巴马小型猪化脓性肝脓肿模型的建立和鉴定

目的建立和鉴定巴马小型猪化脓性肝脓肿模型。方法采用在肝实质内快速注射金葡菌和自体静脉血凝块混合物的方法建立化脓性肝脓肿模型。采用脓液涂片革兰染色、脓液培养和PCR方法鉴定化脓性肝脓肿的致病菌。采用石蜡切片HE染色法评估化脓性肝脓肿的病理分期。结果利用金葡菌ATCC 29213和自体静脉血凝块混合物于肝实质内快速注射的方法建立了化脓性肝脓肿模型。脓液涂片革兰染色、脓液培养和PCR结果表明引起化脓性肝脓肿的致病菌为注入的细菌。脓肿石蜡切片HE染色结果表明造模术后第15天为脓肿前期、第21天为脓肿形成期、第33天为脓肿恢复期。结论首次建立了巴马小型猪化脓性肝脓肿模型。化脓性肝脓肿模型的建立为探讨化脓性肝脓肿的新的治疗模式提供了可能。     

亚抑菌浓度茅苍术挥发油对金黄色葡萄球菌毒力因子表达的抑制作用初步研究

目的探索亚抑菌浓度茅苍术挥发油对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)毒力因子如α溶血素等表达的抑制作用及其机制。方法采用微量肉汤稀释法测定茅苍术挥发油对4株金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC);吸光度测量等方法体外检测亚抑菌浓度茅苍术挥发油作用下金黄色葡萄球菌毒力因子产量的变化;采用Real-Time PCR法检测亚抑菌浓度挥发油对AgrA和Hla mRNA表达的影响。结果茅苍术挥发油可抑制金黄色葡萄球菌生长并呈现浓度依赖性,标准菌株ATCC25923的MIC为0.0625%(v/v),临床菌株的MIC为0.03125%(v/v)。亚抑菌浓度茅苍术挥发油作用后4株菌株凝固酶的分泌受到抑制,标准菌株ATCC25923的凝固酶效价只有对照组的1/4,差异有统计学意义(P<0.05),临床菌株的凝固酶效价都只有对照组的1/8,差异有统计学意义(P<0.05)。亚抑菌浓度茅苍术挥发油减弱了四株菌株的粘附能力,ATCC25923、SA1.5、SA2.3和SA4.12的粘附能力分别只有对照组的(53.71±6.56)%(P<0.01)、(53.10±9.39)%(P<0.01)、(74.70±9.00)%(P<0.01)和(45.62±21.22)%(P<0.01)。标准菌株ATCC25923和SA2.3的溶血活力受到亚抑菌浓度挥发油的显著抑制,溶血活力分别只有对照组的(18.48±23.88)%(P<0.01)和(1.63±4.18)%(P<0.01)。α-溶血素毒力基因Hla及其调控基因AgrA的表达受到了亚抑菌浓度挥发油的抑制,其表达水平分别只有对照组的(6.17±2.23)%(P<0.01)和(24.79±9.19)%(P<0.01)。结论茅苍术挥发油能抑制金黄色葡萄球菌的生长,并且对多种毒力因子的表达有抑制作用。     

万古霉素耐药金黄色葡萄球菌致病性研究

目的了解金葡菌对万古霉素耐药后毒力和致病性变化规律及病变特征,为临床正确诊断和合理治疗奠定基础。方法使用万古霉素体外诱导方法将h-VRSA在体外逐渐诱导为VISA,通过对侵袭性酶(血浆凝固酶、卵磷脂酶)、毒素(溶血毒素)的检测及动物致病性观察,并与金黄色葡萄球菌标准菌株比较,了解其致病性的变化规律。结果当试验菌株中耐药亚群的比例较少时,其毒力因子及动物致病性检测结果与金葡菌标准菌株无显著差异;随着试验菌株中耐药亚群的比例增加,表现为血浆凝固酶、卵磷脂酶由阳性转为阴性,血琼脂平板上溶血环消失,细菌在动物体内增殖速度减慢,对动物的半数致死量(LD50)增加。结论金葡菌对万古霉素耐药以后,毒力因子产生减少,对动物致病性明显减弱。     

