激活的肺动脉成纤维细胞Piezo1通道通过活化p38-MAPK促进IL-6分泌诱发肺动脉高压的研究

目的 利用大鼠肺动脉成纤维细胞探讨机械敏感Piezo1通道与IL-6分泌的关系,分析Piezo1通道在肺动脉高压（PAH）发展过程中的作用机制。方法 利用组织块法获取成年SD大鼠肺动脉组织并分离培养肺动脉成纤维细胞;将细胞分为对照组和流体剪切力组,用流体剪切力系统在12 dyn/cm2条件下培养流体剪切力组细胞24 h,对照组不做额外处理;利用Western blot和PCR技术分别检测对照组和流体剪切力组细胞Piezo1蛋白和mRNA水平;将肺动脉成纤维细胞分为PBS组、Yoda1组和Yoda1+Dooku1组并分别加入10 μM PBS、Yoda1和Yoda1+Dooku1培养24 h,24 h后利用检测各组细胞IL-6蛋白和mRNA水平;取Yoda1组细胞分为PBS组、ERK抑制剂组、JNK抑制剂组和p38MAPK抑制剂组分别加入PBS、ERK抑制剂(PD98059,10 μM)、JNK抑制剂（SP600125,10 μM）和p38 MAPK抑制剂（SB203580,5 μM）,培养24 h后检测IL-6 mRNA水平;在PBS组、Yoda1组和Yoda1+Dooku1组细胞进行对应处理10 min后检测磷酸化p38 MAPK蛋白水平。结果 成功分离培养大鼠肺动脉成纤维细胞;12 dyn/cm2流体剪切力环境培养24 h后,相较于对照组,流体剪切力组细胞中Piezo1蛋白和mRNA水平均显著升高（P＜0.05）。PBS组、Yoda1组和Yoda1+Dooku1组细胞培养24 h后,相较于PBS组和Yoda1+Dooku1组,Yoda1组细胞IL-6蛋白和mRNA水平均显著增高（P＜0.05）,相较于PBS组,Yoda1+Dooku1组细胞IL-6蛋白和mRNA水平差异无统计学意义（P＞0.05）。相较于PBS组、ERK抑制剂组和JNK抑制剂组,p38 MAPK抑制剂组IL-6 mRNA水平受到抑制而显著降低（P＜0.05）,但PBS组、ERK抑制剂组和JNK抑制剂组IL-6 mRNA水平两两相比差异均无统计学意义（P＞0.05）。PBS组、Yoda1组和Yoda1+Dooku1组细胞培养10 min后各组磷酸化p38 MAPK水平显示,相较于PBS组,Yoda1组磷酸化p38水平显著升高（P＜0.05）,而Yoda1+Dooku1组磷酸化p38水平差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 血管内流体剪切力改变可上调并激活肺动脉成纤维细胞Piezo1的表达,介导Ca2+ 内流活化p38 MAPK通路促进IL-6的分泌,进一步导致血管重塑,加快PAH进程     

microRNA-494通过TLR-4通路抑制成骨细胞分化及基质矿化的分子机制

目的探讨microRNA-494(miR-494)通过Toll样受体-4(TLR-4)通路抑制成骨细胞分化及基质矿化的分子机制。方法选用小鼠成骨细胞株MC3T3-E1作为体外模型,采用miR-494 mimic转染小鼠成骨细胞株MC3T3-E1,采用qRT-PCR法测定miR-494在小鼠成骨细胞株MC3T3-E1转染前后的表达情况;通过MTT法检测转染前后小鼠成骨细胞株MC3T3-E1的增殖情况;通过测定碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,研究小鼠成骨细胞株MC3T3-E1的分化情况;通过骨钙素(osteocalcin,OC)定量检测分析和Von Kossa钙化染色检测小鼠成骨细胞株MC3T3-E1的基质矿化情况;通过Western blot等检测转染前后TLR-4蛋白的表达差异。结果 qRT-PCR测定结果显示,与阴性对照组相比,小鼠成骨细胞株MC3T3-E1转染后的miR-494的mRNA的表达量升高(P0.05),说明miR-494 mimic转染小鼠成骨细胞株MC3T3-E1,成功使miR-494过表达。与阴性对照组相比,经过miR-494 mimic转染后,小鼠成骨细胞株MC3T3-E1的增殖能力受到抑制(P0.05)。转染后的小鼠成骨细胞株MC3T3-E1中ALP的活性降低(P0.05)。同时,转染后的小鼠成骨细胞株MC3T3-E1中OC的活性显著降低(P0.05),矿化结节的数目、减少(P0.05)。Western blot结果显示,与阴性对照组相比,miR-494 mimic转染组细胞中的TLR-4蛋白表达量显著升高(P0.05)。结论 miR-494能够通过TLR-4通路抑制小鼠成骨细胞株MC3T3-E1的增殖活力,降低细胞中ALP、OC的活力,减少成骨细胞中的矿化结节数,抑制成骨细胞分化及基质矿化。     

