靶向沉默miR-345表达对胃癌细胞周期的影响及其机制

目的探讨miR-345影响胃癌细胞生长周期的作用机制。方法采用脂质体介导转染miR-345反义寡核苷酸至胃癌细胞MGC803、MKN45以沉默miR-345表达,采用实时英光定量PCR(Real-time PCR)、蛋白免疫印迹(Western blotting)检测胃癌细胞中p21Cip1水平,随后检测CDK4、CDK6、Cyclin D1、p-Rb、Rb蛋白水平,进一步克隆形成实验比较其增殖能力,流式细胞术检测miR-345对胃癌细胞周期的影响。结果脂质体介导转染miR-345反义寡核苷酸至胃癌细胞MGC803、MKN45可以抑制miR-345的表达;p21Cip1的mRNA和蛋白水平在低miR-345表达的胃癌细胞系中升高;下调miR-345的表达后MGC803、MKN45细胞中CDK4、CDK6、Cyclin D1和总Rb蛋白的表达水平无明显变化,但Rb蛋白的磷酸化水平显著降低。结论沉默miR-345的表达能够明显阻滞胃癌细胞从G1期向S期的进程,减慢细胞生长速度;其机制与上调p21Cip1进而抑制Rb蛋白的磷酸化有关。     

COPB2表达对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

背景 外被体蛋白复合物β2亚基(coatomer protein complex subunit beta 2,COPB2)可参与调节多种肿瘤细胞的恶性生物学行为,而其在胃癌中表达和临床意义仍不完全明确.目的 探究COPB2对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响及其机制.方法 采用免疫组化法观察COPB2在胃癌组织和癌旁...     

siRNA沉默Livin基因对胃癌细胞生长、凋亡的影响

目的:观察小分子干扰RNA(siRNA)沉默Livin基因在胃癌BGC-823细胞中的表达, 并探讨Livin基因对胃癌细胞生长、凋亡的影响.方法:自行设计两条针对Livin基因的siRNA:Livin-sh-1和Livin-sh-2, 以此构建相应的表达载体并分别转染至对数生长期胃癌BGC-823细胞, 经G418筛选后分别采用半定量RTPCR检测不同siRNA实验分组细胞BGC-823mRNA水平变化, 四氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖、流式细胞仪检测胃癌细胞的凋亡.结果:siRNA对照组与空siRNA载体组Livinα/β mRNA表达差别无显著性; 但转染siRNA组Livin α/β mRNA表达显著低于空白对照组和空siRNA载体组(Livin α:0.11±0.07 vs 0.37±0.10, 0.34±0.08; Livin β:0.13±0.04 vs 0.43±0.09, 0.45±0.11, 均P<0.05). 空白对照组与空siRNA载体组相比, 24、48、96 h和1 wk时细胞生长未受影响; 而siRNA组在转染后24 h和48 h细胞生长未受影响, 但在96 h和1 wk时则被明显抑制( P<0.01). 转染siRNA组的细胞的凋亡率与空白对照组和转染空siRNA载体组相比显著增加(14.85%±1.35% vs 4.51%±0.36%, 6.13%±0.71%, 均P<0.05).结论:siRNA沉默Livin基因能抑制胃癌细胞的生长, 促进胃癌细胞的凋亡, Livin基因有可能成为胃癌治疗的新靶点.     

