大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经细胞样细胞分化

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)离体分离和培养方法,探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、全反式维甲酸(RA)、骨形态发生蛋白-7(BMP-7)在体外诱导BMSCs向神经干细胞(NSCs)分化的作用.方法 采用出生4周SD大鼠的全骨髓细胞进行培养,传至第3代时,分为3组:A组,bFGF EGF RA进行诱导分化;B组,BMP-7进行诱导分化;C组,不加因子继续培养.在倒置显微镜下每日观察、记录BMSCs的诱导分化情况,并应用免疫组化技术对细胞进行兔抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)单抗鉴定.结果 A组诱导7 d后有部分细胞具备神经元样细胞形态,胞体呈锥形或圆形,有较长单极或多极的突起,有NSE阳性细胞表达.而B组、C组细胞仍为典型的成纤维细胞形态,无NSE阳性细胞.结论 bFGF、EGF和RA可以联合诱导BMSCs向NSCs分化,并可调控神经元分化,而BMP-7在此种诱导条件下未见明显的诱导BMSCs向NSCs分化的作用.     

人骨髓间充质干细胞诱导成软骨细胞过程中免疫原性改变的实验研究

目的 探讨人骨髓来源间充质干细胞（BMSCs）诱导分化成软骨细胞过程中协同刺激分子的表达及其对细胞免疫原性改变的影响。方法 用密度梯度离心法分离骨髓,体外培养BMSCs,经形态学观察、流式细胞仪鉴定后诱导成软骨样细胞,用流式检测细胞表面协同刺激分子的表达情况;将未分化的BMSCs及诱导后的成软骨样细胞分别与T细胞共培养,采用3H-TdR法检测T细胞的增殖情况。结果 人BMSCs不表达或低表达协同刺激分子CD28、CD80、CD83、CD86,抑制T细胞增殖;而诱导后的成软骨细胞上调表达CD28、CD80、CD83、CD86,并促进T细胞增殖。结论 人BMSCs对T细胞增殖有抑制作用;而诱导后的成软骨细胞免疫原性增强,促进T细胞增殖。     

新型生物活性复合材料RGD-PLGA/HA体外细胞相容性的实验研究

目的研究新型多孔多肽聚乳酸乙醇酸/羟基磷灰石(RGD-PLGA/HA)支架材料的体外细胞相容性。方法采用贴壁法对兔骨髓基质细胞(BMSCs)进行体外矿化诱导培养,扩增后与实验A组(RGD-PLGA/HA)、实验B组(PLGA/HA)分别进行体外复合培养,并通过定性及定量法检测BMSCs在材料表面的黏附能力、增殖活力,验证细胞材料复合体的成骨活性。结果兔BMSCs在每组材料的表面均能生长,经体外诱导后在支架材料的表面形成钙结节,实验A组细胞的黏附及增殖能力均强于实验B组。结论兔BMSCs与新型多孔RGD-PLGA/HA支架材料有良好的相容性。     

重组hCDMP1腺病毒转染骨髓间充质干细胞对其向软骨分化的影响

目的探讨人软骨源性形态发生蛋白1(CDMP1)基因转染对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及分化的影响。方法采用腺病毒转染方法将重组人CDMP1(hCDMP1)基因转入体外培养的兔BMSCs,用免疫印迹法(Western blot)检测hCDMP1蛋白质的表达,并通过检测细胞增殖能力(MTT法)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)以及蛋白多糖的表达,分析转染hCDMP1对BMsCs增殖、分化的影响。结果 hCDMP1蛋白在基因转染细胞内得到正确表达;hCDMP1基因转染组和对照组相比,ColⅡ、蛋白多糖表达水平显著增高(P<0.05),而细胞增殖能力无明显变化(P>0.05)。结论外源基因转染可以使BMSCs表达有生物活性的hC-DMP1,高表达的hCDMP1可以促进BMSCs向软骨表型分化,但对细胞增殖无明显影响。     