磷酸肌酸对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化及矿化的影响

目的 探讨磷酸肌酸(phosphocreatine,PCr)对体外培养的小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的增殖、成骨分化及矿化的影响.方法 在体外培养的MC3T3-E1细胞中,分别加入含不同浓度(5,10,20 mmol·L-1)的PCr进行培养,并以不给予PCr药物处理的组为空白对照组.采用MTT法检测MC3T3-E1细胞的增殖情况;使用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性试剂盒检测MC3T3-E1细胞内ALP的活性;采用Western Blot法检测MC3T3-E1细胞内ALP、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)的蛋白表达情况;利用茜素红染色法检测MC3T3-E1细胞形成矿化的能力.结果 PCr可以促进MC3T3-E1细胞的增殖且具时间依赖性,当处理12 h时,PCr对细胞无明显促增殖作用(P＞0.05);然而当处理48 h时,PCr(5,10,20mmol·L-1)对细胞的促增殖作用可分别达到137％、146％、153％.PCr(10,20 mmol·L-1)使MC3T3-E1细胞内ALP的活性分别增加到空白对照组的1.37和2.14倍(P ＜0.05,P＜0.01),并且显著上调ALP蛋白表达(P＜0.01,P＜0.01).PCr(5,10,20 mmol·L-1)还可明显上调MC3T3-E1细胞内BMP-2的蛋白表达(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01),并使MC3T3-E1细胞形成的矿化结节数增加(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001).结论 PCr可以促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化与矿化,具有促成骨作用.     

还原型谷胱甘肽上调β-catenin蛋白表达促进MC3T3-E1细胞成骨分化

目的:探讨还原型谷胱甘肽(GST)对小鼠成骨细胞MC3T3-E1成骨分化的影响,并从Wnt/β-catenin信号通路角度初步探讨其可能的机制。方法:通过碱性磷酸酶(ALP)染色以及细胞外钙化结节来检测成骨细胞MC3T3-E1的分化情况;GST干预MC3T3-E1成骨细胞株7 d、14 d和21 d后,利用Real-time PCR检测成骨相关因子RUNX2、OSX、COLⅠ、OCN基因及Wnt/β-catenin信号通路相关基因β-catenin、LRP5和GSK-3β的表达;通过Western blot检测β-catenin蛋白表达。结果:ALP染色观察到MC3T3-E1细胞外基质存在钙质沉积,且MC3T3-E1 ALP活性阳性。GST能明显提高MC3T3-E1细胞成骨相关基因以及Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达。Western blot结果提示GST可以明显促进β-catenin蛋白的表达。结论:MC3T3-E1细胞本身具有一定的成骨细胞特性,有效浓度的GST能促进小鼠MC3T3-E1细胞成骨分化,Wnt/β-catenin信号转导通路在成骨分化过程中起一定的调节作用。     