沉默Bmi-1基因表达对胃癌细胞BGC823衰老和转移的作用

目的:研究靶向Bmi-1 siRNA对胃癌BGC823细胞衰老和转移的作用.方法:设计Bmi-1的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后重组入pRNAT-U6.2载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人胃癌BGC823细胞,采用RT-PCR和Western blot分别检测Bmi-1基因mRNA和蛋白表达的变化.SA-β-Gal染色检测和细胞体外侵袭实验检测分析对细胞衰老和侵袭、转移的影响.结果:靶向Bmi-1基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pRNAT-U6.2载体,经测序分析,插入片段正确:RT-PCR和Western blot检测显示,Bmi-1基因的表达水平明显降低,其中以1 104-1 122 nt(GGAGGAGGTGAATGATAAA)为靶序列的siRNA沉默作用最佳,Bmi-1mRNA和蛋白表达几乎完全抑制.转染siRNA组的衰老细胞百分率显著升高、穿透Matrigel的细胞数显著下降,与未转染和转染空载体组比较差异有显著性(P<0.01).结论:抑制胃癌BGC823细胞Bmi-1基因表达,可以增加细胞的衰老和降低细胞侵袭、转移的能力.     

shRNA沉默干扰HMGA2基因对胃癌细胞株MKN-45的增殖与凋亡的影响

目的:观察小分子RNA(shRNA)沉默后HMG-A2基因在胃癌细胞株MKN-45的表达,并探讨HMGA2基因对胃癌细胞的增殖与凋亡的影响.方法:构建针对人HMGA2基因的shRNA真核表达载体,瞬时转染人胃癌细胞株MKN-45.用细胞免疫组化的方法观察转染72h后HMGA2的蛋白表达水平,以MTT比色法、流式细胞术检测转染后MKN-45细胞的生长增殖、凋亡的情况.结果:转染HMGA2-shRNA组的蛋白表达强度(171.34±19.61)明显弱于scrambled组(143.48±19.04)和空白对照组(141.79±18.09,P<0.05),较之scrambled组(5.66%±0.63%)和空白对照组,HMGA2-shRNA组(39.32%±2.37%)能明显抑制细胞的增殖(P<0.05),HMGA2-shRNA组的凋亡率(39.67%±2.35%)与scrambled组(4.29%±1.33%)和空白对照组(5.05%±1.84%)相比明显增加(P<0.05).结论:靶向HMGA2基因的shRNA可以有效抑制人胃癌MKN-45细胞的生长,并促进细胞的凋亡,HMGA2可能是胃癌治疗的一个潜在靶点.     

RNA干扰沉默CXCR4基因对胃癌细胞SGC7901增殖和侵袭力的影响

目的探讨特异性抑制胃癌细胞SGC7901中趋化因子受体4(CXCR4)的表达及RNA干扰对胃癌细胞SGC7901细胞增殖及侵袭力的影响。方法将腺病毒载体CXCR4-shRNA转染至胃癌细胞SGC7901,RT-PCR检测转染后CXCR4 mRNA的表达量;MTT法检测癌细胞增殖情况;Transwell小室侵袭实验对胃癌细胞侵袭力进行检测。结果 (1)成功将CXCR4-shRNA重组腺病毒载体转染至胃癌细胞SGC7901;(2)空白组与对照组细胞增殖迅速,两组之间无显著性差异(P>0.05),实验组经腺病毒载体转染后细胞增殖程度显著减少,与前两组相比有显著性差异(P<0.05);(3)shRNA-CXCR4腺病毒载体和空白组及对照组相比能显著抑制SGC7901细胞的侵袭力(P<0.05),抑制率为57.01%。空白组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。结论重组腺病毒载体CXCR4-shRNA能有效抑制胃癌细胞SGC7901的侵袭,并在一定程度上抑制癌细胞增殖。     

