Oridonin对急性肝衰竭小鼠肝细胞凋亡的影响及其机制研究

目的探讨冬凌草甲素(oridonin)对脂多糖/D-氨基半乳糖氨(LPS/D-Gal)联合诱导的急性肝衰竭(ALF)小鼠肝细胞凋亡的影响,并探讨其可能的机制。方法取25只小鼠,随机分成5组,每组5只。采用LPS/D-Gal腹腔注射建立小鼠ALF模型,设生理盐水对照组、LPS/D-Gal诱导模型组、LPS/D-Gal诱导和不同剂量oridonin干预组及oridonin处理组。采用末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测肝细胞凋亡,采用real-time PCR法检测肝组织TNF-αm RNA水平,采用Western blot法检测凋亡相关蛋白的变化。结果模型组小鼠肝细胞凋亡率为(36.4±1.8)%,显著高于两个oridonin干预组的[(19.4±3.3)%和(11.4±0.3)%,P0.01];模型组小鼠肝组织TNF-αm RNA水平显著高于正常对照组(P0.01),而两个oridonin干预组肝组织TNF-αm RNA水平显著低于模型组(P0.01);模型组小鼠线粒体凋亡通路相关的促凋亡蛋白c-Jun氨基末端激酶(JNK)、bax、细胞色素C、cleaved caspase9/3活化水平显著高于两个oridonin干预组(P0.01),模型组小鼠抗凋亡蛋白bcl-xl水平显著低于两个oridonin干预组(P0.01),模型组小鼠死亡受体凋亡通路相关的促凋亡蛋白caspase8活化水平与两个oridonin干预组并无明显差异(P0.01)。结论 Oridonin可抑制LPS/D-Gal诱导的ALF小鼠肝细胞凋亡,其机制可能与下调促凋亡细胞因子TNF-α水平和抑制JNK介导的线粒体凋亡信号通路有关。     

Orionin对急性肝衰竭小鼠的保护作用及其对肝组织细胞因子水平的影响

目的探讨冬凌草甲素(Oridonin)对脂多糖/D-氨基半乳糖氨(LPS/D-Gal)联合诱导的急性肝衰竭(ALF)小鼠的保护作用及其对肝组织细胞因子水平的影响。方法取150只小鼠,随机分成5组,每组30只。采用LPS/D-Gal腹腔注射建立小鼠ALF模型,设生理盐水对照组、Oridonin对照组、LPS/D-Gal诱导模型组和LPS/D-Gal处理及不同剂量Oridonin干预组。采用Real-time PCR法检测肝组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1α、IL-1β和IL-6 m RNA水平。结果模型组小鼠48 h存活率为0.0%(0/30),而两个Oridonin干预组小鼠48 h存活率分别提高至64.5%(19/30)和80.6%(24/30,P0.01);组织病理学检查显示模型组小鼠肝细胞呈大块或/和亚大块坏死,肝小叶结构消失,残存肝细胞肿胀、空泡变性,肝窦肿胀充血,炎细胞浸润。Oridonin干预组小鼠肝细胞坏死、空泡变性和炎细胞浸润等较模型组有明显的改善;模型组小鼠血清ALT和AST水平分别为(345.3±54.1)U/L和(500.2±53.5)U/L,明显高于对照组的[(42.3±0.6)U/L和(117.1±9.8)U/L,P0.01],两个Oridonin干预组分别为(303.9±39.5)U/L和(340.6±2.8)U/L及[(130.2±38.3)U/L和(209.8±36.2)U/L,P0.05];模型组小鼠肝组织TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-6 m RNA水平显著高于正常对照组(P0.01),而两个Oridonin干预组肝组织TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-6 m RNA水平显著低于模型组(P0.01)。结论 Oridonin对LPS/D-Gal诱导的ALF小鼠具有显著的保护作用,其作用机制可能与降低肝组织细胞因子水平有关。     

清肠利肝方对D-氨基半乳糖/脂多糖所致急性肝衰竭小鼠的防护作用

目的:探讨中药组方清肠利肝方对D-氨基半乳糖/脂多糖(D-Gal N/LPS)所致急性肝衰竭小鼠的防护作用并探究其相关机制。方法:将野生型健康C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组、急性肝衰竭模型组(简称模型组)和清肠利肝方干预组(简称干预组)。模型组和干预组小鼠腹腔注射D-Gal N(700 mg/kg)LPS(10μg/kg)诱导肝衰竭;干预组小鼠注射D-Gal N/LPS前3天以清肠利肝方灌胃,1次/d。D-Gal/LPS给药6小时后收集小鼠肝脏组织和血清。观察各组小鼠肝脏损伤变化及相关炎症分子的变化情况。结果:模型组小鼠肝脏损伤严重,大片肝组织充血坏死;干预组小鼠肝脏损伤较模型组减轻,促炎因子水平低于模型组,MAPK通路炎症相关蛋白表达降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论:清肠利肝方对D-Gal N/LPS所致小鼠急性肝衰竭有明显防护作用,其机制可能与调节MAPK通路而发挥抗炎作用有关。     

