MPTP慢性帕金森病小鼠纹状体差异蛋白质的研究

目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达兔轮状病毒VP7基因.方法 根据GenBank发表的LaRV 308/01 VP7基因序列(AF5028201),设计一对特异性引物,RT-PCR扩增获得VP7基因,将目的 片段克隆入pFastBacHTa中,构建重组转移载体6pFastBHa-VP7.将重组转移载体转化DH10Bac感受态细菌,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组穿梭载体Bacmid-VP7,通过脂质体将其转染昆虫细胞Sf9.结果 获得了重组杆状病毒Bacmid-VP7,Westernblot和IFA分析表明VP7蛋白在昆虫细胞中获得正确表达且表达产物具有抗原性.结论 本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达兔轮状病毒VP7蛋白,为进一步建立诊断学方法奠定了实验基础.     

利用杆状病毒表达载体系统表达重组乙型肝炎病毒核心蛋白

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组乙型肝炎病毒核心蛋白。方法构建含有HBVC基因的杆状病毒转移载体pFastBac Dual—HBV core，转化大肠埃希菌DH10Bac进行转座，提取重组Bacmid DNA转染昆虫细胞Sf9，获得含有HBVC基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染Sf9细胞进行乙型肝炎病毒核心蛋白表达，然后通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达情况。结果成功构建了含HBVC基因的重组杆状病毒，而且在昆虫细胞Sf9中表达了乙型肝炎病毒核心蛋白。结论利用Bac to Bac杆状病毒表达系统，成功地表达了乙型肝炎病毒核心蛋白，为进一步研究奠定了基础。     

戊型肝炎病毒ORF3基因在杆状病毒系统中的表达与免疫学性质

目的 利用杆状病毒系统表达戊型肝炎病毒（HEV）ORF3,为进一步研究免疫学性质与功能提供基础。方法 通过RT－PCR方法获得HEV ORF3基因的目的基础片段,插入中间转染载体质粒pVL1393,构建重组质粒,再与杆状病毒线性DNA（BaculoGold^TM）共转染Sf9昆虫细胞,通过同源重组得到重组杆状病毒,以此重组杆状病毒感染昆虫细胞后,对表达的重组蛋白进行免疫学检测并免疫小鼠。结果 表达的重组蛋白约占昆虫细胞总蛋白的2％,可被戊型肝炎患者与实验猴阳性抗血清有效识别,并能诱导小鼠产生对HEV特异性免疫应答。结论 重组杆状病毒可高效表达HEV ORF3基因片段,表达产物具有HEV特异的免疫原性。     

大肠癌新型CEA疫苗重组杆状病毒的表达与鉴定

目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建新型CEA融合表位疫苗(以HPV16L1为蛋白载体)的重组杆状病毒.方法构建含有HPV16L1片段和CEA-PADRE合成片段的表达载体pFastBacl-Ⅴ,转化DH1OBac感受态菌.利用其含有的细菌Tn7转座系统,将该基因重组至杆状病毒穿梭质粒bacmid中,转染昆虫细胞sf9,获得新型CEA疫苗的重组杆状病毒.结果限制性内切酶酶切和DNA序列分析表明目的片断正确克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1中;重组杆状病毒感染昆虫细胞后,PCR检测可以扩增出相应大小的片段.结论利用杆状病毒表达系统,成功构建了CEA融合表位疫苗的重组杆状病毒,为进一步的研究奠定了基础.     

O型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

目的口蹄疫病毒的VP1蛋白是诱导中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达VP1基因,为建立O型口蹄疫抗体血清学诊断方法奠定基础.方法将O型口蹄疫病毒VP1基因插入pFastBacHIa载体,构建重组质粒pFast BacHIa-VP1.将该重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,VP1基因与Bacmid发生特异性位点转座.经PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到病毒基因组多角体蛋白基因启动子下游,提取阳性质粒转染Sf9昆虫细胞.结果 SDS-PAGE电泳和Western blot检测结果表明VP1基因成功地在Sf9昆虫细胞中进行了表达,蛋白分子量为26.4kDa.结论 VP1基因在Bac-to-Bac系统中的成功表达为口蹄疫病毒VP1蛋白的抗原性、免疫原性以及免疫抗体水平检测研究奠定了基础.     