透明质酸水凝胶体外促进骨髓间充质干细胞神经分化的研究

目的观察以透明质酸(hyaluronic acid,HA)水凝胶作细胞支架,骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在HA水凝胶中的生长、增殖和分化情况,探讨HA水凝胶支持、促进BMSCs分化为神经元细胞的作用。方法采用Percoll法从SD雄鼠的骨髓中分离纯化BMSCs,传代培养,倒置显微镜观察BMSCs的生长情况和形态变化。各组以不同的方法诱导BMSCs分化。采用免疫细胞化学法检测各组BMSCs在相应时间点神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝蛋白(NF)及巢蛋白(nestin)的阳性细胞数。RT-PCR检测各组BMSCs相应时间点的NSE mRNA、NF mRNA和nestin mRNA表达。结果传代后BMSCs形似纤维细胞。诱导后,HA水凝胶组(A组)和脑组织提取液组(B组)BMSCs分化为神经元样细胞:A组细胞黏附在HA水凝胶表面,长出较多突起和分支;B组细胞出现突起及少量分支。诱导后A组和B组NSE、NF阳性细胞增多(P<0.05)。诱导2d后及7d后A组和B组nestin阳性细胞均增多:2d后,A组高于B组(P<0.05);7d后,A组低于B组(P<0.05)。诱导7d后A组和B组的NSE mRNA、NF mRNA表达均增加,A组增加明显(P<0.05)。诱导2d后A组和B组的nestin mRNA表达增加,A组更显著(P<0.05);7d后A组和B组的nestin mRNA表达则降低,A组更明显(P<0.05)。结论 HA水凝胶有利于BMSCs的黏附,为BMSCs生长、增殖和分化提供了结构支持和适宜的微环境,促使BMSCs向神经元细胞分化、增殖并表达神经元特异性蛋白。     

维甲酸和甲状腺激素在骨髓间充质干细胞软骨分化中的作用

目的 探讨甲状腺素(thyroxine, T3)和维甲酸(retinoic acid, RA)对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)软骨形成的影响。方法 在3种条件培养基中培养和诱导猪BMSCs成软骨分化：对照组使用软骨生成培养基(含10^-7 mol/L地塞米松和10 ng/mL转化生长因子β1),RA组采用软骨生成培养基加1μmol/L RA,T3组采用软骨生成培养基加100 nmol/L T3。采用MTT法单层检测BMSCs的增殖情况。收获第3代BMSCs,离心形成细胞颗粒,分为3组分别进行软骨细胞诱导。4周后采集3组的细胞颗粒,通过组织学染色和半定量基因表达分析进行软骨形成评估。结果 T3组BMSCs增殖高于对照组(P<0.05);RA组BMSCs增殖低于对照组(P<0.05);对照组BMSCs颗粒中观察到软骨特征的类腔隙结构和甲苯胺蓝阳性染色,RA组未见;RA组软骨发生标志基因ColⅡ、蛋白聚糖(aggrecan)和Sox9的表达与对照组相比显著降低,而肥大标志基因ColX的表达...     

改良全骨髓贴壁法分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞

目的 建立简单、优化的分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法，为组织工程支架研究提供细胞基础。方法 分别采用常规和改良的全骨髓贴壁法分离和培养BMSCs。常规法按照传统全骨髓贴壁法，对骨髓冲洗液进行过筛和离心处理后加入完全培养基进行培养。在改良全骨髓贴壁法中，将骨髓冲出骨髓腔后直接加入完全培养基进行培养。倒置相差显微镜下观察两组细胞形态，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法比较两组BMSCs的增殖活性，流式细胞术检测表面标志物CD90、CD29、CD11b/c、CD45。对改良法培养的BMSCs进行定向诱导成骨及成脂分化，并通过茜素红染色检测其成骨分化潜能，通过油红O染色检测其成脂分化潜能。结果 改良全骨髓贴壁法培养的BMSCs形态均一，细胞集簇排列呈“鱼群状”“漩涡状”。改良法比常规法培养的BMSCs增殖活性强(P<0.05)。改良法与常规法培养的BMSCs均高表达CD90和CD29,低表达CD11b/c和CD45。改良法培养的BMSCs成骨、成脂诱导分化后茜素红染色和油红O染色均为阳性。结论 改良全骨髓贴壁法可成功分离并培养BMSCs,培养的BMSCs具有多向分化潜...     

