞病毒感染对人早孕绒毛及蜕膜组织的内分泌影响

目的:探讨人巨细胞病毒(humancytomegalovirusHCMV) 感染对人早孕绒毛及蜕膜组织的内分泌影响。方法: 采用体外培养早孕绒毛及蜕膜组织技术, 给予HCMV感染建立体外HCMV感染早孕绒毛及蜕膜模型, 采用放射免疫法检测HCMV感染后早孕绒毛及蜕膜组织培养上清液中hCG和PRL的水平。结果: ①正常早孕绒毛培养液中hCG分泌峰值在培养后第7天。给予高浓度HCMV干预后, hCG水平显著下降(P<0 .01 ), 给予中浓度HCMV干预后, hCG水平明显下降(P<0. 05 ),给予低度HCMV干预后, hCG水平于培养的第1~3天有所下降, 与正常对照组无显著差别(P>0 .05)。②正常蜕膜培养液中PRL分泌峰值在培养后第5天达峰值, 给予高浓度HCMV干预后, PRL水平显著下降(P<0 .001), 给予中浓度HCMV干预后,PRL水平明显下降(P<0 .01), 给予低度HCMV干预后, PRL水平于培养的第1~5天明显下降(P<0. 05) 后渐恢复至正常水平。结论: HCMV感染可影响早孕绒毛及蜕膜组织的hCG和PRL的分泌, 导致不良妊娠结局。     

永生化人晶状体上皮细胞的体外培养

目的:建立永生化人晶状体上皮细胞(Human lens epithelial cell,HLEC)培养、冻存与复苏技术。方法:传代培养人晶状体上皮细胞系B-3,并进行细胞冻存与复苏,台盼蓝染色法判断细胞活力。结果:接种后的HLEC在短时间内即可贴壁及延伸,12～24 h后大部分细胞贴壁生长,具有上皮细胞的形态特点,约3～4 d细胞基本融合。冻存后复苏的HLEC活力超过90%,保持正常的细胞形态,并可长期传代培养。结论:成功建立永生化HLEC培养、冻存与复苏技术,为白内障相关研究提供理想的细胞材料。     

人皮肤成纤维细胞来源诱导性多潜能干细胞的建立和鉴定

目的建立和鉴定人皮肤成纤维细胞（HSF）来源的诱导性多潜能干细胞（iPS）。方法利用逆转录病毒将Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因导入原代HSF细胞,将其编程为iPS细胞。检测细胞内源、外源基因表达量,鉴定外源基因是否插入iPS细胞,分析细胞核型,细胞碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色,体内分化畸胎瘤,体外分化拟胚体实验,对建立的iPS细胞进行鉴定。结果（1）iPS细胞形态类似于胚胎干细胞（ES）。（2）iPS细胞内源多能基因（Nanog、Oct4、Rexl、Sox2）表达量增高,外源编程基因（Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc）表达量降低。（3）琼脂糖凝胶电泳实验证实外源基因插入iPS细胞核内。（4）iPS细胞核型正常,碱性磷酸酶活性增高,表达ES细胞特异性蛋白。（5）iPS细胞在体内能分化为畸胎瘤,在体外能分化为拟胚体。结论新建立的iPS细胞类似于ES细胞具有多向分化潜能。     

胎盘Hofbauer细胞的体外培养和鉴定

目的 通过对早孕胎盘绒毛膜Hofbauer细胞的分离,纯化和培养,寻找一种稳定、简便的,可获得较高纯度Hofbauer细胞的培养方法,以满足后续实验要求.方法 通过胰酶/胶原酶联合消化法对妊娠6～10周绒毛组织进行消化,获得单细胞悬液,根据不同细胞贴壁时间的差异,对Hofbauer细胞进行纯化,并通过免疫组织化学法对Hofbauer细胞进行鉴定.结果 获得了较高纯度的胎盘Hofbauer细胞,免疫组化法鉴定CD68阳性,细胞生长状态良好.结论 利用胰酶/胶原酶联合消化法及差异贴壁法可以获得满意的人胎盘Hofbauer细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外生长增殖特点的实验研究

目的 了解应用全骨髓贴壁法分离的大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长、增殖特点,以及接种密度、培养时间对细胞增殖的影响,为预防和治疗机体退行性疾病等提供多潜能的种子细胞.方法 通过全骨髓贴壁法分离SD大鼠BMSCs,在体外条件下培养,应用倒置显微镜观察细胞形态学特征及流式细胞仪鉴定、检测大鼠BMSCs表面标志抗原,并通过分析对接种于96孔板不同接种密度(2×103、5×103、1×104个细胞/ml)连续培养10 d细胞生长曲线的特点,研究接种密度和培养时间对BMSCs生长、增殖的影响.结果 流式细胞仪分析CD29细胞阳性率为97.68%(7607/7788),CD34、CD45细胞阳性率分别为7.93%(661/8340)、2.76%(215/7788),符合BMSCs表面标记物表达特征.通过换液及消化传代,3代以上的BMSCs较为均一纯化,呈典型的旋涡或放射状生长,约传代至7～10代时出现细胞衰老并衰老细胞逐渐增多;中等密度(5×103个细胞/ml)接种细胞的生长曲线呈较典型的S形曲线.第1、2天为潜伏期;第3～5天为对数生长期;第6天细胞数目进入平台期;第8～10天细胞数量稍有下降.结论 全骨髓贴壁法是获得BMSCs较为简便有效的方法,且中等量接种密度更有利于细胞增殖,可获得更多的种子细胞.     

大鼠内皮祖细胞的培养及鉴定

目的 探索大鼠内皮祖细胞的分离培养,为缺血性疾病细胞移植治疗提供实验方法.方法 采集大鼠骨髓,梯度密度离心法分离单核细胞,内皮细胞培养液M199培养基培养(含20%FCS+15 ng/ml VEGF),种植于提前包埋了纤维连接蛋白的六孔板培养,应用免疫荧光和流式细胞技术鉴定内皮细胞系列标志:CD34、CD31、Flk-1和祖细胞标志CD133.并通过检测其对FITC标记的UED-1的吸附和内吞DiI-acLDL来进行细胞功能学的鉴定.结果 经过梯度密度离心和贴壁法选择的细胞表达内皮细胞特异性抗原CD34、CD31、Flk-1,部分表达CD133.大鼠骨髓单个核细胞经体外诱导分化,培养第5～14天的贴壁细胞不同程度的表达CD34、CD133、Flk-1和CD31.培养第9天流式细胞仪检测其阳性率分别为(40.12±6.28)%、(15.62±4.31)%、(44.05±8.20)%和(76.1±7.20)%,细胞能特异性吸附FITC标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL,并且在Matrigel上可以形成毛细血管样.结论 大鼠骨髓可以分离培养内皮祖细胞并能体外扩增,为内皮祖细胞的移植研究奠定了基础.