HIF-2α基因沉默对人肝癌细胞株HepG2增殖能力的影响

目的探讨缺氧诱导因子-2α(hypoxia-inducible factors-2α,HIF-2α)表达水平对人肝癌细胞株HepG2增殖能力的影响。方法用氯化钴(CoCl_2)诱导细胞模拟缺氧微环境,并根据CoCl_2浓度不同分为50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L组,选择CoCl_2浓度为200μmol/L模拟肿瘤内缺氧微环境。采用siRNA干扰沉默HepG2细胞中HIF-2α的表达,分别应用RT-PCR、Western blotting方法检测HIF-2αmRNA和蛋白的表达,MTT方法检测HepG2细胞增殖,绘制细胞生长曲线,流式细胞技术观察细胞周期的改变。结果建立细胞缺氧模型,作为低氧组;采用浓度为50 nmol/L的HIF-2αsiRNA转染缺氧环境下的HepG2细胞,作为低氧+HIF-2αsiRNA组,结果显示:低氧组、低氧+Control siRNA组的HIF-2αmRNA和蛋白表达显著高于常氧组和低氧+HIF-2αsiRNA组(P0.05);细胞生长曲线结果显示:低氧组、低氧+Control siRNA组的光密度值显著高于常氧组和低氧+HIF-2αsiRNA组(P0.05);细胞周期结果显示:低氧组、低氧+Control siRNA组HepG2细胞在DNA合成前期(G0/G1期)细胞比率显著低于常氧组和低氧+HIF-2αsiRNA组,合成期(S)及合成后期(G2/M)细胞比率显著高于常氧组和低氧+HIF-2αsiRNA组(P0.05)。结论缺氧微环境通过促进人肝癌细胞株HepG2细胞中HIF-2α的表达进一步促进HepG2细胞增殖,而针对HIF-2α的靶向siRNA能有效抑制肝癌HepG2细胞中HIF-2α的表达,从而抑制HepG2细胞的增殖。     

Dysadherin基因沉默对胰腺癌细胞侵袭移行能力的影响

目的 探讨靶向封闭dysadherin基因对胰腺癌细胞PANC1、BxPC3体外侵袭移行能力的影响.方法 应用脂质体转染方法将小分子RNA(siRNA)转染细胞.实验分为dysadherin-siRNA转染(dysa)组、阴性对照siRNA转染(HK)组、脂质体对照(对照)组、.采用RT-PCR、免疫组化方法检测转染细胞的dysadherin mRNA及蛋白表达;采用Transwell侵袭小室检测转染细胞体外侵袭移行能力.结果 转染dysadherin-siRNA(5 nmol/L)的PANC1和BxPC3细胞的dysadherin mRNA表达较HK组细胞分别下降95.4%、52.1%(P＜0.05);dysadherin蛋白表达亦分别降低91.2%、83.6%(P＜0.01).PANC1细胞的对照组、HK组和dysa组穿膜细胞数分别为163.2±15.5、154.4±17.3和53.6±7.9;BxPC3细胞的对照组、HK组和dysa组穿膜细胞数分别为30.7±3.2、27.5±2.8和4.7±2.4.dysa组显著低于HK组和对照组(P值均＜0.01).结论 应用RNA干扰技术沉默人胰腺癌细胞株PANC1、BxPC3的dysadherin基因可使细胞的侵袭移行能力下降.     

siRNA靶向干扰ROBO1基因表达对食管癌细胞周期、增殖及相关蛋白的影响

目的研究siRNA靶向干扰轴突导向受体蛋白(ROBO)1基因表达对食管癌EC109细胞增殖、细胞周期的影响及可能作用机制。方法实验将食管癌EC109细胞随机分为空白组、对照组、siRNA-ROBO1组,采用脂质体将阴性siRNA和siRNAROBO1转染EC109细胞;Western印迹检测ROBO1、细胞核相关抗原Ki-67(Ki-67)、增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白(Cyclin)D1蛋白的表达;CCK-8实验检测细胞的增殖活力;流式细胞仪检测EC109细胞周期的变化。结果干扰ROBO1表达后,EC109细胞中ROBO1蛋白的表达量较空白组显著降低(P0.05),细胞增殖活性显著降低(P0.05),G0/G1期细胞显著增加(P0.05),G2/M期细胞显著降低(P0.05),且siRNA-ROBO1组细胞中Ki-67、PCNA、Cyclin D1表达量较空白组明显降低(P0.05)。结论ROBO1可能通过影响食管癌细胞增殖、周期相关蛋白水平使细胞周期阻滞在G0/G1期,从而抑制食管癌细胞增殖。     