多西环素通过MEK/ERK信号通路促进MC3T3-E1细胞株体外成骨分化

目的：研究在体外条件下多西环素（doxycycline,DOX）对前成骨细胞株MC3T3-E1成骨分化的影响及可能机制。方法：在成骨诱导剂体外诱导MC3T3-E1细胞株成骨分化条件下，茜素红染色检测成骨细胞分化；实时定量PCR检测DOX对MC3T3-E1细胞相关成骨基因OCN、Runx2的影响；用DOX、MEK抑制剂（U0126）单独或联合处理MC3T3-E1细胞后，Western blot检测N-cadherin、p-MEK及p-ERK等蛋白的表达。结果：在MC3T3-E1细胞株体外成骨诱导分化中，加入DOX可以增强茜素红染色阳性率。DOX上调MC3T3-E1细胞相关成骨基因OCN、Runx2的表达。DOX处理MC3T3-E1细胞后，其N-cadherin蛋白表达水平下降（P <0.05）,p-MEK和p-ERK蛋白的表达增加（P <0.05）。而MEK拮抗剂（U0126）则显著上调N-cadherin蛋白表达水平，同时降低p-MEK、p-ERK水平。用U0126联合DOX处理MC3T3-E1细胞后，DOX对N-cadherin、p-MEK和p-ERK蛋白水平的影响可被U...     

晚期糖基化终产物通过调控F-actin/YAP抑制MC3T3-E1细胞成骨分化

目的：研究晚期糖基化终产物(AGEs)对小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1增殖和分化的影响及其作用机制。方法：用不同浓度AGEs作用于MC3T3-E1细胞,采用CCK8法和流式细胞仪分别检测细胞增殖和凋亡,碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase,ALP) 染色检测钙盐沉积,real-time PCR检测OCN、ALP和Runx2的mRNA表达,real-time PCR和蛋白印迹法分别检测YAP和β-catenin mRNA和蛋白表达,采用免疫荧光法观察二者的核内含量以及细胞骨架蛋白F-actin的变化。结果：MC3T3-E1细胞在不同浓度AGEs处理后增殖活性降低、凋亡率增加,且具有浓度依赖性。与对照组相比,MC3T3-E1细胞经AGEs处理后,ALP染色较浅,OCN、ALP和Runx2 mRNA表达量较低（P＜0.05）;细胞骨架蛋白F-actin形态和分布发生明显改变;YAP mRNA和蛋白含量均无明显变化,但其细胞核内含量减少;β-catenin 的mRNA 和蛋白量均降低（P＜0.05）,但其细胞核内含量无明显变化。结论：AGEs能抑制MC3T3-E1细胞的增殖活性,诱导细胞凋亡,抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化能力,F-actin,YAP和β-catenin参与其调控过程。     

氯离子／钾离子通道阻滞剂对成骨细胞增殖的影响

目的 观察氯离子和钾离子转运体阻滞剂及氯离子／钾离子通道阻滞剂是否影响MC3T3-E1成骨细胞的增殖。方法 采用体外培养MC3T3-E1成骨细胞,分别加入DIOA（氯离子和钾离子转运体阻滞剂,100和500μM）、NPPB（10和300μM,氯离子通道阻滞剂）和喹啉（10和500μM,钾离子通道阻滞剂）,检测细胞增殖情况。结果 DIOA抑制MC3T3-E1成骨细胞的增殖,不同浓度的NPPB和喹啉同样也能够减少MC3T3-E1成骨细胞的增殖。结论 细胞内氯离子的浓度升高或降低都会抑制MC3T3-E1成骨细胞的增殖。     

木犀草素对小鼠体外培养前成骨细胞MC3 T3-E1增殖、分化、矿化和Wnt通路的影响

目的:探讨木犀草素对小鼠体外培养前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化及Wnt通路的影响.方法:在体外培养的MC3T3-E1s培养基中加入木犀草素0.25~8.00μmol/L培养12、24和48 h,以洛伐他汀0.04μmol/L作为阳性对照,采用细胞计数试剂盒法检测细胞增殖情况;用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测细胞内ALP的活性;茜素红S染色法检测细胞矿化能力;采用实时荧光定量反转录PCR法检测细胞Ⅰ型胶原、骨钙素、低密度脂蛋白受体相关蛋白5(Lrp5)、β-连环素、护骨素/细胞核因子κB受体活化因子配体mRNA表达水平.结果:木犀草素可以剂量依赖性和时间依赖性地促进成骨细胞MC3T3-E1增殖(P<0.05~P<0.01);木犀草素(2.00、4.00和8.00μmol/L)可以剂量依赖性地促进MC3T3-E1成骨细胞ALP活性,增强MC3T3-E1成骨细胞矿化能力并上调MC3T3-E1成骨细胞中Ⅰ型胶原、骨钙素、Lrp5、β-连环素和护骨素/细胞核因子κB受体活化因子配体mRNA表达.结论:木犀草素2.00、4.00和8.00μmol/L可以促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化与矿化及Wnt通路中Lrp5和β-连环素mRNA的表达.     

