高糖培养下大鼠肾小球系膜细胞JunD表达及转录因子-激活物蛋白1的活化

转录因子激活物蛋白 1(ａｃｔｉｖａｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎ 1,ＡＰ 1)在糖尿病肾病特征性病理改变的发生发展中起重要作用。转化生长因子 (ＴＧＦ) β1、肾小球细胞外基质的重要成分层粘蛋白、Ⅰ型胶原的启动子区域都含有ＡＰ 1的结合位点 ;已有文献提示ＡＰ 1的活化介导了高糖诱导的ＴＧＦ β1表达升高〔1〕,同时ＡＰ 1也参与了ＴＧＦ β1诱导的细胞外基质表达升高〔2〕。转录因子ＡＰ 1由Ｊｕｎ蛋白 Ｆｏｓ蛋白异源二聚体或Ｊｕｎ蛋白同源二聚体组成。其二聚体 (ＪｕｎＤ)为其活化形式 ,可与ＴＰＡ反应元件结合 ,启动靶基因的转录。ＡＰ 1…     

雷帕霉素对高糖诱导肾小球系膜细胞增殖的影响

目的 探讨雷帕霉素对高糖诱导肾小球系膜细胞（GMC）增殖的影响及其可能涉及的途径。方法高糖培养GMC,以不同剂量雷帕霉素干预,MTT及流式细胞仪等方法观察雷帕霉素对细胞增殖和周期的影响,RT-PCR、Western印迹观察细胞Cyclin D1、CyclinE和p27^KIP1的变化。结果高糖刺激下,GMC增殖明显;雷帕霉素能抑制这一作用,且呈剂量依赖性,并下调CyclinD1、CyclinE的基因及蛋白水平,上调p27^KIP1的蛋白表达;与对照组相比,高糖组G0／G1期细胞减少,S期细胞比例增加（P均＜0．05）;雷帕霉素干预后,G0／G1期细胞升高,S期细胞比例减少（P均＜0．05）。结论雷帕霉素可抑制高糖状态下GMC的增殖,且呈剂量依赖性;其可能机制是通过下调CyclinD1、CyclinE及上调p27^KIP1,参与了G1／S期阻滞。     

高糖及血管紧张素Ⅱ对大鼠肾小球系膜细胞结缔组织生长因子表达的影响

糖尿病肾病 (ＤＮ)是糖尿病常见而且严重的慢性并发症 ,高血糖和血管紧张素Ⅱ (ＡｎｇⅡ )是导致ＤＮ肾纤维化最主要的两种物质 ,它们通过共同的信号传导途径参与了肾纤维化的发生发展〔1,2〕。近年来 ,国外研究发现结缔组织生长因子 (ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＣＴＧＦ)对肾细胞增殖、表型改变及细胞外基质 (ＥＣＭ )具有较强调控作用 ,其异常表达在ＤＮ肾纤维化进程中起了重要作用。本研究拟用高糖和ＡｎｇⅡ刺激体外培养的系膜细胞 ,测定其ＣＴＧＦｍＲＮＡ的表达情况 ,以探讨高糖和ＡｎｇⅡ对系膜细胞…     

高糖对体外培养大鼠肾小球系膜细胞VEGF和PEDF表达的影响

目的观察高糖环境对肾小球系膜细胞(HBZY-1)血管内皮生长因子(VEGF)和色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响,进一步探讨糖尿病肾病的发生、发展机制。方法体外常规培养HBZY-1,传代后分五组培养:对照组培养液葡萄糖浓度5.6 mmol/L,高糖a、b、c、d组培养液葡萄糖浓度分别为10、15、20、30 mmol/L;分别作用24、48 h后RT-PCR法测定各组细胞VEGF和PEDF mRNA表达水平;用ELISA法测定各组细胞培养液中VEGF和PEDF蛋白含量。结果与对照组相比,高糖各组细胞VEGF mRNA及VEGF蛋白的表达均升高,PEDF mRNA及PEDF蛋白表达均降低(P<0.05);高糖各组随葡萄糖浓度升高,VEGF表达升高、PEDF表达降低,呈浓度依赖性。结论高糖可导致肾小球系膜细胞VEGF和PEDF表达失衡,可能为糖尿病肾病微血管病变及肾小球硬化发生发展的机制之一     