低氧预处理对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖、凋亡和坏死的影响

 目的 探讨低氧预处理对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖、凋亡和坏死的影响及其可能机制。方法 采用全骨髓细胞贴壁法分离培养BMSCs,通过细胞成脂、成骨分化诱导及流式细胞仪检测其表面标志物(CD29、CD90、CD45)鉴定BMSCs;运用siRNA干扰技术沉默低氧诱导因子 1α(hypoxia inducible factor,HIF 1α)基因。将细胞分成6组:正常培养组、正常培养+转染阴性对照组、正常培养+HIF 1α RNA干扰组、低氧预处理组、低氧培养+转染阴性对照组及低氧培养+HIF 1α RNA干扰组,分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞仪和乳酸脱氢酶(lactic acid dehydrogenase,LDH)活力测定等方法,检测各组BMSCs的增殖、凋亡和坏死情况;Western blot和real time PCR 检测各组BMSCs中HIF 1α、葡萄糖转运子 1(glucose transporter,GLUT 1)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的mRNA和蛋白的表达。 结果 培养的BMSCs具有成脂、成骨等多向分化潜能;流式检测呈现CD29和CD90高表达,CD45低表达;低氧预处理可促进BMSCs增殖,减轻坏死,对细胞凋亡无明显影响;低氧预处理组HIF 1α、GLUT 1及VEGF的蛋白及mRNA表达明显高于常氧培养组(P<0.05);给予低氧预处理组siRNA HIF 1α后其HIF 1α、GLUT 1及VEGF的蛋白及mRNA表达均明显低于未干扰前(P<0.05),且细胞增殖受抑制,细胞凋亡和坏死加重(与未干扰前相比,P<0.05)。 结论 低氧预处理可促进BMSCs的体外增殖,减轻坏死,其机制可能与低氧预处理后HIF 1α表达增加及上调其下游基因GLUT 1和VEGF表达有关。     

骨髓间充质干细胞建立的成骨细胞培养模型的研究

目的：为骨折骨缺损治疗的基础实验研究建立理想的细胞模型,观察兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体外培养状态下的生长情况,对其向成骨细胞分化及分化能力进行研究.方法：采用全骨髓密度梯度离心法联合差速贴壁法从兔股骨骨髓中提取、分离、纯化BMSCs,取第3代BMSCs细胞分为两组进行培养,A组：为用含有诱导剂的低糖DMEM培养基的诱导培养组;B组：为常规培养组.倒置显微镜及HE染色观察记录各代次细胞形态等特征;CD44,CD90检测细胞表形,通过碱性磷酸酶（ALP）染色及标准化钙结节计数,鉴定细胞成骨活性.结果：兔骨髓间充质干细胞生长状态良好,培养7 d后各组细胞形态趋于一致,多呈长梭形,培养2 wk后对两组细胞进行ALP染色,可见A组细胞质内ALP染色阳性反应明显,B组染色显色弱.21 d时A组细胞茜素红染色后钙化结节数量多且较大,B组有少量钙结节形成,但较小.A组标准化钙结节计数显著高于B组差异具有显著统计学意义（P〈0.05）.结论：通过密度梯度离心法联合差速贴壁法所获得的BMSCs在常规培养或诱导培养时均可表现出成骨潜能,但诱导培养组的BMSCs的ALP活性更强,成骨能力更确切,可为骨组织工程远期实验研究提供理想的细胞模型.     