RNA介导survivin基因沉默对肝癌细胞HepG2细胞株凋亡及增殖的影响

目的观察靶向封闭survivin基因对肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的影响,探讨survivin基因在肝癌的发生、发展中的作用。方法设计1对survivin-siRNA,体外转录制备siRNA。应用脂质体转染技术将survivin-siRNA转染肝癌细胞株HepG2,应用有荧光标记的非特异性小分子siRNA检测转染效率;RT-PCR检测survivin-mRNA水平;SABC免疫组化染色技术检测survivin蛋白表达情况;MTT法检测细胞生长情况;流式细胞仪分析细胞凋亡。结果转染survivin-siRNA可使HepG2细胞survivin-mRNA水平下降53.8%,并可使survivin蛋白表达明显减少;转染survivin-siRNA对细胞增殖及细胞凋亡无明显影响(P>0.05)。结论抑制survivin表达对肝癌细胞株HePG2凋亡及增殖无明显影响。提示survivin在肝癌细胞增殖与调亡调控中所起的作用可能并非是关键性的。     

siRNA沉默TPX2基因对食管癌细胞EC9706的增殖和TPX2基因表达的影响

目的:研究TPX2基因特异性小干扰RNA(small RNA interference,siRNA)对食管鳞癌EC9706细胞基因表达的抑制作用及对食管癌细胞生长的影响.方法:以食管鳞癌EC9706细胞为研究对象,利用Lipofectamine2000介导TPX2 siRNA分组转染EC9706细胞24,48,72,96 h(实验组),并设立阴性对照组和空白对照组.RT-PCR检测siRNA转染前后TPX2 mRNA的表达水平的变化:Western blot检测转染前后EC9706细胞中TPX2蛋白表达水平的变化;MTT法检测瞬时转染TPX2 siRNA对EC9706细胞增殖的影响.结果:导入有效siRNA后,PT-PCR及Western blot结果显示.TPX2 siRNA可使EC9706细胞中TPX2 mRNA水平及蛋白表达水平下降,至72 h时表达量最低,与空白对照组相比分别为0.31±0.08和0.39±0.12,差异有统计学意义(P<0.05);MTT实验显示细胞的生长增殖受到明显抑制,与对照组相比抑制率可达35.4%(P<0.05).结论:siRNA可以有效抑制EC9706细胞中TPX2的表达,并降低EC9706细胞的增殖能力.     

RNA介导ABCE1基因沉默对肺癌细胞95-D增殖、凋亡的影响

目的 研究构建的ABCE1基因SiRNA表达质粒基因沉默效果,及其对95-D肺癌细胞株增殖、凋亡能力的影响.方法 运用转染试剂FuGENE 6对3种不同的ABCE1基因SiRNA表达质粒在95-D肺癌细胞中进行转染,并用G418筛选,荧光显微镜观察3种质粒的转染效果,收集转染细胞,计数转染细胞总数、运用MTT法检测细胞活力,用ELISA法检测细胞凋亡.结果 ①转染的细胞表达红色荧光蛋白,荧光显微镜结果表明,重组质粒转染效率达42.7%.②实验组的细胞增殖低于对照组、而细胞凋亡高于对照组(P＜0.05).结论 ABCE1特异性siRNA可明显抑制ABCE1基因转录和表达,并能有效诱导95-D细胞的凋亡,为下一步在体内利用Si-1重组质粒沉寂ABCE1基因,促肿瘤细胞的凋亡提供实验基础.     