利用昆虫杆状病毒载体表达人碱性成纤维细胞生长因子

目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growth factor,hbFGF)基因进行表达,并检测重组蛋白的特异性及生物学活性。方法将人bFGF的cDNA克隆至杆状病毒转座载体pFastBacHTb中,并转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细菌DH10Bac中,获得重组Bacmid/bFGF;纯化DNA后,转染昆虫细胞Sf21,PCR鉴定重组病毒;进一步将重组病毒感染Sf21细胞,在Sf21细胞中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western bloting分析;MTT法检测表达产物的生物活性。结果重组Bacmid/bFGFDNA直接转染昆虫细胞得到重组病毒rAcV-Bac-bFGF,病毒滴度MOI值≈8。重组病毒在感染后48h开始出现一相对分子质量为23000大小的特异带,感染后72h蛋白量明显增加,96h蛋白量达到最大,120h蛋白量开始减少。在正常昆虫Sf21细胞的对照中未见该蛋白带。Western bloting显示目的蛋白条带与人bFGF抗体发生特异反应。MTT结果显示重组蛋白能明显促进3T3细胞的分裂增殖。结论利用杆状病毒表达系统可成功表达具有生物学活性的bFGF蛋白。     

细粒棘球蚴95抗原在真核昆虫表达系统中表达、纯化及免疫原性初步分析

目的 采用真核昆虫表达系统表达细粒棘球蚴95(Eg95)抗原,探讨其免疫原性.方法 从GeneBank 获取Eg95基因序列(序列编号:EU595937.1),合成开放读码框(CDS)全长基因;利用杆状病毒表达系统Bac-to-Bac symtem在昆虫细胞中表达目的基因Eg95,亲和层析纯化,Western blot鉴定;对Balb/c小鼠分别免疫接种重组昆虫表达目的蛋白Eg95(简称eu rEg95)、原核重组表达Eg95(简称pro rEg95)、阴性对照PBS,制备免疫血清,间接法ELISA对各组特异性IgG抗体进行分析.结果 合成Eg95基因CDS全长471 bp,经测序与理论完全一致;Western blot证实目的蛋白通过重组杆状病毒在昆虫细胞内实现可溶性表达;ELISA结果表明:eu rEg95能够诱导产生原头蚴特异性IgG抗体,抗体水平高于pro rEg95组(P＜0.05).结论 利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达出具有良好免疫原性的Eg95抗原,为优化细粒棘球蚴疫苗奠定基础.     

猪瘟病毒E2基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

目的利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白,用于E2蛋白功能、开发CSF新型疫苗以及建立相关血清学诊断方法等研究。方法采用RT-PCR扩增CSFV E2基因,将PCR产物克隆到pGEM-T-Easy载体,将该基因插入到pFast-BacHT A载体中,构建重组转座载体后转化DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行Western-blot及免疫组化鉴定。结果成功克隆CSFVE2基因,其核苷酸序列为1119 bp。SDS-PAGE电泳结果显示表达E2蛋白相对分子质量约为43×103,Western-blot和免疫组化结果证实表达蛋白能够被CSFV标准阳性血清识别。结论在Bac-to-Bac杆状病毒系统中的成功表达了CSFV E2蛋白,与CSFV标准阳性血清具有较好的反应性。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在昆虫细胞中表达产物的鉴定

目的 :在昆虫细胞中表达乙型肝炎病毒 ( HBV)的表面抗原。方法 :利用已构建的含有 HBV S基因的重组杆状病毒 Bac- S,在昆虫细胞中进行表达 ,并用间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹对表达产物进行检测。结果 :重组杆状病毒感染昆虫细胞后 ,可表达相应大小的 S蛋白 ,且该蛋白可被 HBs Ag特异性单抗 ( m Ab)所识别。结论 :利用杆状病毒表达系统 ,成功地表达了具有生物学活性的 HBV S蛋白。     

细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

目的利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白,用于开发包虫病新型疫苗以及建立相关血清学诊断方法等研究。方法从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR扩增细粒棘球蚴Eg95和Eg.ferritin基因,采用基因拼接法将Eg95和Eg.ferritin融合,将该融合基因Eg95-Eg.ferritin插入到p Fast Bac DUAL载体中,构建重组转座载体后转化DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染Sf-9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行Western blot鉴定。结果成功克隆了Eg95和Eg.ferritin基因,通过柔性氨基酸linker成功获得了融合基因Eg95-Eg.ferritin,经PCR和酶切鉴定成功构建了重组质粒p Fast Bac DUAL-Eg95-Eg.ferritin,Western blot结果证实表达蛋白能够被包虫病人标准阳性血清识别。结论在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中成功表达了细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白,与包虫病人标准阳性血清具有良好的反应性。     