SDF-1促进BMSCs向血管内皮细胞分化

目的 探究基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)对人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)分化的作用.方法 BMSCs分为空白组(A组);实验组:10、25、50 ng/mL SDF-1组(B1、B2、B3组),25 ng/mL VEGF+ 25 ng/mL SDF-1组(B4组);对照组:25、50 ng/mL VEGF组(C1、C2组),在添加相应细胞因子的无血清培养基中诱导12 d.免疫组织化学检测诱导后BMSCs的血小板内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecules,PECAM-1即CD31)、血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)表达情况.实时荧光定量PCR检测vWF、CD31、血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule,VCAM-1)、血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,KDR)、血管内皮钙粘蛋白(VE-cadherin,VE)的表达.结果 B4组KDR、VE、vWF、CD31、VCAM-1表达及CD31、vWF阳性率分别较B1、B2、B3组显著升高(P＜0.01);B4组VE、vWF表达较C1组显著升高(P＜0.01),且vWF阳性率较C1组也显著升高(P＜0.01);B4组KDR、CD31、VCAM-1表达及CD31阳性率较C2组显著升高(P＜0.01),且CD31阳性率较C2组也显著升高(P＜0.01).结论 SDF-1对BMSCs向VEC分化起促进作用,联合使用SDF-1和VEGF可以更好地促进BMSCs向VECs分化.     

HGF和1,25-(OH)2VitD3对兔骨髓基质干细胞成骨活性的联合诱导

目的 观察肝细胞生长因子(HGF)和1,25-(OH)2VitD3 对兔骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)成骨活性的诱导作用.方法 采用HGF和1,25-(OH)2VitD3 联合诱导兔BMSCs后检测其碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性、骨钙素和胶原蛋白I、II的含量并观察其成骨分化特性的变化.结果 HGF和1,25-(OH)2VitD3 联合诱导的兔BMSCs的ALP活性、骨钙素水平和胶原蛋白I、II在细胞中表达水平均明显高于对照组细胞.结论 HGF和1,25-(OH)2VitD3联合诱导作用可以促使兔BMSCs明显表现出成骨分化特性.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化

目的 对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)进行分离培养与鉴定,并使其诱导分化为神经细胞.方法 采用密度梯度离心和贴壁培养相结合的方法分离培养BMSCs,观察细胞形态变化及生长、增殖情况;对细胞进行表面标志物CD14、CD34、CD44、CD29免疫荧光染色及向骨、软骨和脂肪分化能力的鉴定;选用第3代细胞,经全反式维甲酸(retinoic acid,RA)和脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophy factor,BDNF)联合诱导后,免疫荧光染色检测神经前体细胞标记物Nestin及神经细胞标记物NSE的表达情况.结果 体外培养的BMSCs呈成纤维细胞样,CD44和CD29的阳性率在90%以上,具有明显的向骨、软骨和脂肪分化的能力,经诱导后可分化为神经细胞.结论 成功建立了体外分离扩增BMSCs的培养体系,所获得的细胞纯度高、生物学特征稳定,并可在体外诱导分化为神经细胞,从而为下一步细胞移植治疗脑缺血动物模型提供种子细胞.     

HGF和1,25-(OH)2VitD3对兔骨髓基质干细胞成骨活性的联合诱导

目的观察肝细胞生长因子(HGF)和1,25-(OH)2VitD3对兔骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)成骨活性的诱导作用。方法采用HGF和1,25-(OH)2VitD3联合诱导兔BMSCs后检测其碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、骨钙素和胶原蛋白I、II的含量并观察其成骨分化特性的变化。结果HGF和1,25-(OH)2VitD3联合诱导的兔BMSCs的ALP活性、骨钙素水平和胶原蛋白I、II在细胞中表达水平均明显高于对照组细胞。结论HGF和1,25-(OH)2VitD3联合诱导作用可以促使兔BMSCs明显表现出成骨分化特性。     