乙酰化低密度脂蛋白促进胆固醇酰基转移酶活性升高的机制研究

目的 :研究乙酰化低密度脂蛋白 (Ac LDL)对人THP 1单核细胞 (MC)分化的巨噬细胞 (MP)酰基辅酶A、胆固醇酰基转移酶 1(ACAT 1)活性的影响及其机制。方法 :体外培养人THP 1单核细胞系 ,由佛波酯 (PMA)作用使其分化为MP ,后者再由乙酰化低密度脂蛋白Ac LDL进行脂质负荷转变为泡沫细胞。该过程中以放射性同位素标记底物法检测ACAT 1酶活性的变化 ,并用Westernblot法检测ACAT 1酶蛋白的表达及RT PCR法检测A CAT 1mRNA的水平。结果 :在MC分化为MP的过程中ACAT 1酶活性升高了 2倍 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ,酶蛋白及mRNA水平呈现类似变化趋势 ;Ac LDL作用于巨噬细胞 ,使ACAT1酶活性、酶蛋白及mRNA进一步升高 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。结论 :MC分化为MP的过程中ACAT 1表达上调 ,使ACAT 1活性增强 ,而Ac LDL可进一步促进ACAT 1基因表达增加 ,升高ACAT 1活性。     

金黄色葡萄球菌fur基因缺失株构建及其生物学特性研究

目的构建金黄色葡萄球菌Newman株fur基因缺失株,对其体外增殖、细胞侵袭及溶血活性特征变化进行研究,为通过封闭Fur蛋白表达治疗金黄色葡萄球菌感染提供新的实验依据。方法采用Gateway同源重组技术构建金黄色葡萄球菌Newman株fur基因缺失株,采用分光光度法检测其体外增殖活性变化;采用万古霉素保护试验检测其对A 549肺腺癌细胞株侵袭力的变化;观察其在血琼脂培养基上的溶血活性变化;采用实时荧光定量PCR检测fur缺失株α溶血素(hla)基因mRNA表达水平变化。结果成功构建金黄色葡萄球菌Newman株fur基因缺失株并通过PCR方法和测序方法验证。与Newman野生株相比,同一时间点侵入A 549肺腺癌细胞株内fur缺失株菌量(2 950CFUs/ml)显著少于野生株(20 100CFUs/ml,P0.01),缺失株体外增殖活性及溶血活性显著减弱,且hla基因mRNA相对表达量(0.067)显著低于野生株(0.270)(P0.05)。结论金黄色葡萄球菌fur缺失株在富铁条件下的增殖活性、细胞侵袭力及溶血活性均显著降低,对环境铁浓度感应及利用能力明显降低,Fur蛋白可能作为抗金黄色葡萄球菌感染治疗的新靶点。     

辛二酰苯胺异羟肟酸对鼻咽癌细胞回复引导半胱氨酸丰富蛋白含kazal基元以及基质金属蛋白酶9表达与活性的影响

目的探讨辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)对鼻咽癌细胞回复引导半胱氨酸丰富蛋白含kazal基元(reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs,RECK)以及基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)表达与活性的影响。方法体外培养鼻咽癌细胞系CNE-1,用0、0.1、1、5μmol/L SAHA处理后,采用蛋白质印迹法(Western blot)和Real-Time PCR(RT-PCR)分别检测RECK,MMP-9蛋白和mRNA表达;MTT法检测CNE-1细胞的增殖。同时采用明胶酶谱实验观察SAHA处理后MMP-9酶活性变化。结果随着SAHA浓度的增加,RECK蛋白和mRNA的表达显著增高(P0.05);随着SAHA浓度的增加,MMP-9蛋白和mRNA的表达显著降低(P0.05);CNE-1细胞随着SAHA浓度的增加,存活率逐渐降低(P0.05)。明胶酶谱实验显示,随着SAHA浓度的增加,MMP-9酶活性逐渐降低。结论 SAHA可能通过上调RECK基因的表达,抑制MMP-9的表达与活性而发挥对CNE-1细胞生长抑制作用。     

广西巴马小型猪动脉粥样硬化模型LOX-1表达的研究

目的 建立猪动脉粥样硬化(AS)模型,探讨该模型中LOX-1表达的变化.方法 将10头广西巴马小型猪分别喂正常(CD)和高脂、高糖、高胆同醇(HFSCD)饲料,每月末测定血脂水半.第5个月末处死动物,采用苏丹Ⅳ检测动脉粥样斑块病变;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Westem Blot印迹分别检测主动脉组织中LOX-1的mRNA和蛋白质表达.结果 与CD组比较,HFSCD组血浆甘油三酯、高密度脂蛋白胆同醇(HDI-C)和总胆同醇水平异常升高;动脉有明显的脂质条纹及斑块;动脉粥样硬化小型猪主动脉组织的LOX-1的mRNA及蛋白质的表达均上=调(P＜0.05).结论 高脂、高糖、高胆同醇饲料喂养小型猪可建立As动物模型;AS小型猪主动脉组织的LOX-1表达上调.     