胶体金对MC3T3-E1增殖、分化及RUNX2基因表达的影响

目的研究30nm胶体金对小鼠成骨细胞系MC3T3-E1增殖、分化及成骨相关基因RUNX2表达的影响。方法体外培养小鼠成骨细胞MC3T3-E1,在仪-MEM培养液中加入不同体积的胶体金处理细胞,利用M1Tr法检测胶体金对成骨细胞增殖活性的影响,碱性磷酸酶活性测定及RT—PCR法分别检测其对成骨细胞分化及成骨相关基因RUNX2表达的影响。结果浓度为10^（-10）、10^（-11）、10^（-12）mg／L的胶体金均促进成骨细胞的增殖,且ALP相对活性及RUNX2基因表达也均高于阳性对照组。结论30nm胶体金能促进小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1增殖、分化及成骨相关基因RUNX2的表达,进而促进成骨。     

重楼皂苷I对成骨细胞MC3T3-E1增殖及分化的实验研究

目的:研究重楼皂苷I (PPL I)对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1增殖的作用及其机制。方法:采用MTT比色法、EdU试剂盒、碱性磷酸酶(ALP)活性检测法、茜素红染色法,观察加入PPL I (1、3、10、30μmol/L)后,MC3T3-E1的增殖、成熟与矿化情况;采用免疫印迹法,观察PPL I (3、10μmol/L)对细胞中β-连环素(β-catenin)和骨形成蛋白-2 (BMP-2)的表达影响。结果:PPL I可以有效地促进成骨样细胞MC3T3-E1增殖,并浓度依赖性地升高β-catenin与BMP-2蛋白的水平。结论:PPL I能促进MC3T3-E1细胞的增殖与分化,可能与其调节β-catenin与BMP-2的表达有关。     

基于免疫荧光图像的微管蛋白半定量分析

目的：建立一种基于免疫荧光图像的快速、简便、半定量分析微管蛋白的方法.方法：小鼠成骨样细胞MC3T3分别在正常及三维回转条件培养48h后,免疫荧光细胞化学技术标记对照组和回转组的成骨细胞微管骨架,激光共聚焦显微镜采集荧光图像; 采用三种不同的专业图像分析软件SimplePCI,Imagepro-Plus6.0（IPP）及ImageJ定量分析三维回转培养条件对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1微管细胞骨架的影响; 用Western Blot检测α-微管蛋白表达量; 用ImageJ软件确定MC3T3-E1细胞微管骨架的分形维数.结果：对采集到的细胞骨架荧光染色图像做定量分析发现,与对照组相比,经过48h三维回转培养,MC3T3-E1细胞图像的荧光强度明显降低（P〈0.01）; Western Blot结果表明,经过48h三维回转培养,MC3T3-E1细胞α-微管蛋白表达量表达量明显下降; Im-ageJ软件分析结果表明,经过48h三维回转培养,MC3T3-E1细胞微管的分形维数也明显低于对照组（P〈0.05）.结论：图像分析软件的结果和实验结果一致,表明基于免疫荧光图像的分析方法是可行的,为细胞形态学的定量研究提供了新思路和手段.     

成骨前体细胞对乳腺癌细胞表达骨拟态特性及增殖的影响

目的 通过共培养体系探讨成骨前体细胞MC3T3-E1对MDA-MB-231乳腺癌细胞表达骨拟态特性及增殖的影响.方法 实验组将MC3T3-E1及MDA-MB-231细胞采用transwell小室共培养,上室接种MC3T3-E1成骨细胞,下室接种相同数量的MDA-MB-231细胞.对照组上、下室均采用相同数量及密度的MDA-MB-231细胞.实时荧光定量PCR、Western blot法检测实验组及对照组骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)的基因及蛋白的表达差异,采用CCK-8法检测各组增殖的差异,结晶紫染色法检测细胞集落形成差异.结果 与对照组相比,实验组OCN、OPN、OPG的基因及蛋白表达均有明显的上调(P＜0.05),MDA-MB-231细胞的增殖能力明显增高(P＜0.01);实验组MDA-MB-231细胞集落形成数量及大小均优于对照组.结论 短期共培养后MC3T3-E1成骨细胞可促进乳腺癌MDA-MB-231细胞表达骨拟态特性,并可促进其增殖及细胞集落形成.     