急性肝衰竭大鼠高迁移率族蛋白B1的变化和意义

目的:比较高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)与其他炎症因子在急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)大鼠肝组织和血清中出现时间及持续时间,探讨其来源及作用.方法:采用腹腔内注射D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-Gal)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)制备大鼠ALF模型,以腹腔内注射生理盐水作为对照组.于注射后3、6、12、24、48、72 h检测血清中肝功能的变化,观察肝组织病理,实时荧光定量PCR检测肝组织中HMGB1、白介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,T N F-α)m R N A变化,E L I S A法检测血清中HMGB1、IL-1β、IL-6、TNF-α水平变化,免疫组织化学检测肝组织中H M G B 1表达变化.使用重组高迁移率族蛋白B1(recombinant high mobility group protein 1,r HMGB1)单独尾静脉注射或联合D-G a l、L P S腹腔内注射,观察大鼠的一般情况并计算生存率.结果:采用D-Gal和LPS成功建立大鼠ALF模型.ALF大鼠肝组织中HMGB1 m RNA表达和血清中HMGB1水平高峰均较IL-1β、I L-6、T N F-α出现晚,但其高峰持续时间更长.D-Gal和LPS注射后的3 h,免疫组织化学可见肝细胞中HMGB1由细胞核转移到细胞质中;注射后24-48 h,肝脏正常组织结构消失,HMGB1蛋白自坏死的肝细胞被动释放.添加外源性r HMGB1使大鼠死亡时间提前,ALF大鼠在相同时间点死亡率升高.结论:大鼠ALF过程中HMGB1由坏死的肝细胞被动释放,其出现时间较其他炎症因子为晚.HMGB1与其他炎症因子相互作用,可能进一步促进ALF中的炎症反应.     

Oridonin对急性肝衰竭小鼠肝细胞凋亡的影响及其机制研究*

目的 探讨冬凌草甲素（oridonin）对脂多糖/D-氨基半乳糖氨（LPS/D-Gal）联合诱导的急性肝衰竭（ALF） 小鼠肝细胞凋亡的影响,并探讨其可能的机制。方法 取25只小鼠,随机分成5组,每组5只。采用LPS/D-Gal腹腔注射建立小鼠ALF模型,设生理盐水对照组、LPS/D-Gal诱导模型组、LPS/D-Gal诱导和不同剂量oridonin干预组及oridonin处理组。采用末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测肝细胞凋亡,采用real-time PCR法检测肝组织TNF-α mRNA水平,采用Western blot法检测凋亡相关蛋白的变化。结果 模型组小鼠肝细胞凋亡率为（36.4±1.8） %,显著高于两个oridonin干预组的[（19.4±3.3）%和（11.4±0.3）%,P<0.01];模型组小鼠肝组织TNF-α mRNA水平显著高于正常对照组（P<0.01）,而两个oridonin干预组肝组织TNF-α mRNA水平显著低于模型组（P<0.01）;模型组小鼠线粒体凋亡通路相关的促凋亡蛋白c-Jun氨基末端激酶（JNK）、bax、细胞色素C、cleaved caspase9/3活化水平显著高于两个oridonin干预组（P<0.01）,模型组小鼠抗凋亡蛋白bcl-xl水平显著低于两个oridonin干预组（P<0.01）,模型组小鼠死亡受体凋亡通路相关的促凋亡蛋白caspase8活化水平与两个oridonin干预组并无明显差异（P>0.01）。结论 Oridonin可抑制LPS/D-Gal诱导的ALF小鼠肝细胞凋亡,其机制可能与下调促凋亡细胞因子TNF-α水平和抑制JNK介导的线粒体凋亡信号通路有关。     