蛇毒cystatin在Bac to Bac杆状病毒表达系统的表达与鉴定

目的探讨蛇毒cystatin在Bac to Bac杆状病毒表达系统中的表达。方法PCR扩增蛇毒cystatin基因,将其克隆到pFastBacHTc中,通过转化E.coliDH10Bac筛选克隆,抽提重组Bacmid/cystatin,后者经Cell-fectin介导转染Sf9细胞,获取重组病毒,扩增病毒并感染Sf9细胞进行表达,SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定表达蛋白66。结果获得重组cystatin的杆状病毒,Sf9细胞能表达出与蛇毒cystatin单抗、5×His单抗结合的蛋白,相对分子质量约15 kD。结论蛇毒cystatin在Bac to Bac杆状病毒表达系统中成功表达。     

High Expression of Insulin-like Growth Factor H (IGF-Ⅱ) Using Bac-to-Bac Expression System

Objective In order to obtain mature insulin-like growth factor- Ⅱ ( IGF- Ⅱ ), we used Bac-to-Bac baculovirus expression system. Methods Firstly the IGF- Ⅱ cDNA was cloned into a donor plasmid pFastBac1 and the recombinant pFastBac1 was then introduced into competent cells DH 10Bac. Recombinant bacmids were constructed by transposing a mini-Tn7 element from a donor plasmid pFastBac1 to the mini-attTn7 attachment site on the bacmid where the Tn7 transposition functions were provided in trans by a helper plasmid, and then used to transfect Sf9 insect cells to get recombinant baculovirus. The recombinant baculovirus was used to infect insect cells. Results Agarose gel analysis showed that recombinant donor plasmid pFastBac1 was constructed successfully; Agarose gel analysis of PCR products confirmed recombinant bacmid ; SDS-PAGE and Western Blotting showed that a 7KD protein band appeared. Conclusion The mature IGF- Ⅱ with immunogenecity has been expressed and produced by using Bac-to-Bac expression system.     

High Expression of Insulin-like Growth Factor H (IGF-Ⅱ) Using Bac-to-Bac Expression System

Objective In order to obtain mature insulin-like growth factor- Ⅱ ( IGF- Ⅱ ), we used Bac-to-Bac baculovirus expression system. Methods Firstly the IGF- Ⅱ cDNA was cloned into a donor plasmid pFastBac1 and the recombinant pFastBac1 was then introduced into competent cells DH 10Bac. Recombinant bacmids were constructed by transposing a mini-Tn7 element from a donor plasmid pFastBac1 to the mini-attTn7 attachment site on the bacmid where the Tn7 transposition functions were provided in trans by a helper plasmid, and then used to transfect Sf9 insect cells to get recombinant baculovirus. The recombinant baculovirus was used to infect insect cells. Results Agarose gel analysis showed that recombinant donor plasmid pFastBac1 was constructed successfully; Agarose gel analysis of PCR products confirmed recombinant bacmid ; SDS-PAGE and Western Blotting showed that a 7KD protein band appeared. Conclusion The mature IGF- Ⅱ with immunogenecity has been expressed and produced by using Bac-to-Bac expression system.     

狂犬病病毒糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫学特性分析

目的:利用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统对狂犬病病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein,RVG)基因进行克隆?表达?纯化,并对重组 RVG 进行免疫学特性鉴定?方法:参照 GenBank 收录的狂犬病病毒 CVS-11 株RVG基因序列,设计特异性引物,扩增目的基因?RVG 基因经BamHⅠ/KpnⅠ 双酶切后定向克隆到 pFastBac-GP67B 载体上,阳性重组转座质粒进一步转化E.Coli DH10Bac 感受态细胞,经蓝白斑筛选及 PCR 鉴定后获得重组穿梭载体 rBacmid-RVG,将其转染至对数生长期的Sf-9昆虫细胞,进行重组RVG的真核表达?His-TrapHP 纯化目的蛋白,SDS-PAGE 和 Western blot 进行鉴定?重组RVG免疫小鼠,检测其免疫原性和血清中和活性?结果:用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统表达并纯化了重组RVG,分子量约58 000?经重组RVG免疫后的小鼠血清具有中和活性?结论:重组RVG具有天然RVG的活性,为进一步研制亚单位疫苗及制备筛选中和抗体奠定了基础?     