鹿茸Ⅰ型胶原对MC3T3-E1细胞TGF-β1/Smad基因蛋白表达的影响

目的研究梅花鹿茸I型胶原(SDC-I)对MC3T3-E1细胞TGF-β1及Smad2/3基因蛋白的影响,探究SDC-I治疗骨质疏松的作用机制。方法分别用不同浓度的SDC-I处理小鼠成骨细胞MC3T3-E1。采用MTT法检测MC3T3-E1细胞增殖活性;应用RT-PCR及ELISA方法检测MC3T3-E1细胞TGF-β1/Smad通路相关因子TGF-β1、Smad2和Smad3的m RNA及蛋白表达水平。结果 SDC-I促进MC3T3-E1细胞的增殖;SDC-I不同浓度作用于MC3T3-E1细胞48 h以后,能显著上调TGF-β1、Smad2以及Smad3基因蛋白表达的水平。与空白对照组相比具有显著性差异,同时SDC-I的浓度越高,效果越明显。结论 SDC-I能刺激MC3T3-E1细胞Smad 2/3和TGF-β1的表达,可通过TGF-β1/Smad信号通路促进骨的形成,为骨质疏松症的防治提供理论依据。     

pLenti6/V5-DEST-TAZ载体的构建及其对成骨前体细胞MC3T3-E1分化的影响

目的：构建人真核表达的TAZ慢病毒载体pLenti6/V5-DEST-TAZ,转染293FT 细胞获得重组慢病毒颗粒,探讨TAZ对成骨前体细胞MC3T3-E1 分化的调控作用。方法：将已经过测序验证的含有TAZ基因慢病毒入门质粒pENTR(tm)221-TAZ通过LR反应克隆到慢病毒载体pLenti6/V5-DEST中。对重组质粒进行酶切鉴定,并在细胞中验证表达。将该重组载体和其他PackingMix 3 个质粒载体充分混合,用阳离子脂质体转染293FT 细胞,培养和待细胞完全裂解后收集富含TAZ基因的病毒颗粒上清液,取适量上清液感染MC3T3-E1细胞,采用杀稻瘟菌素Blastcidin 筛选,建立稳定过量表达 TAZ 蛋白的 MC3T3-E1/TAZ细胞系。用条件培养基诱导 MC3T3-E1和 MC3T3-E1/TAZ细胞系向成骨细胞定向分化,von Kossa 和茜素红染色观察MC3T3-E1和MC3T3-E1/TAZ细胞的成骨分化。结果：凝胶电泳和测序结果均证明TAZ重组慢病毒载体pLenti6/V5-DEST-TAZ构建正确,并能在细胞中正确表达。与辅助质粒共转包装细胞获得慢病毒颗粒,并成功感染MC3T3-E1细胞。Von Kossa 染色和茜素红染色, MC3T3-E1/TAZ细胞系中生成的磷酸钙比MC3T3-E1细胞系中生成的磷酸钙多。结论：成功构建了人真核表达的质粒载体pLenti6/V5-DEST-TAZ,并能在细胞中正确表达;成功包装了TAZ病毒,并获得过表达TAZ的MC3T3-E1细胞;过表达TAZ促进MC3T3-E1向成骨细胞分化。     