葡萄糖转运蛋白对大鼠肾小球系膜细胞己糖胺通路的影响

目的探讨己糖胺通路(HBP)在葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)基因转染系膜细胞功能改变中的作用.方法利用逆转录病毒载体建立GLUT1基因转染的大鼠系膜细胞,以β-半乳糖苷酶转染细胞(MCLacZ)为对照.用2-脱氧-3H-葡萄糖(2-DG)测定细胞葡萄糖摄入,流式细胞仪分析细胞表型和纤维连接蛋白(FN)的合成,采用比色法测定HBP限速酶--谷氨酰胺6-磷酸果糖转氨酶(GFAT)的活性,RT-PCR检测细胞GFAT基因的表达.结果 MCGT1的2-DG摄入率明显高于MCLacZ[(741.0±60.5)dpm/μg蛋白质 vs (92.2±9.0)dpm/μg 蛋白质,P＜0.01],动力学分析发现MCGT1的Vmax是MCLacZ的3.7倍,而两者Km值无明显差别.MCGT1的GFAT活性明显高于MCLacZ[(3.25±0.25)OD365·μg蛋白质-1·30 min-1·10 vs (1.15±0.16)OD365·μg蛋白质-1·30 min-1·     

吡格列酮对大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响

目的观察吡格列酮对大鼠肾小球系膜细胞(MCs)氧化应激的影响,探讨其肾脏保护机制。方法体外培养MCs,分为正常对照(NG)组,高糖(HG)组及不同剂量吡格列酮干预(P1、P2、P3)组。应用流式细胞仪检测细胞内活性氧簇(ROS)水平,对上清液中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)进行检测。结果与NG组比较,HG组细胞内ROS水平增加,T-SOD、CAT活力降低,MDA含量增高(P0.01)。吡格列酮各干预组上述变化均受到抑制(P0.05),且呈剂量依赖性。结论吡格列酮可剂量依赖性地抑制高糖诱导的MCs氧化应激水平。     

吡格列酮对大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响

目的 观察吡格列酮对系膜细胞（MCs）氧化应激的影响,探讨其肾脏保护机制。方法 体外培养MCs,分为正常对照（NG）组,高糖（HG）组及吡格列酮干预 （P1、P2、P3）组。应用流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）水平,对上清液中总超氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）进行检测。 结果 与NG组比较,HG组细胞内ROS水平增加,T-SOD、CAT活力降低,MDA含量增高（P〈0.01）;吡格列酮各干预组上述变化均受抑制（P〈0.05）,且呈剂量依赖性。结论 吡格列酮可剂量依赖性的抑制高糖诱导的MCs氧化应激水平。     

二甲双胍对大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响

目的探讨不同浓度二甲双胍对高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响及其对糖尿病肾病(DN)的保护机制。方法将大鼠肾小球系膜细胞分别培养在正常对照组(NC组)、高糖(HG组)及高糖+不同浓度二甲双胍组。48 h后,比色法测定细胞上清液超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量,RT-PCR方法测定细胞p22phox和p47phox mRNA表达情况。结果与NC组比较,HG组MCs p22phox和p47phox mRNA表达明显增加,上清液SOD活力明显降低,MDA含量明显增高(P0.05)。二甲双胍干预高糖组MCs p22phox和p47phox mRNA表达明显低于HG组(P0.05),且二甲双胍浓度越高,MCs p22phox和p47phox mRNA表达越低。结论二甲双胍可降低高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞3-磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH)氧化酶表达水平,从而起到减轻氧化应激的作用,该作用在二甲双胍治疗糖尿病时表现为对肾脏的保护作用。     