解耦联蛋白2在急性肝功能衰竭大鼠肝脏中的动态表达和意义

目的 探讨急性肝功能衰竭(ALF)大鼠肝脏线粒体解耦联蛋白(UCP)2的表达趋势及意义.方法 健康雄性SD大鼠36只,分为对照组和模型组,模型组冉分为6、12、24、36和48 h 5个亚组,每组6只.模型组腹腔内注射D-氨基半乳糖(D-Gal)和脂多糖(LPS)诱导大鼠ALF模型.采用HE染色,光学显微镜下观察肝组织损伤情况,采用RT-PCR和免疫组织化学检测不同时间点肝脏UCP2 mRNA转录及其蛋白表达,同时测定各时间点血清ALT、AST和肝组织丙二醛(MDA)的变化.各实验组问数值比较采用SNK检验.结果 模型组肝组织呈炎性细胞浸润和明显坏死的ALF特征;模型组ALT、AST、MDA值均明显高于对照组[(24.0±2.0)U/L,(82.3士16.9)U/L,(2.55±0.22)μmol/g],且造模24 h达高峰[(8346.7±1363.1)U/L,(9766.7±1274.1)U/L,(8.34±1.13)μmol/g;均P<0.05];UCP2蛋白和UCP2 mRNA在正常肝组织中几乎不表达,D-Gal和LPS处理后6 h表达均硅著增加(P<0.05),24 h表达最强,且模型组相邻时间点之间差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建大鼠ALF模型,大鼠ALF时UCP2蛋白和UCP2mRNA的表达水平与肝损伤程度及氧化应激水平有关.     

PPARα激活保护小鼠急性肝衰竭对CHOP的调节作用研究

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)激活对小鼠急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)肝损伤保护过程中对内质网应激凋亡蛋白标志物CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)信号分子的影响。方法以C57BL/6小鼠为研究对象,腹腔注射D-氨基半乳糖(D-GalN)联合脂多糖(LPS)建立小鼠ALF模型。PPARα激活剂Wy-14643及siRNA分别对ALF小鼠模型进行干预,检测小鼠肝脏病理改变、血清转氨酶ALT、AST评价肝脏功能,免疫印迹、实时荧光定量PCR及免疫荧光方法检测CHOP的基因及蛋白表达水平。结果 D-GalN/LPS诱导ALF小鼠中,肝损伤程度及转氨酶水平随着时间延长逐渐加重,PPARα水平下降,CHOP水平上升。Wy-14643干预降低肝组织CHOP的表达水平,PPARαsiRNA干预增加肝组织CHOP的表达水平。结论 ALF肝损伤过程中,PPARα可通过调节CHOP参与内质网应激诱导的肝细胞凋亡,PPARα-CHOP信号通路可能是ALF致病分子机制之一。     

Urotensin Ⅱ在急性肝衰竭小鼠肝组织中的表达及损伤作用

目的:探讨Urotensin Ⅱ(UⅡ)在急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)小鼠肝组织中的表达及损伤作用.方法:♂Balb/c小鼠随机分成4组(每组6只):正常对照组(A组)、预处理对照组(B组)、模型组(C组)和预处理模型组(D组).模型动物以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)/D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-GalN)腹腔注射,预处理动物在造模前30min,用UⅡ受体拮抗剂Urantide0.6mg/kg尾静脉注射.LPS/D-GalN攻击12h后,采集血清和肝组织标本,并观察24h小鼠存活情况;采用Reitman-Frankel法检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate amino-transferase,AST)活性水平;采用HE染色显微镜观察肝组织损伤程度;RT-PCR法检测UⅡ及其受体UTmRNA的表达;ELISA法检测血清UⅡ多肽分泌水平;免疫组织化学方法检测肝组织UⅡ多肽及其UT受体蛋白质表达.结果:C组小鼠死亡率为66.7%,A、B和D组所有动物均存活;LPS/D-GalN攻击引起C和D组小鼠血清ALT和AST水平显著升高(P<0.01),而D组较C组显著降低(2271.09U/L±102.24U/Lvs1160.67U/L±258.32U/L,1569.42U/L±204.04U/Lvs1030.31U/L±108.09U/L,P<0.01);C组小鼠肝组织结构破坏明显,见大片出血性坏死及炎症表现,D组肝组织结构保持完整,仅有局灶性出血坏死,炎症明显减轻;C和D组小鼠血清UⅡ多肽水平较A和B组高(P<0.01),但D组较C组明显降低(3.73g/L±0.52g/Lvs1.90g/L±0.27g/L,P<0.01);LPS/D-GalN诱导了C和D组小鼠肝组织UⅡ和UT的mRNA及蛋白质高水平表达,而D组的表达水平较C组显著降低(P<0.01).结论:LPS/D-GalN可诱导ALF小鼠肝组织表达和分泌UⅡ,并促进肝组织UT受体的表达;UⅡ的表达与分泌可能存在正反馈调控机制;UⅡ/UT受体介导了LPS/D-GalN诱导的ALF的发生.     