E2F-1基因过表达对胃癌细胞动力学影响机制

目的:了解E2F-1过表达对胃癌细胞MGC-803增殖、生长和细胞周期的影响,并探讨E2F-1对胃癌细胞动力学影响的分子机制.方法:对稳定转染E2F-1的胃癌MGC-803/E2F-1细胞(实验组)、转染空载体的MGC-803/EV(阴性对照组)及未转染的MGC-803细胞进行MTT法检测,绘制生长曲线和计算细胞增殖率; 流式细胞仪检测各组细胞周期分布.提取各组细胞的总RNA,逆转录成cDNA,用荧光探针与含有21 522条人类基因表达谱芯片进行杂交.采用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,应用LuxScan 3.0图像分析软件对芯片图像进行处理和分析.结果:与两个对照组相比,胃癌MGC-803/E2F-1细胞的生长受到明显抑制,增殖率下降(26.61%±5.19% vs 93.4%±10.29%,100%±0.00%,均P <0.05); 细胞周期阻滞在G0/G1期.在检测的21 522条基因中,与细胞增殖、生长和细胞周期相关的差异性表达基因有20条,上调基因9条,下调基因11条.结论:E2F-1基因过表达抑制胃癌细胞的增殖和生长,细胞周期停滞在G0/G1期,其分子机制可能与筛选出来的20条差异表达基因有直接的关系.     

siRNA介导的E2F-1基因沉默对胃癌细胞MGC803中Rb蛋白表达水平的影响

目的应用RNA干扰技术研究E2F-1基因沉默在人胃癌MGC803细胞中对Rb蛋白表达的影响。方法将重组质粒E2F-1-siRNA转染MGC803细胞,筛选稳定株,利用RT-PCR检测转染前后细胞E2F-1mRNA表达水平,并通过蛋白免疫印记法(Western blot)检测各组细胞E2F-1蛋白的表达水平来验证质粒转入胃癌细胞的情况。采用Western blot检测三组细胞中总Rb蛋白和磷酸化Rb蛋白的表达情况,计算出非磷酸化Rb蛋白表达情况,统计各组间的差异。结果重组质粒E2F-1-siRNA成功转入胃癌细胞中;有效抑制了E2F-1 mRNA的表达,E2F-1蛋白水平显著下降,与阴性对照组及未转染组相比分别降低了83.2%和84.6%,去磷酸化Rb蛋白分别增加了61.22%(P0.05)和66.60%(P0.05),差异有统计学意义。结论沉默表达E2F-1基因后,可以有效降低Rb蛋白的水平,促进其活化形式去磷酸化Rb蛋白的产生。     

Bcl-2反义核酸对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响

目的观察Bcl-2反义核酸对胃癌细胞SGC-7901增殖及细胞周期的影响.方法利用转染Bd-2反义核酸的胃癌细胞antibcl-27901与SGC-7901细胞比较,MTT方法及流式细胞仪观察转导细胞的增殖能力和细胞周期.结果转染Bcl-2反义核酸使胃癌细胞增殖受抑,细胞周期未受影响.结论Bd-2反义核酸对胃癌细胞具有一定的抑瘤效应.     

阿托伐他汀调控MMP-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达对胃癌细胞增殖、周期和凋亡的影响

目的探讨阿托伐他汀对胃癌细胞增殖、周期和凋亡的影响及其机制。方法取对数生长期的胃癌SGC-7901细胞,加入终浓度为0、20、60和100μmol/L的阿托伐他汀,采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,Western blotting检测细胞中MMP-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果阿托伐他汀能够呈时间-浓度依赖性抑制SGC-7901细胞增殖;阿托伐他汀作用48 h后,G_0/G_1期细胞所占比例、细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3蛋白和Bax蛋白的表达浓度依赖性升高,S期细胞比例、G_2/M期细胞比例、MMP-9蛋白和Bcl-2蛋白浓度依赖性降低。结论阿托伐他汀能够抑制胃癌细胞增殖和诱导细胞凋亡,其作用机制可能与诱导细胞G_0/G_1期阻滞、上调Cleaved Caspase-3和Bax蛋白和下调MMP-9和Bcl-2蛋白有关。     