人类疱疹病毒8型肿瘤转化基因K12的分离及在昆虫细胞中的表达

目的：分离人类疱疹病毒8型(HHV-8)肿瘤转化基因K12，克隆至杆状病毒载体并在昆虫细胞中作尝试性表达。方法：设计一对引物，在引物的5’端分别引入。BamH1、EcoRI酶切位点，以佛波脂刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板，PCR扩增HHV～8肿瘤转化基因K12。将经序列测定后的PCR产物克隆进杆状病毒转移载体pVLl393中，构建成重组K12杆状病毒转移载体pVL-K12，并与线性：BaculoGold病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9，获得重组病毒。RT-PCR检测K12 mRNA转录水平；间接免疫荧光染色(IFA)检测K12编码蛋白在Sf9细胞中的表达状况。结果：含HHV-K12基因重组杆状病毒在昆虫细胞Sf9中获得表达，经IFA证实该重组蛋白为HHV-8特异性蛋白。结论：杆状病毒载体能够介导HHV-8肿瘤转化基因K12编码的蛋白在昆虫细胞中表达。     

杆状病毒介导内耳基因治疗的实验研究

目的探讨重组杆状病毒作为内耳基因治疗载体的可行性及其转染特点。方法应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒Bac-GFP,建立新生大鼠耳蜗Corti器体外模型,加入携带报告基因的病毒悬液,观察外源基因表达情况,并将其通过圆窗直接显微注射进入豚鼠内耳,观察杆状病毒在体内的转染特点。结果Bac-GFP联合丁酸钠可以高效转染毛细胞和螺旋神经节细胞,但并没有改变Corti器的正常结构。体内试验显示杆状病毒可以忠实和长效转染螺旋神经节细胞,而未被补体系统灭活。结论实验证实杆状病毒有希望成为内耳基因治疗的新型载体。     

禽脑脊髓炎病毒VP3基因的克隆与表达

目的对VP3进行克隆和测序后，在杆状病毒系统中表达获得重组蛋白，为AEV的分子诊断以及更深一层次的分子和基因工程研究打下基础。方法利用RT-PCR技术，从AEVVR株感染的SPF鸡胚脑及内脏器官组织中提取病毒RNA并扩增出VP3目的基因，而后克隆到pMD18-T载体中，鉴定后进行序列测定；应用Bae—to-Bac杆状病毒表达系统，将VP3基因定向克隆到pFastBacHTa donor质粒中，经转座反应，筛选到VP3-Bacmid重组子，转染Sf9昆虫细胞并盲传三代，提取DNA应用PCR方法鉴定证实获得含VP3的重组病毒，Western blot鉴定VP3在杆状病毒系统中得以表达。结果AEVVR株VP3基因全长735bp，共编码245个氨基酸，与AEV-1143标准毒株相应片段的核苷酸和氨基酸同源性分别为93％和97％；并将其与其它小RNA病毒进行了比较；Western blot鉴定结果，重组蛋白大小约27ku。结论本研究通过RT-PCR技术首次从体外成功扩增AEVVan—Roekel株VP3蛋白基因，并对其进行克隆、测序；应用Bac—to—Bac杆状病毒表达系统成功地表达了VP3基因并获得了具有良好免疫活性的重组蛋白。     

重组杆状病毒载体介导报告基因在甲状腺癌细胞中的表达研究

目的 探讨杆状病毒作为甲状腺癌基因转移和治疗载体的可行性.方法 利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统制备携带绿色荧光蛋白(GFP)的重组杆状病毒(Bac-GFP).分别以不同感染复数(MOI)的Bac-GFP感染滤泡状甲状腺癌细胞株FTC-133,流式细胞仪鉴定感染效率及GFP表达强度.以MOI为100的Bac-GFP感染FTC-133,荧光显微镜观察GFP表达持续时间;流式细胞仪检测不同浓度丁酸钠干预对感染效率及GFP表达强度的影响.MTT比色法检测不同MOI的Bac-GFP感染对FTC-133细胞存活的影响.结果 成功制备重组杆状病毒载体Bac-GFP并感染FTC-133.感染效率随MOI的增加而提高;当MOI为100时,感染效率高达71.3%.丁酸钠可提高Bac-GFP对FTC-133的感染效率及GFP表达强度,但感染效率的提高无统计学意义.荧光显微镜观察显示,Bac-GFP感染FTC-133其GFP表达可持续2周.MTT检测显示,不同MOI的Bac-GFP感染FTC-133的细胞存活率比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 重组杆状病毒Bac-GFP对FTC-133细胞具有较高的感染效率.报告基因表达时间较长且无明显细胞毒性,有可能成为甲状腺癌基因治疗的良好载体.