组蛋白乙酰化酶抑制剂(DCH36_06)对小鼠急性肝损伤的保护作用及机制研究

目的探讨P300/CBP组蛋白乙酰化酶抑制剂DCH36_06对LPS/D-Gal诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用及其机制。方法 75只C57BL/6小鼠随机分成4组,正常对照组20只、ALI模型组20只、药物干预组20只和药物对照组15只,分别予腹腔注射0.9%氯化钠溶液、LPS/D-Gal、LPS/D-Gal+DCH36_06和DCH36_06处理。前3组小鼠于LPS/D-Gal刺激4 h后每组各处死5只,采集小鼠血清和肝组织,检测肝功能指标并进行HE、TUNEL染色评估肝组织病理学变化和肝细胞凋亡。RT-PCR和ELISA检测肝组织中促炎细胞因子的表达水平。余小鼠继续饲养至24 h,以观察各组小鼠24 h生存率。结果急性肝损伤模型组15只小鼠24 h存活6只,DCH36_06药物干预组15只小鼠24 h存活13只。LPS/D-Gal诱导4 h后模型组肝组织中可见显著肝细胞变性坏死,炎症细胞浸润并见散在肝细胞凋亡,与模型组相比,干预组小鼠肝组织坏死性炎症及凋亡均明显减轻。干预组小鼠血清AST、ALT和TBil水平分别为(281.4±48.1)U/L、(175.2±32.5)U/L和(9.8±0.7)μmol/L,模型组小鼠分别为(1151.0±111.1)U/L、(921.5±47.9)U/L和(21.0±0.4)μmol/L差异有统计学意义(P0.05)。RT-PCR和ELISA检测结果显示,与模型组肝组织中促炎细胞因子TNFα、IL-1β和IL-6的mRNA(72.0±9.3、91.4±4.6、175.5±19.6)及蛋白表达量[(25.9±2.3)pg/mL、(816.5±60.8)pg/mL、(305.6±20.1)pg/mL]相比,干预组肝组织内促炎细胞因子TNFα、IL-1β和IL-6的mRNA(15.4±0.2、6.0±1.6、21.5±0.9)及蛋白表达量[(7.9±1.2)pg/mL、(211.4±22.4)pg/mL、(53.2±7.3)pg/mL]均显著下调(P0.05)。结论 DCH36_06对LPS/D-Gal诱导的小鼠急性肝损伤具有显著保护作用,其机制可能与下调肝内促炎细胞因子表达,减轻肝组织炎性损伤相关。     

齐墩果酸在小鼠酒精性肝纤维化中的作用机制

目的应用酒精灌胃方法制造小鼠肝纤维化模型,观察核转录因子相关因子(Nrf) 2表达并探索齐墩果酸抗纤维化可能的分子生物学机制。方法 30只昆明种小鼠随机分为3组,模型(B)组通过50%酒精灌胃建立小鼠酒精性肝纤维化动物模型,治疗(C)组预先给予齐墩果酸灌胃进行干预,正常(A)组生理盐水灌胃作为对照。应用免疫组化方法检测齐墩果酸对酒精性肝纤维化小鼠Nrf2的表达影响。检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)水平; HE及MT染色观察肝脏组织病理学改变(炎症、坏死及纤维化分级);免疫组化检测细胞外基质蛋白(FN)的表达。结果 12周末成功建立小鼠酒精性肝纤维化模型; B组肝组织Nrf2表达显著高于A组(P0. 05)。B组血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、AST、TBIL水平、肝细胞炎症及纤维化程度、FN表达情况均显著高于A组(P0. 01); C组肝组织Nrf2表达显著高于B组(P0. 05),而血清ALT、AST、TBIL水平、肝细胞炎症及纤维化程度、FN表达情况均显著低于B组(P0. 05)。结论齐墩果酸对酒精性肝损害有保护作用并延缓纤维化进展。其机制是通过增强Nrf2表达,诱导Nrf2依赖性保护基因,抑制肝星状细胞(HSC)活化,减少细胞外基质合成与蓄积有关。     