叉头转录因子1/3在肝纤维化中的作用

肝纤维化是指各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生的病理过程。肝纤维化伴随于肝损伤修复愈合的全过程,慢性长期的损伤因素会诱导纤维化进展成肝硬化。流行病学数据显示,2017年我国共报告乙型肝炎新发病例118. 05万、丙型肝炎24. 3万。慢性病毒性肝炎带来了沉重的社会经济负担。叉头转录因子(FOXO)从属于叉头状家族,在细胞的各项生命活动中发挥着重要作用。研究发现,FOXO1/3可通过TGFβ通路调节肝星状细胞活力,在肝纤维化病变中扮演着重要角色。综述了肝纤维化病变机制、FOXO1/3对肝纤维化的调控机制,以及FOXO1/3(肝纤维化病变位点之一)的靶向治疗研究进展。     

法舒地尔通过Rho/ROCK信号通路对高糖培养人肾小球系膜细胞炎症反应及纤维化的影响

目的 体外实验研究法舒地尔(fasudil)通过抑制Rho/ROCK信号通路对高糖培养下的人肾小球系膜细胞(HMCs)炎症反应及其纤维化的影响.方法 传代培养的HMCs同步化后分组:(1)正常糖浓度对照组(NG,含葡萄糖5.5 mmol/L);(2)高糖组(HG,含葡萄糖30.0 mmol/L);(3)甘露醇渗透压对照组(Man,含5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇);(4)高糖+法舒地尔处理组(HG+F组,法舒地尔浓度分别为25、50、100 μmol/L).培养12、24、36、48、72 h收集上清及细胞,用实时PCR检测细胞中小G蛋白(RhoA)、小G蛋白激酶-Ⅰ(ROCK-Ⅰ)、纤维结缔组织生长因子(CTGF)mRNA浓度的变化,用ELISA方法检测上清中纤维连接蛋白(FN)、CTGF、TNFα的蛋白含量.结果 (1)高糖培养下的HMCs中RhoA、ROCK-Ⅰ、CTGF mRNA的表达较NG组明显升高(P＜0.05),并有一定的时间依赖性,Man组与NG组相比差异无统计学意义(P＞0.05).(2)正常培养的HMCs经不同浓度法舒地尔预处理后,高糖继续培养24 h或48 h,HG+F组与HG组对比,RhoA、ROCK-Ⅰ、CTGF mRNA的表达明显下降(P＜0.05),并有一定的浓度依赖性.(3)高糖呈时间依赖方式增加HMCs对FN、CTGF、TNFα蛋白的分泌(P＜0.05),而NG组和Man组无此作用(P＞0.05).(4)经不同浓度法舒地尔预处理后,高糖继续培养12、24、36、48、72 h后FN、CTGF、TNFα蛋白的分泌较HG组明显降低(P＜0.05).结论 法舒地尔通过抑制高糖激活的HMCs的Rho/ROCK信号转导通路,从而降低下游的炎性因子和细胞因子的分泌,减少HMCs的炎症反应及纤维化,为糖尿病肾病的治疗提供新的依据.