IKKβ缺失和NF-κB p65缺失对小鼠成骨细胞分化的影响

目的:探讨IKKβ和NF-κB p65缺失对小鼠成骨细胞分化的影响。方法:使用CRISPR/Cas9基因编辑工具分别敲除小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中的Ikbkb或Rela基因,获得不表达IKKβ或NF-κB p65蛋白的Ikbkb^-/- MC3T3-E1和Rela^-/- MC3T3-E1细胞。用10 mmol/Lβ-甘油磷酸+50 mg/L抗坏血酸诱导MC3T3-E1、Ikbkb^-/- MC3T3-E1、Rela^-/- MC3T3-E1细胞成骨分化。诱导培养4 d后,qPCR法检测细胞中成骨分化标志性基因Sp7、Alpl、Spp1、Bglap mRNA的表达,Western blot法检测细胞中成骨分化相关蛋白ALPL、FZD9的表达;16 d后,茜素红染色法检测细胞外基质矿化水平。结果:诱导培养后Ikbkb^-/- MC3T3-E1细胞中Sp7、Alpl、Bglap mRNA表达以及ALPL、FZD9蛋白表达高于MC3T3-E1细胞和Rela^-/- M...     

miR-363在脆性骨折患者血中的表达及对MC3T3-E1细胞成骨分化及增殖的影响

目的研究miR-363在脆性骨折患者血中的表达及对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)成骨分化与增殖的影响。方法收集脆性骨折患者外周血,采用荧光定量PCR检测患者miR-363、矮小相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(OCN)、细胞周期蛋白D1(CCND1)、连环蛋白β1(CTNNB1)和骨髓细胞瘤癌基因(MYC)表达。采用茜素红S染色与噻唑蓝检测过表达miR-363对细胞成骨分化及增殖的影响。采用双荧光素酶报告基因与Western blotting检测miR-363对Dickkopf相关蛋白1(DKK1)的调控作用。结果miR-363在脆性骨折患者外周血中的表达水平低于正常健康者,而术后1周、2周及4周外周血中的表达水平高于术前并呈上调趋势(P＜0.05);模拟物组MC3T3-E1细胞中miR-363表达水平高于阴性对照组(P＜0.05);模拟物组MC3T3-E1细胞矿化程度、RUNX2及OCN mRNA表达水平及1天、2天、3天光密度(OD)值高于阴性对照组(P＜0.05);DKK1是miR-363的靶基因,模拟物组MC3T3-E1细胞中DKK1蛋白表达水平低于阴性对照组,而CCND1、CTNNB1及MYC mRNA表达水平高于阴性对照组(P＜0.05)。结论miR-363可能通过调控靶基因DKK1与Wnt/β-catenin信号通路促进MC3T3-E1细胞成骨分化与增殖。     

成骨细胞来源的IL-7通过激活mTORC1信号通路抑制骨形成

目的 本研究探讨成骨细胞分泌的白介素-7（IL-7）通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）信号来调节骨形成。方法 将IL-7基因的编码框构建于慢病毒表达载体,导入MC3T3-E1成骨细胞中,应用qRT-PCR和ELISA方法检测IL-7基因mRNA和蛋白的表达效率。Western blot方法检测MC3T3-E1细胞P-S6、S6、Ⅰ型胶原（collagen Ⅰ,Col Ⅰ）以及骨钙素（osteocalcin,Ocn）表达情况。用0.1nmol/L mTORC1特异性抑制剂雷帕霉素刺激过表达IL-7基因的MC3T3-E1成骨细胞,Western blot方法检测P-S6、S6、Col Ⅰ以及Ocn表达情况。结果 过表达IL-7基因的慢病毒载体感染MC3T3-E1细胞可使其IL-7 mRNA表达上调4.6倍,ELISA从蛋白水平证实过表达组细胞上清的IL-7含量增加3.9倍;过表达IL-7的MC3T3-E1细胞P-S6蛋白表达显著增强,而Col Ⅰ和Ocn蛋白表达显著降低;雷帕霉素处理IL-7过表达的MC3T3-E1细胞导致其P-S6蛋白表达显著降低,而Col Ⅰ和Ocn蛋白表达上调。结论 成骨细胞来源的IL-7通过促进mTORC1信号通路抑制其发育成熟。     