急性肝衰竭TNF-α、Caspase-3及TGF-β1 mRNA的表达及罗格列酮的干预

目的: 观察D-氨基半乳糖(D-Ga lN)联合脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肝衰竭TNF-α、Caspase-3、TGF-β1 mRNA的表达,并探讨罗格列酮的干预作用.方法: ♂昆明小鼠随机分为3组: 正常组、对照组、干预组.对照组和干预组以D-Ga lN/LPS腹腔注射构建小鼠急性肝衰竭模型,正常组则相应予以生理盐水腹腔注射;干预组于造模前2 h予以罗格列酮灌胃,正常组和对照组则相应予以生理盐水灌胃.比较各组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平,肝组织病变程度及肝组织TNF-α、Caspase-3,TGF-β1 mRNA的表达水平.结果: D-GalN联合LPS腹腔注射成功构建了小鼠急性肝衰竭模型,对照组肝组织中TNF-α、Caspase-3、TGF-β1 mRNA的表达较正常组明显增高( P＜0.001);干预组小鼠血清ALT,AST水平明显低于对照组(403.6±76.1 U/L vs 3664.8±646.1 U/L,464.6±63.0 U/L vs 3514.0±468.9 U/L,均P＜0.001),肝组织中TNF-α、Caspase-3、TGF-β1 mRNA表达水平明显低于对照组(0.270±0.042 vs 0.459±0.072,0.388±0.033 vs 0.553±0.033,0.261±0.031 vs 0.403±0.042,均P＜0.001);与对照组比较,干预组肝组织炎性细胞浸润明显减少,肝细胞以变性为主,未见明显坏死.结论: 罗格列酮可能通过下调T N F - α、Caspase-3、TGF-β1的表达对D-GalN/LPS小鼠急性肝衰竭起保护作用.     

Orionin对急性肝衰竭小鼠的保护作用及其对肝组织细胞因子水平的影响*

目的 探讨冬凌草甲素（Oridonin）对脂多糖/D-氨基半乳糖氨（LPS/D-Gal）联合诱导的急性肝衰竭（ALF）小鼠的保护作用及其对肝组织细胞因子水平的影响。方法 取150只小鼠,随机分成5组,每组 30 只。采用LPS/D-Gal腹腔注射建立小鼠ALF模型,设生理盐水对照组、Oridonin对照组、LPS/D-Gal诱导模型组和LPS/D-Gal处理及不同剂量Oridonin干预组。采用Real-time PCR法检测肝组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1α、IL-1β和IL-6 mRNA水平。结果 模型组小鼠48 h存活率为0.0% （0/30）,而两个Oridonin干预组小鼠48 h存活率分别提高至64.5% （19/30）和80.6% （24/30,P<0.01）; 组织病理学检查显示模型组小鼠肝细胞呈大块或/和亚大块坏死,肝小叶结构消失,残存肝细胞肿胀、空泡变性,肝窦肿胀充血,炎细胞浸润。Oridonin干预组小鼠肝细胞坏死、空泡变性和炎细胞浸润等较模型组有明显的改善;模型组小鼠血清ALT和AST水平分别为（345.3 ± 54.1） U/L和（500.2±53.5） U/L,明显高于对照组的[（42.3±0.6）U/L和（117.1±9.8）U/L,P<0.01],两个Oridonin干预组分别为 （303.9±39.5） U/L和（340.6±2.8） U/L及[（130.2±38.3） U/L和 （209.8±36.2） U/L,P<0.05];模型组小鼠肝组织TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-6 mRNA水平显著高于正常对照组（P<0.01）,而两个Oridonin干预组肝组织TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-6 mRNA水平显著低于模型组 （P<0.01）。结论 Oridonin对LPS/D-Gal诱导的ALF小鼠具有显著的保护作用,其作用机制可能与降低肝组织细胞因子水平有关。     

氧化应激介导糖原合成酶激酶-3促进D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导的急性肝衰竭肝损伤

目的探讨糖原合成酶激酶3(GSK3)在氧化应激促进D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导小鼠急性肝衰竭肝损伤中的作用。方法以C57BL/6小鼠为研究对象,腹腔注射D-氨基半乳糖(D-Gal N)联合脂多糖(LPS)建立小鼠急性肝衰竭模型。氧化应激抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)或GSK3特异性抑制剂SB216763分别对急性肝衰竭小鼠模型进行干预。检测小鼠血清转氨酶ALT、AST评价肝脏功能,检测肝脏组织中谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶活性(SOD)及丙二醛(MDA)水平评价氧化应激程度,免疫印迹方法检测肝脏组织p-GSK3、p-JNK蛋白表达。结果 D-Gal N/LPS诱导急性肝衰竭引起肝组织GSH和SOD水平降低,肝组织MDA水平上升。NAC干预改善急性肝衰竭损伤(血清ALT、AST水平明显下降),同时增加肝脏组织GSK3β的磷酸化水平(降低GSK3β的活性)。SB216763抑制GSK3β活性增加急性肝衰竭小鼠肝组织GSH和SOD含量,降低肝组织中MDA含量。GSK3β抑制下调肝脏中p-JNK的表达。结论 GSK3β是氧化应激促进急性肝衰竭损伤中的一种重要信号分子,抑制GSK3β活性,减轻氧化应激可以改善急性肝衰竭损伤。     