精脒对衰老兔骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制研究

背景 研究发现衰老兔骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨分化能力减弱,而精脒(Spermidine)对衰老相关疾病具有保护作用.目的 探讨精脒对衰老兔骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其作用机制.方法 复苏BMSCs并将其分为3组:对照组(Vehicle,培养基中不加入药物),D-半乳糖诱导衰老组(D-gal,培养基中加入40 g/L D-gal诱导BMSCs衰老),Spermidine干预组(Spermidine,培养基中加入40 g/L D-gal + 3 μmol/L Spermidine处理BMSCs).试剂盒检测细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)与还原型NAD+(NADH)比例,MTT法检测细胞增殖活性.成骨诱导培养后,Western blot检测Sirt1蛋白的表达,qPCR检测成骨相关基因的转录水平.结果 与Vehicle组相比,D-gal组细胞内NAD+/NADH比例降低,BMSCs增殖减弱(P<0.05);Spermidine可提高细胞内NAD+/NADH比例并促进BMSCs增殖(P<0.05).成骨诱导培养后,D-gal抑制Sirt1表达并下调成骨相关基因Runx2、Osx和ALP的转录表达(P<0.05);而Spermidine可上调Runx2、Osx和ALP的转录表达(P<0.05).当采用siRNA抑制Sirt1表达后,Spermidine上调成骨相关基因转录表达的作用明显减弱(P<0.05).结论 Spermidine可通过激活Sirt1促进衰老兔BMSCs成骨分化.     

miRNA-29b调控骨髓间充质干细胞来源的软骨细胞肥大化的作用研究

目的 探讨miR-29b在骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化为软骨细胞时,对细胞肥大化进程的调控作用.方法 培养BMSCs并进行软骨细胞肥大化方向的诱导,检测软骨细胞标志基因Ⅱ型胶原(ColⅡ)、肥大化细胞标志基因X型胶原(Col X和Runx2),并用特异性染色法确定细胞肥大化诱导成功,再检测miR-29b在转录水平的表达情况.然后将实验分为miR-29b过表达(miR-29b mimics)和miR-29b抑制(miR-29b抑制剂)两组,每组分别设置空白对照组,分别检测两处理组中上述软骨细胞和肥大化细胞相关标志的表达变化.结果 miR-29b过表达组中,ColⅡ表达与对照组相比显著降低(P＜0.05),Col X和Runx2表达显著升高(P＜0.05);而miR-29b抑制组中,ColⅡ的表达与对照组相比显著升高(P＜0.05),Col X和Runx2显著降低(P＜0.05).结论 miR-29可以有效促进BMSCs向肥大化的软骨细胞分化,而抑制miR-29b可降低BMSCs来源的软骨细胞的肥大化.     

BMP-2体外诱导OPG-/-小鼠BMSCs向成骨方向分化的实验研究

目的 探讨骨形成蛋白-2(BMP-2)对OPG-/-小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外定向诱导成骨的能力,评价BMP-2活性多肽的成骨诱导性及诱导成骨的剂量依赖性.方法 取OPG-/-小鼠股骨,分离骨髓基质细胞进行体外培养,传至P1代时改用条件培养基,在15％FBS培养条件下培养基中分别加入浓度为0.3 μg、0.2 μg、0.1 μg、0.05 μg、0μg的BMP-2,并依次记为A、B、C、D和E组.细胞培养至1、3、5、7d,PNPP法测定碱性磷酸酶(ALP)、钙试剂盒测定细胞钙含量、酶联免疫法测定细胞上清中抗酒石酸酸性膦酸酶5b(TRACP5b)的表达,检测不同浓度BMP-2活性多肽体外诱导成骨的能力.结果 ALP活性和钙含量检测显示,A组和B组较其他组增加明显(P＜0.05),但A、B组间比较差异无统计学意义( P＞0.05).TRACP5b检测显示,A、B、C组第3、5和7日TRACP5b表达均低于D、E组(P＜0.05),但A和B组差异不显著(P＞0.05).结论 BMP-2活性多肽能有效地促进OPG-/-小鼠BMSCs向成骨方向分化,其诱导作用存在剂量依赖关系,最佳诱导剂量为0.2 μg/ml.     