细胞外基质硬度对成骨细胞MC3T3-E1形态、增殖及矿化能力的影响

目的:探讨不同细胞外硬度凝胶基质对成骨细胞MC3T3-E1形态、增殖以及矿化能力的影响。方法:通过调整丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体的相对浓度,制备出硬凝胶基质(交联度16%,杨氏模量为25kPa)和软凝胶基质(交联度5%,杨氏模量为5kPa)。用不同硬度的细胞外凝胶基质来培养成骨样细胞MC3T3-E1细胞,分别采用免疫荧光、MTT比色以及茜素红染色等方法研究不同硬度的凝胶基质对细胞形态、增殖以及矿化等功能的影响。结果:MTT比色法检测结果显示聚丙烯酰胺凝胶浸提液对成骨细胞MC3T3-E1的活性均无影响,生物相容性好。MC3T3-E1细胞形态随着细胞外凝胶基质硬度的降低,其形状由从梭形向长条形变化。细胞外硬凝胶基质和软凝胶基质上培养的细胞,铺展面积具有显著性差异(P<0.01)。随着培养基质硬度的降低,MC3T3-E1细胞的增殖受到抑制;在硬基质表面培养的细胞,经矿化诱导后染色,钙结节明显可见;在细胞外软基质表面培养的细胞,经矿化诱导后染色,无明显的钙结节出现(P<0.01)。结论:细胞外软凝胶基质对成骨样细胞MC3T3-E1铺展、增殖和矿化具有抑制作用,提示力学刺激减少不利于成骨细胞生长。     

淫羊藿苷对人牙囊干细胞旁分泌作用的影响

目的 探讨淫羊藿苷(icariin,ICA)诱导人牙囊干细胞(dental follicle stem cell,DFSC)旁分泌作用对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)的影响。方法 分离培养并鉴定DFSC;分别使用0、1和10μmol的ICA处理DFSC,24h后收集培养上清,CCK-8法和结晶紫染色检测MC3T3-E1的增殖活性;划痕实验和Transwell小室实验检测MC3T3-E1的迁移能力;qRT-PCR检测MC3T3-E1成骨相关基因的表达情况。结果 DFSC具有间充质来源干细胞特征;与对照组比较,0ICA-CM组和1ICA-CM组促进了MC3T3-E1增殖(3天,P<0.001;5天,P<0.001);并且1ICA-CM组显著促进了MC3T3-E1迁移(P<0.001),上调了成骨标志基因的表达。结论 ICA具有调控DFSC旁分泌的作用,可促进MC3T3-E1迁移和成骨分化。     

活性氧与铁死亡通路相互作用在丙酮醛引起的小鼠胚胎成骨细胞损伤中起重要作用

目的 探讨活性氧和铁死亡在丙酮醛诱导小鼠胚胎成骨细胞（MC3T3-E1）损伤中是否存在相互作用。方法 应用丙酮醛损伤MC3T3-E1细胞建立模拟糖尿病骨质损伤的细胞模型。应用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定MC3T3-E1细胞的存活率;罗丹明123染色荧光显微镜照相法测定线粒体膜电位;双氯荧光素（DCFH-DA）荧光显微镜照相法检测胞内活性氧水平;碱性磷酸酶试剂盒检测定碱性磷酸酶活性;茜素红染色观察成骨细胞晚期标志物-矿化结节的形成;铁离子试剂盒检测铁离子水平;Western blot检测成骨细胞的抑制铁死亡的标志蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达水平。结果 0.6 mmol/L 丙酮醛处理MC3T3-E1细胞24 h可明显减少GPX4的表达（P<0.001）,同时可使胞内铁离子浓度升高,细胞存活率降低,线粒体膜电位丢失,胞内活性氧水平升高,碱性磷酸酶活性降低和矿化结节减少（P<0.001）。应用2 mmol/L 活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸和丙酮醛共处理MC3T3-E1细胞24 h可增加GPX4的表达（P<0.01）,应用4 μmol/L铁死亡抑制剂铁抑素-1与丙酮醛共处理成骨细胞24 h可使胞内活性氧水平降低（P<0.001）;应用N-乙酰半胱氨酸或铁抑素-1与丙酮醛共处理成骨细胞24 h均能对抗丙酮醛引起的上述其他细胞损伤（P<0.001）。结论 活性氧与铁死亡通路相互作用在丙酮醛引起MC3T3-E1成骨细胞损伤中起重要的作用。