垂体腺苷酸环化酶激活肽对脑缺氧缺血新生大鼠胱冬酶-3和X-连锁凋亡抑制蛋白表达的影响

目的 观察垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating peptide,PACAP)对脑缺氧缺血(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)新生大鼠胱冬酶-3和x-连锁凋亡抑制蛋白(x-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)的影响,探讨其脑保护作用和有效剂量.方法 60只新生大鼠随机分为假手术组、生理盐水对照组以及PACAP大剂量组(10-8 mol)、中等剂量组(10-9 mol)和小剂量组(10-8 mol),建立HIBD动物模型.应用实时荧光定量聚合酶链反应法榆测新生大鼠HIBD后24 h损伤侧脑组织的胱冬酶-3 mRNA和XIAP mRNA表达情况,应用分光光度法检测胱冬酶-3活性.结果 在HIBD后24 h,生理盐水对照组胱冬酶-3 mRNA表达和酶活性以及XIAP mRNA表达均显著高于假手术组(P均<0.01);PACAP各剂量组胱冬酶-3 mRNA表达和酶活性均显著低于生理盐水对照组(P均<0.01),而XIAP mRNA表达均显著高于牛理盐水对照组(P均<0.01).结论 PACAP能上调XIAP mRNA表达,抑制胱冬酶-3 mRNA表达和酶活性,对新生大鼠HIBD具有保护作用,而且在大剂量、中等剂量和小剂量时均有效.     

Caspase-3在异丙基肾上腺素致大鼠急性心肌损伤中的作用及bFGF的影响

目的：研究半胱天冬酶-3(caspase-3)在异丙基肾上腺素(isoprenaline，Iso)致大鼠急性心肌损伤中的作用及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对它的影响。方法：将Wistar雄性大白鼠随机分成3组：对照组、损伤组和bFGF保护组，光镜观察心肌组织的病理变化，TUNEL法检测心肌细胞凋亡，免疫组化和原位杂交方法检测caspase-3蛋白及mRNA的表达水平，底物降解法测定该酶的活性。结果：Iso损伤组心肌坏死较重，有显著心肌细胞凋亡，且Caspase-3基因mRNA及蛋白表达水平明显升高，酶活性增加；bFGF保护组心肌坏死明显减轻，凋亡细胞数减少，Caspase-3基因mRNA和蛋白表达水平明显下降，酶活性受到抑制。结论：bFGF可能通过抑制Caspase-3的表达和活性减少心肌细胞凋亡而减轻大鼠心肌损伤。     

金黄色葡萄球菌对左心室细胞黏附分子和炎症因子基因表达的影响

目的初步探讨金黄色葡萄球菌对左心室细胞黏附分子和炎症因子基因表达的影响和感染性心内膜炎的发病机制。方法7只健康家兔做对照,24只家兔分别经静脉注射金黄色葡萄球菌（金葡菌）和二尖瓣手术。术后24h处死,取出左心室组织,肉眼、电镜观察。RT-PCR技术检测细胞黏附分子（E-Selectin,PECAM-1,VCAM-1）和炎症因子-巨噬细胞集落刺激因子-1（MCSF-1）mRNA表达水平。结果单独金葡菌注射没有引起左心室靶基因的显著变化;二尖瓣手术后左心室组织E-Selectin,PECAM-1和MCSF-1 mRNA表达水平显著升高,而VCAM-1 mRNA没有显著的变化;二尖瓣手术并发金葡菌注射后左心室组织E-Selectin和MCSF-1 mRNA表达显著升高,而PECAM-1和VCAM-1 mRNA表达降低。结论金黄色葡萄球菌在心内膜损伤和病理血流状态下,导致左心室部分特定的细胞黏附分子和炎症因子表达变化,引起感染性心内膜炎发生。     