BET抑制剂(+)-JQ1通过调节NF-KB信号通路保护小鼠急性肝衰竭实验研究*

目的 探讨溴结构域和额外末端结构域(BET)抑制剂(+)-JQ1对脂多糖/D-氨基半乳糖(LPS/D-Gal)诱导的小鼠急性肝衰竭(ALF)的保护作用及其作用机制。方法 将47只C57BL/6小鼠随机分为对照组(n=15)、模型组(n=17)和(+)-JQ1干预组(n=15),采用腹腔注射LPS/D-Gal联合诱导ALF模型,其中在干预组造模前2 h腹腔注射(+)-JQ1。在造模4 h后每组处死5只小鼠,其余小鼠继续喂养至72 h,观察存活率。采用ELISA法检测血清TNF-α,采用RT-qPCR法和Western bloting法分别检测mRNA和蛋白表达。结果 模型组72 h小鼠存活率为16.7%(2/12),(+)-JQ1干预组为60.0%(6/10,P>0.05);ALF组血清ALT水平为(2779.0±200.6)U/L,显著高于对照组【(44.9±2.5) U/L,P＜0.05】,血清AST水平为(2885.0±143.6)U/L,显著高于对照组【76.0±5.7) U/L,P＜0.05】,而(+)-JQ1干预组血清ALT和AST水平较模型组显著降低 【分别为(948.7±46.3)U/L和(1704.0±42.1)U/L,P＜0.05】;ALF组肝组织TNF-αmRNA水平为(103.7±23.0),显著高于对照组【(1.2±0.2),P＜0.05】,IL-6 mRNA水平为(73.4±15.8) ,显著高于对照组【(1.1±0.1),P＜0.05】,IL-1B mRNA水平为(13.5±2.7) ,显著高于对照组【(1.0±0.1),P＜0.05】,而经(+)-JQ1干预后,三种细胞因子mRNA水平均较模型组显著降低【分别为(12.8±1.2)、 ( 11.7±0.7) 和 (1.5±0.3),P＜0.05】;ALF组血清TNF-α水平(631.6±57.5)U/L,显著高于对照组【(2.5±0.5)U/L,P＜0.05】,而(+)-JQ1干预组血清TNF-α水平为(139.8±8.1)U/L,显著低于ALF组(P＜0.05);ALF组肝组织P65和IKB蛋白表达显著增强,而(+)-JQ1干预后显著减弱。结论 (+)-JQ1对ALI小鼠肝脏具有保护作用,可能通过调节NF-KB信号通路下调促炎细胞因子的表达,从而减轻肝组织炎症反应。     

Caspase-12在D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导小鼠急性肝功能衰竭中的表达及作用

目的探讨Caspase-12在D-氨基半乳糖(D-Gal)/脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肝功能衰竭发生发展过程中表达水平的变化及Caspase-12介导的内质网应激肝细胞凋亡途径在急性肝功能衰竭中的作用。方法以D-Gal/LPS联合腹腔注射诱导小鼠急性肝功能衰竭建立实验模型,在不同时间点动态检测血清氨基转移酶水平和观察肝组织病理变化,评估肝细胞凋亡和肝坏死演变过程;应用琼脂糖凝胶电泳检测肝细胞DNA凋亡条带;用半定量逆转录聚合酶链反应检测肝组织中Caspase-12 mRNA表达水平;west- ern blot检测Caspase-12、Bip/GRP78蛋白表达。结果药物诱导5h时肝组织中典型凋亡细胞增多,血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)开始升高,Caspase-12 mRNA表达明显增加, Caspase-12蛋白量表达反而减少;7h镜下出现大量肝细胞凋亡和坏死,ALT、AST水平达高峰,分别为(2564±1384)U/L和(1198±497)U/L,正常对照组为(59±17)U/L和(135±12)U/L,Caspase- 12 mRNA表达仍增加,Caspase-12蛋白表达量继续降低;9h 肝细胞坏死明显,伴散在凋亡细胞,ALT、AST水平明显下降,Caspase-12 mRNA表达较7 h下降。Bip/GRP78蛋自表达从5 h开始,至7 h逐渐增加。结论D-Gal/LPS诱导小鼠急性肝功能衰竭早期Caspase-12 mRNA表达水平逐渐升高,后期(7-9 h)降低,与肝细胞凋亡发生的时相一致;Caspase-12蛋白酶因内质网应激而被大量活化,提示Caspase-12介导的内质网应激肝细胞凋亡参与炎症性急性肝功能衰竭的发生发展,是急性肝功能衰竭中肝细胞损伤的重要机制之一,提示早期干预Caspase-12表达及活化对急性肝功能衰竭可能具有保护作用。     