miR-215对胃癌细胞侵袭转移能力的影响及机制

目的探讨miR-215对胃癌细胞侵袭转移能力的影响及作用机制。方法通过RT-PCR检测miR-215在高转移胃癌细胞株NCIN87,BGC-823,RF-48及低转移细胞株HGC-27及MKN-28中的表达;Transwell迁移及侵袭实验检测miR-215抑制剂对胃癌细胞迁移及侵袭能力的影响;Western印迹检测miR-215抑制剂对胃癌细胞活化白细胞黏附分子(ALCAM),基质金属蛋白酶(MMP)-2,MMP-9,上皮细胞-间充质转化(EMT)相关蛋白E-钙黏附素(E-cadherin),波形蛋白(Vimentin)表达量的影响。结果 RT-PCR结果证实miR-215在高转移胃癌细胞株中的表达高于低转移胃癌细胞中的表达,且miR-215在BGC-823细胞中的表达最高,因此选用BGC-823作为后续实验细胞株。miR-215抑制剂转染BGC-823细胞48 h后,发现下调miR-215表达能显著抑制BGC-823细胞迁移及侵袭能力,并能下调ALCAM,MMP-2,MMP-9及Vimentin表达,上调E-cadherin表达。结论miR-215低表达能显著抑制胃癌细胞BGC-823侵袭及转移能力,与下调MMPs及抑制EMT生成有关。     

CD147基因沉默对甲状腺乳头状癌细胞中VEGF-C表达的影响

目的观察CD147基因沉默对甲状腺乳头状癌细胞株K1中血管内皮生长因子C（VEGF-C）表达的影响,筛选有效的小干扰RNA（siRNA）序列。方法设计合成3对不同的CD147 siRNA,分别转染人K1为实验组（S1、S2、S3组）,同时设不加干预者为正常组,siRNA阴性对照进行干预为阴性对照组。RT-PCR、ELISA法分别测定各组CD147 mRNA及其蛋白。筛选能有效沉默CD147 mRNA及其蛋白的siRNA序列。RT-PCR、Western blot法分别测定CD147表达沉默后K1细胞中的VEGF-C mRNA及其蛋白。结果 S1组CD147 mRNA及其蛋白表达量与正常组、阴性对照组相比,P均〉0.05。S2、S3组与正常组、阴性对照组相比,P均〈0.05。S2、S3组的siRNA序列可有效沉默CD147的表达而S1组不能。S2、S3组CD147 mRNA的表达抑制率分别为67.8%和72.5%;CD147蛋白表达抑制率为31.7%和35.4%。S2、S3组K1细胞中VEGF-C mRNA表达抑制率分别为66.4%和56.6%;其蛋白表达抑制率分别为51.9%和41.6%。结论筛选出了能有效沉默CD147基因表达的siRNA序列。CD147基因沉默后可降低K1细胞中VEGF-C的表达,可能影响肿瘤细胞的淋巴结转移能力。     

白毛夏枯草水提取物对胃癌细胞增殖、凋亡的影响

目的 分析白毛夏枯草水提取物对胃癌BGC823细胞增殖、凋亡的影响。方法 分别采用0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/ml的白毛夏枯草水提取物处理BGC823细胞,未做处理的BGC823细胞作为对照组,采用CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell小室检测细胞迁移、侵袭,Western印迹检测基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、凋亡蛋白B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、髓细胞白血病因子(Mcl)-1及剪切的半胱天冬氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase)-3蛋白水平。结果 随着白毛夏枯草水提取物浓度的增加,BGC823细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、Bax及Cleaved Caspase-3蛋白水平依次显著升高,BGC823细胞迁移数、侵袭数、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Mcl-1蛋白水平依次显著下降,均呈浓度依赖性(P<0.05)。结论 白毛夏枯草水提取物可抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭能力,促进胃癌细胞凋亡。