藤黄酸对人胃腺癌细胞BGC-823细胞端粒酶逆转录酶和AKt蛋白磷酸化表达的影响

目的探讨藤黄酸(GA)对人胃癌细胞BGC-823端粒酶活性和端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA、AKt蛋白磷酸化表达的影响。方法将处于对数生长期的BGC-823细胞制成细胞悬液,加入96孔酶标板内,加入不同浓度的GA孵育24、48、72 h后,收集细胞,采用MTT比色法测定半抑制浓度(IC50)值;分别采用聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫反应(ELISA)法检测端粒酶的活性和逆转录PCR(RT-PCR)法检测hTERT mRNA的表达;通过免疫共沉淀(IP)法获得hTERT与磷酸化AKt(p-AKt)蛋白的结合体,然后用Western blot法检测p-AKt蛋白表达的变化。结果 GA可以明显抑制胃癌细胞BGC-823的端粒酶活性和hTERT mRNA的表达,呈一定的时效、量效关系;进一步研究发现,GA能够抑制hTERT和p-AKt蛋白的结合,且作用呈时间依赖性,进而影响p-AKt参与的hTERT的活化,从而完成对hTERT转录后的调控,抑制端粒酶的活性。结论 GA可明显抑制胃癌细胞BGC-823端粒酶活性和hTERT的表达,GA对BGC-823细胞生长抑制的作用机制可能与GA影响p-AKt参与的hTERT的活化,从而完成对hTERT转录后的调控有关。     

肝星形细胞存在局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统

目的 明确肝星形细胞和永生肝星形细胞株HSC-T6是否存在局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统。方法 采用原位酶灌注法分离培养肝星形细胞。采用放射免疫法检测细胞中肾素活性，血管紧张素Ⅱ和醛固酮水平；采用紫外分光光度法测定血管紧张素转换酶活性，免疫组化法检测血管紧张素Ⅱ1型受体的表达；RT-PCR法检测肾素，血管紧张素原，血管紧张素转换酶，血管紧张素Ⅱ1型受体醛固酮合成关键酶CYPⅡB2mRNA的表达。结果 肝星形细胞和HSC-T6中可检测到肾素活性，血管紧张素转换酶活性，血管紧张素Ⅱ和醛固酮；免疫组化结果显示二者均表达血管紧张素Ⅱ的1型受体；两种细胞均可检测到上述除血管紧张素原以外的4种基因mRNA表达。结论 肝星形细胞和HSC-T6存在局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统。     

明胶酶A mRNA表达对胃癌侵袭和转移的影响

目的 探讨明胶酶AmRNA表达与胃癌侵袭和转移的关系。方法 采用Northemblot技术检测32例胃癌组织中明胶酶AmRNA表达。结果 正常胃、癌旁和胃癌组织明胶酶 A mRNA表达阳性率分别为10．0％、28．6％和84．4％。早期胃癌不表达，进展期胃癌高表达。有浆膜侵袭和淋巴结转移的胃癌组织，明胶酶A mRNA显著高表达。结论 明胶酶A mRNA高表达促进胃癌的侵袭和转移，检测明胶酶A mRNA表达可作为判断胃癌侵袭和转移指标。     

bFGF促进人大肠癌LoVo细胞增殖的信号转导机制

目的:通过改变碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作用于LoVo细胞的时间,检测PKB活性和Cyclin A的表达情况,进一步研究bFGF通过PI3-K/PKB通路调控大肠癌细胞生长的信号转导机制.方法:MTT法分析bFGF对LoVo细胞增殖程度的影响;(γ-32P)ATP掺入法检测大肠癌LoVo细胞株中PKB的活性;RT-PCR法检测大肠癌LoVo细胞株中Cyclin A的表达;Western blot法检测bFGF作用LoVo细胞后Cyclin A的表达.结果:bFGF以不同时间作用于LoVo细胞时,通过(γ-32P)ATP掺入法检测发现其可提高细胞PKB活性,PI3-K的抑制剂LY294002预处理后再施加bFGF,可显著降低PKB的活性,两者相比差异显著[704.32±12.35 pmol/(mg·min)vs 1352.79±19.85 pmol/(mg·min),P＜0.05].bFGF刺激LoVo细胞时Cyclin A蛋白和CyclinA mRNA表达均高于其他各施加因素组,而PI3-K的抑制剂LY294002组的Cyclin A蛋白和Cyclin A mRNA明显降低.结论:bFGF刺激大肠LoVo细胞后可通过依赖PI3-K/PKB途径调节Cyclin A的转录活性,促进其表达,进而促进细胞增殖.     