细胞自噬在D-氨基半乳糖/脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤模型中的保护作用及机制

目的利用D-氨基半乳糖(D-Gal N)/脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肝损伤模型研究细胞自噬在急性肝损伤中的作用及机制。方法以C57BL/6小鼠为研究对象,腹腔注射D-Gal N/LPS建立小鼠急性肝损伤模型。动物实验分组:对照组、DGal N/LPS组、雷帕霉素+D-Gal N/LPS组、三甲基腺嘌呤(3-MA)+D-Gal N/LPS组、Atg7 siRNA+D-Gal N/LPS组。观察不同分组中小鼠的生存情况,观察肝组织病理变化评价肝损伤情况,全自动生化分析仪检测血清ALT、AST水平,实时荧光定量PCR检测肝组织中TNFα和IL-6基因表达,荧光显微镜观察肝组织中肝细胞凋亡情况。多样本组间比较采用One-way ANOVA分析,进一步两两比较,方差齐时采用LSD-t检验,方差不齐时采用Games-Howell法。结果与D-Gal N/LPS组相比,应用自噬激活剂雷帕霉素干预后,小鼠生存率明显升高(80%vs 40%),肝脏出血、炎症和坏死明显减轻,肝细胞凋亡明显减少,血清ALT、AST水平明显降低[ALT:(427.4±195.5)U/L vs(977.7±247.3)U/L,P=0.002;AST:(378.2±169.7)U/L vs(1100.0±438.0)U/L,P=0.004],肝组织中炎症因子TNFα和IL-6 mRNA表达水平明显降低[TNFαmRNA:0.288±0.010 vs 1.136±0.267,P=0.003;IL-6mRNA:0.272±0.061 vs 0.869±0.317,P=0.010];应用自噬抑制剂3-MA和Atg7 siRNA干预后,小鼠生存率明显降低(0、10%vs 40%),肝脏出血、炎症和坏死明显加重,肝细胞凋亡明显增多,血清ALT、AST水平明显升高[ALT:(1836.0±560.5)、(1654.0±627.6)U/L vs(977.7±247.3)U/L,P值分别为0.006、0.034;AST:(1948.0±645.5)、(1804.0±492.6)U/L vs(1100.0±438.0)U/L,P值分别为0.029、0.033],肝组织中TNFα表达水平明显升高[2.026±0.342、1.994±0.286 vs 1.136±0.267,P值分别为0.006、0.005]。结论在D-Gal N/LPS诱导的小鼠急性肝损伤中,细胞自噬发挥着重要的保护性作用,其调控机制可能与自噬抑制炎症因子和肝细胞凋亡有关。     

垂盆草水煎液对不同小鼠急性肝损伤模型的疗效作用

目的复制四氯化碳(CCl4)、D-氨基半乳糖胺联合内毒素(D-Gal N/LPS)、D-氨基半乳糖胺联合肿瘤坏死因子-α(D-Gal N/TNF-α)及刀豆蛋白A(Con A)诱导小鼠急性肝损伤模型,筛选针对垂盆草(Sedum Sarmentosum,SS)水煎液有效的急性肝损伤小鼠模型。方法采用152只雄性6~8周龄C57BL/6小鼠,其中80只小鼠随机分为CCl4+H2O组、CCl4+SS组、D-Gal N/LPS+H2O组、D-Gal N/LPS+SS组、D-Gal N/TNF-α+H2O组、D-Gal N/TNF-α+SS组、Con A+H2O组及Con A+SS组共8组,每组10只,观察各组生存率。其余72只小鼠随机分为Normal组、CCl4+H2O肝功能组、CCl4+SS肝功能组、D-Gal N/LPS+H2O肝功能组、D-Gal N/LPS+SS肝功能组、D-Gal N/TNF-α+H2O肝功能组、D-Gal N/TNF-α+SS肝功能组、Con A+H2O肝功能组及Con A+SS肝功能组共9组,每组8只,检测血浆ALT、AST和乳酸脱氢酶(LDH)水平。结果垂盆草水煎液将CCl4小鼠急性肝损伤模型的生存率由55%提高到90%(P=0.0128)。造模24小时后,CCl4+SS组ALT为(5500.00±426.20)U/L,AST为(4383.00±358.00)U/L,LDH为(6764.00±691.30)U/L,分别低于CCl4+H2O组ALT[(10521.00±1374.00)U/L]、AST[(7328.00±947.80)U/L]、LDH[(13589.00±1542.00)U/L],差异均有统计学意义(P均0.05)。结论垂盆草水煎液对CCl4诱导小鼠急性肝损伤模型有保护作用。     