VEGF对兔骨髓基质干细胞成骨诱导及成骨细胞分化与增殖影响的体外研究

目的探讨体外条件下成骨诱导剂和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的联合应用对兔骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)成骨分化过程中细胞增殖和分化的影响,为骨组织工程研究提供实验基础。方法取2月龄新西兰大耳白兔,麻醉后抽取股骨骨髓进行BMSCs原代细胞培养,取生长良好的第三代BMSCs进行分组培养。空白组:完全培养基培养;对照组:完全培养基中加入成骨诱导剂;实验组:完全培养基中加入成骨诱导剂及VEGF(10ng/ml)。MTT法检测诱导BMSCs成骨分化过程中细胞生长与增殖情况并绘制生长曲线;倒置相差显微镜、光学显微镜及扫描电镜观察诱导BMSCs成骨分化过程细胞的形态特征;茜素红(Alizarin Red S,ARS)染色鉴定钙结节;碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)染色、ALP活性及RT-PCR检测I型胶原(Collagen typeⅠ,colⅠ)mRNA表达;免疫组化染色检测诱导后细胞中VEGF蛋白表达情况。结果 1诱导BMSCs向成骨细胞分化后细胞呈圆形或多边型,短柱状或立方形,细胞表面有短的突起与相邻细胞连接。2茜素红染色光学显微镜下可见实验组和对照组均有散在的红色团块即钙结节。3二组中ALP染色均可见细胞浆内有黑色的碱性磷酸酶颗粒,但实验组ALP染色阳性细胞数多于对照组(P<0.05)。4诱导培养的成骨细胞ALP活性测定实验组和对照组ALP活性早期较低,以后逐渐增高,第四天起,实验组明显高于对照组(P<0.05)。5MTT法检测细胞增殖状态,实验组细胞增殖速度高于对照组,6~8d细胞增殖速度加快,二组比较差异有统计学意义(P<0.05)。6RT-PCR检测成骨细胞colⅠmRNA表达,诱导后实验组和对照组均可见colⅠmRNA表达,实验组colⅠmRNA的表达强度高于对照组。7免疫组化染色显示BMSCs的VEGF蛋白呈阴性表达,而诱导分化后的成骨细胞实验组与对照组均可见有VEGF蛋白表达且实验组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 1BMSCs在成骨诱导剂作用下可向成骨细胞诱导,成为骨组织工程中理想的种子细胞。2 VEGF可促进成骨细胞的增殖和分化,当与成骨细胞诱导剂联合应用时,能够提高成骨细胞的增殖能力、增强成骨细胞的ALP活性,二者的协同作用共同促进了BMSCs向成骨细胞的增殖和分化,将有望提高骨缺损修复的治疗效果。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养鉴定以及向神经干细胞分化的实验研究

目的:体外培养并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),研究其生物学特性,初步探索酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF)诱导其向神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化的可行性。方法:全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠BMSCs,倒置相差显微镜观察其形态特征,MTT法绘制生长曲线,流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测定细胞周期并鉴定细胞表面标志物。用80 ng/ml aFGF的无血清DMEM/F12培养液诱导大鼠BMSCs向NSCs分化,镜下观察细胞形态特征,免疫荧光染色方法检测神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)的表达。结果:大鼠BMSCs贴壁生长,呈梭形,多角形。第1、3、5代BMSCs的生长曲线均呈S形,活性无明显差异。细胞周期显示94.34%BMSCs处于G0/G1期,有较强的分裂增殖能力。FCM检测CD29、CD54、CD90表达阳性,CD45表达阴性。诱导6 h后细胞的胞体收缩成椭圆形或球形并伸出细长突起,免疫荧光染色显示Nestin表达阳性,继续诱导发现双极和多极细胞增多,诱导6 d后相互连接成网状,成典型的神经元样细胞,NSE表达阳性。结论:全骨髓贴壁培养法能培养出高纯度的BMSCs,细胞生长稳定、增殖快、可多次传代,具有干细胞特性。经aFGF诱导后具有向NSCs分化的潜能,NSCs能进一步分化为神经元样细胞。     