铜绿假单胞菌生物被膜中β-内酰胺酶活性的检测

目的：探讨铜绿假单胞菌生物被膜（BF）的耐药机制。方法：用改良平板培养法在硅胶膜上建立铜绿假单胞菌BF模型。用银染及扫描电镜对BF进行鉴定。用紫外分光光度法及Bio-Rad蛋白定量试剂法检测铜绿假单胞菌的浮游细菌（A组）、BF菌（B组）及亚胺增南诱导BF菌（C组）产生β-内酰胺酶的能力。结果：B组产生β-内酰胺酶的活性及产酶量高于A组,分别是A组的4．67倍和2．09倍,C组产酶活性及产酶量高于A组,分别是A组的21．86倍和6．28倍,也高于B组,是B组的4．68倍和3．00倍,t检验结果：A、B、C3组产β-内酰胺酶活性及产酶量两两之间比较P值均＜0．01,表明各组之间β-内酰胺酶的活性及产酶量具有显著差异,结论：BF铜绿假单胞菌的耐药与其产生β-内酰胺酶有重要关系。     

脐带间充质干细胞 nestin mRNA表达的研究

目的：从基因角度求证脐带间充质干细胞（MSCs）神经巢蛋白nestin mRNA表达。方法取新鲜脐带组织行MSCs分离、培养及鉴定。采用胰酶消化法计数MSCs,流式细胞仪检测细胞活性,提取原代、一代、二代细胞的mR-NA,采用实时荧光定量PCR法检测nestin mRNA表达。结果脐带中分离出的细胞贴壁生长状况较好,其中大部分细胞呈梭形生长,传代后细胞与原代细胞生长形态相似,生长加快;个别细胞呈神经样生长。 MSCs呈nestin mRNA阳性表达,其表达量在传代后有明显减少;与nestin蛋白在神经前体细胞向神经细胞分化时的变化一致。结论脐带MSCs存在nestin mRNA表达;传代后nestin mRNA表达量虽减小,但仍可作为备选种子细胞进行移植。     

溶血磷脂酸上调THP-1细胞基质金属蛋白酶-9的表达及活性

目的 探讨基质金属蛋白酶9(MMP-9)在溶血磷脂酶(LPA)致动脉粥样硬化中的作用及机制.方法 以不同浓度LPA(0～10 μmol/L)刺激人单核细胞株THP-1细胞4 h,RT-PCR法测定MMP-9 mRNA表达,酶谱法检测MMP-9活性,Western印迹法检测核蛋白NF-κB p65表达变化.结果 随着LPA剂量的增加,MMP-9表达及活性,核蛋白NF-κB p65表达逐渐增强,在LPA 1 μmol/L时达到最高点,然后逐渐减弱,LPA以剂量依赖的方式激活NF-κB,在转录水平促进THP-1细胞MMP-9 mRNA表达,增强MMP-9活性.结论 LPA可能通过激活NF-κB,在转录水平促进THP-1细胞MMP-9 mRNA表达,并增强其活性,促进粥样硬化发生和发展.     

黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶及DNA聚合酶γ表达的影响

目的 探讨黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶及DNA聚合酶γ表达的影响.方法 选用昆明小鼠,用D-半乳糖致成亚急性衰老模型,并观察药物对小鼠呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ+Ⅲ的活性及DNA聚合酶γmRNA的表达.通过RT-PCR法检测衰老小鼠肝线粒体中DNA 聚合酶γ基因在mRNA水平的变化.结果 黄精多糖可提高衰老小鼠呼吸链酶活性,降低DNA聚合酶γ mRNA的表达.结论 黄精多糖可以通过改善肝线粒体能量代谢,使DNA聚合酶γ mRNA表达减少,提高呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ+Ⅲ而起到延缓衰老的作用.     

山莨菪碱对血管内皮细胞表达组织因子的影响

通过研究山莨菪碱对内毒素脂多糖致血管内皮细胞组织因子表达的影响，探讨山莨菪碱抗血栓形成以及治疗感染性休克的机制。采用酶消化法培养人脐静脉内皮细胞；用一步凝固法检测培养的内皮细胞组织因子活性；Northem blot检测内皮细胞组织因子mRNA的表达；为了评估上述作用是否通过核因子κB途径转导，采用电泳迁移变动检测法检测培养的内皮细胞核提取物核因子κB DNA结合活性。结果发现，内毒素脂多糖使内皮细胞组织因子活性及其mRNA表达显著增强；加入山莨菪碱后，内毒素脂多糖的这种作用明显减弱，并与山莨菪碱呈量效关系。且山莨菪碱能完全阻止内毒素脂多糖致内皮细胞核提取物核因子κB DNA结合活性。结果提示，山莨菪碱治疗感染性休克的机制之一是通过拮抗内毒素脂多糖致血管内皮细胞组织因子的表达，且这种拮抗作用可能通过、至少部分通过核因子κB途径转导。