HMGB1在急性肝衰竭大鼠中的表达及作用

目的探讨HMGB1在急性肝衰竭大鼠肝组织和血中的变化规律及作用。方法将48只健康雌性SD大鼠按数字表随机分为对照组、模型组,每组24只,采用腹腔内注射D-Gal N（400 mg/kg）＋LPS（100μg/kg）的方法诱导急性肝衰竭,同时对照组予腹腔注射等量生理盐水。两组大鼠均在4、8、12小时时间点取血液及肝组织标本,检测血清ALT、AST水平,HE染色观察肝组织病理变化,ELISA法检测血清HMGB1浓度,RT-PCR法检测肝组织HMGB1 m RNA表达,免疫组化法检测肝组织HMGB1的表达。结果 D-Gal N（400 mg/kg）＋LPS（100μg/kg）的方法能成功诱导急性肝衰竭模型。对照组血清HMGB1浓度及肝组织HMGB1 m RNA表达在各时间点均较低,而模型组随时间延长而升高。对照组肝细胞核与胞浆中仅见少量HMGB1蛋白表达,模型组肝组织HMGB1蛋白表达随时间延长升高。结论急性肝衰竭时血和肝组织中HMGB1水平均随时间延长而升高,且两者变化与肝损程度正相关。     

罗格列酮对D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导小鼠急性肝衰竭的保护作用

目的 观察罗格列酮对D-氨基半乳糖(D-GalN)联合脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肝衰竭的保护作用,并研究其可能的作用机制.方法 雄性昆明小鼠随机分为3组:正常组、对照组、治疗组.对照组和治疗组以D-GalN/LPS腹腔注射构建小鼠急性肝衰竭模型,正常组则相应予以生理盐水腹腔注射;治疗组于造模前2 h予以罗格列酮灌胃,正常组和对照组则相应予以生理盐水灌胃.比较各组小鼠24 h存活率、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平、肝组织病变程度及肝组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和天冬氨酸特异半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA表达水平.结果 治疗组小鼠24 h存活率明显高十对照组(P<0.05),血清ALT、AST水平明显低于对照组(P<0.05);治疗组与对照组比较,肝组织炎性细胞浸润明显减少,肝细胞以变性为主,未见明显坏死;治疗组小鼠肝组织TNF-α、Caspase-3 mRNA表达水平明显低于对照组(P<0.05).结论 罗格列酮对D-GalN/LPS小鼠急性肝衰竭有保护作用,可改善肝细胞炎症和坏死.降低急性肝衰竭死亡率,其机制可能与罗格列酮下调TNF-α、Caspasc-3表达有关.     

糖原合酶激酶3β抑制剂TDZD-8对急性肝衰竭小鼠肝组织炎症的保护作用研究

目的 探索糖原合酶激酶3β(GSK3β)抑制剂TDZD-8对急性肝衰竭(ALF)小鼠的保护作用。方法 将24只小鼠随机分为对照组、模型组和TDZD-8处理组,给予D-Gal和LPS腹腔注射,制备ALF模型,分别给予生理盐水或TDZD-8干预。采用ELISA法检测肝组织匀浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)水平,采用蛋白印迹法检测肝组织IL-18、IL-1β、UNC-51样激酶1(ULK1)、Beclin 1和P62蛋白表达。结果 模型组血清ALT、AST和TBIL水平分别为(3460.8±105.2)U/L、(2710.4±84.3)U/L和(93.8±1.1)μmol/L,显著高于对照组【分别为(28.1±4.2)U/L、(25.78±2.5)U/L和(3.4±0.4)μmol/L,P<0.05】,而TDZD-8处理组各指标均显著降低【分别为(370.1±7.1)U/L、(277.3±20.3)U/L和(35.1±0.8)μmol/L,P<0.05】;模型组肝组织匀浆TNF-α、IL-1β和血清无细胞游离(cf)-DNA水平分别为(3004.6±2...