内皮祖细胞条件培养基对间充质干细胞增殖和成骨分化的影响及其机制

目的:探讨小鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)条件培养基(CM) 对同源间充质干细胞(MSCs)增殖和成骨分化功能的影响,并阐明其作用机制。方法:小鼠骨髓细胞经差速贴壁法结合专用培养基分别培养扩增MSCs和EPCs,采用流式细胞术(FCM)检测MSCs和EPCs表面标记物,以成骨、成脂和成软骨诱导分化对MSCs进行功能鉴定,以成血管对EPCs进行功能鉴定。将MSCs分为0% EPCs-CM组(对照组,采用LG-DMEM培养)、50% EPCs-CM组(采用50% EPCs-CM+50% LG-DMEM培养)和100% EPCs-CM 组(采用100% EPCs-CM培养)。采用MTT比色法检测各组MSCs的增殖活性;采用茜素红染色检测各组MSCs的成骨分化能力。结果:FCM法检测,第3代MSCs高表达Sca-1、CD29, 低表达CD45、CD11b;经诱导可向成骨、成软骨和成脂方向分化。第3代EPCs 高表达CD34、CD133和VEGFR2;在铺有基质胶的96孔培养板中可形成血管样结构。与对照组比较,50% EPCs-CM组和100% EPCs-CM组MSCs增殖活性明显增加,且呈浓度依赖性(P<0.05)。茜草色素红染色法检测,培养21 d后50%和100% EPCs-CM组MSCs的钙结节数量和钙盐沉积均高于对照组(P<0.05)。结论:利用差速贴壁法可同时分离MSCs和EPCs,EPCs-CM能促进MSCs 的增殖和成骨分化。     

骨髓基质细胞体外诱导分化移植治疗大鼠脊髓损伤的研究

目的 探讨大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)在体外由碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、全反式维甲酸(RA)联合诱导下分化成的神经细胞样细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的可行性.方法 采用出生4周SD大鼠的全骨髓细胞进行培养,利用bFGF+EGF+RA在体外诱导BMSCs向神经细胞样细胞分化.在倒置相差显微镜下每日观察、记录BMSCs的诱导分化情况,并应用免疫组化技术对细胞进行兔抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)单克隆抗体鉴定.实验动物分为3组:细胞移植组(A组)、模型对照组(B组)、正常对照组(C组).A、B组采用改良Allens法建立大鼠急性脊髓损伤模型.A组在造模后立即将诱导后的BMSCs悬液多点缓慢注入到损伤节段的头侧和尾侧,B组同法注射等量磷酸盐缓冲液.C组不造模,于相同部位注射等量磷酸盐缓冲液.于伤后1～5周,按照BBB法观察脊髓神经功能恢复情况并处死动物取材,用HE染色观察脊髓病理变化.结果 诱导7 d后有部分细胞具备神经元样细胞形态,胞体呈锥形或圆形,有较长单极或多极的突起,有NSE阳性细胞表达;细胞移植后1～5周,A、B组动物运动功能均有不同程度恢复,但B组恢复较慢,BBB评分差异有统计学意义(P<0.05);组织形态学观察示A组损伤脊髓恢复较好.结论 bFGF、EGF和RA可以联合诱导BMSCs向神经干细胞分化,并可调控神经元分化,将其移植于大鼠脊髓损伤区,可促进脊髓损伤的恢复.