Abstract：

Objective To study the effect of fasudil on inhibiting the Rho/ROCK signaling pathway under high glucose in human mesangial cells (HMCs) inflammation and fibrosis. Methods Synchronized HMCs were divided into following groups: (1) Normal glucose control group ( NG, 5. 5 mmol/L glucose) ;(2) High glucose group (HG, 30 mmol/L glucose) ; (3) Mannitol group (Man, 5.5 mmol/L glucose + 24. 5 mmol/L mannitol) ; (4) High glucose + fasudil group ( HG + F, the concentrations of fasudil were 25 ,50 and 100 μmol/L, respectively). Collect the supernatant and cells at 0, 12, 24, 36, 48 and 72 h respectively, and determine the concentration changes of the RhoA, ROCK- Ⅰ, connective tissue growth factor (CTGF)mRNA with real-time PCR method in the cells, then used the ELISA method to check the protein content of the fibronectin ( FN) , CTGF, TNFα in the supernatant. Results ( 1) RhoA, ROCK- Ⅰand CTGF mRNA of the HMCs cultured under the high glucose expressed significantly higher than those in the normal group, and there was certain time-dependence. Besides, there was no statistic significance by comparing Man and NG. (2) Under the high glucose situation, after the fasudil pretreatment with different concentrations and 24 h or 48 h culture with high glucose, RhoA, ROCK- Ⅰ , CTGF mRNA expression was significantly decreased in HG + F, compared with HG, and there was certain concentration-dependence. (3) High glucose increased the FN, CTGF, TNFα protein secretion of HMCs in a time-dependent manner, but normal glucose and mannitol had no such effect. (4) After the fasudil pretreatment with different concentrations and culture with high glucose for 12, 24, 36, 48, 72 h, the FN, CTGF, TNFα protein secretion was significantly reduced compared with HG. Conclusion Fasudil can reduce the secretion of downstream inflammatory factors and cytokines by inhibiting high glucose-activated HMCs Rho/ROCK signaling pathway, and reduce the inflammation and fibrosis of HMCs. This provides a new basis for the therapeutic target in the treatment of diabetic nephropathy.     

叉头状转录因子O1与吡格列酮干预对肝癌HepG-2细胞葡萄糖消耗的影响

目的研究叉头状转录因子O1（FoxO1）及吡格列酮干预对高胰岛素诱导的肝癌HepG-2细胞葡萄糖消耗的影响及机制。方法1×10^-6mol／L胰岛素培养HepG．2细胞24h后,诱发培养基葡萄糖消耗减少建立细胞模型,将细胞分为对照组、空白质粒组、FoxOlsiRNA载体组、1×10^-5mol／L吡格列酮组。以普通培养基培养的细胞作为空白对照组。37℃、5％CO2培养箱中孵育24h,葡萄糖氧化酶法检测培养基中葡萄糖含量,逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测FoxO1mRNA和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）mRNA表达,Westernblot法检测PPAR-γ蛋白表达。将FoxO1mRNA、PPAR-γ mRNA、PPAR-γ蛋白表达与葡萄糖消耗量进行相关分析和曲线拟合。采用单因素方差分析及多样本均数两两比较进行统计学分析。结果高胰岛素培养24h较未诱导细胞培养基的葡萄糖消耗降低[分别为（1．36±0．03）和（2．93±0．05）mmol／L,P〈0．01],细胞Fox01mRNA升高（分别为0．513±0．016和0．425±0．011,P〈0．05）,PPAR-γmRNA降低（分别为0．260±0．025和0．441±0．012,P〈0．05）,PPAR-γ蛋白降低（分别为0．312±0．032和0．600±0．046,P〈0．05）。在抑制FoxO1和吡格列酮干预后此趋势有所缓解,逐渐接近于空白对照组。FoxO1mRNA、PPAR-γ mRNA和PPAR-γ蛋白表达与葡萄糖消耗量高度相关。结论FoxO1表达升高或降低对葡萄糖代谢产生不利影响;增强PPAR-γ表达可有效恢复高胰岛素诱导的高糖,增加肝细胞的胰岛素敏感性。     

糖尿病肾病大鼠肾小球叉头状转录因子O1的表达和作用

目的观察糖尿病肾病大鼠肾小球叉头状转录因子O1（FoxO1）的表达,探讨其与糖尿病肾病发生、发展的关系。方法8周龄健康雄性sD大鼠30只,链脲佐菌素（STZ）诱导建立糖尿病大鼠模型,采用随机数字表法分为糖尿病组（13只,普通饲料连续喂养4周）和糖尿病肾病组（13只,普通饲料连续喂养12周）。选取健康同龄大鼠18只作为正常对照组（NC组）。4、12周末检测体质量（BW）、血糖（BG）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、24h尿蛋白（UPro／24h）及尿白蛋白定量（UAIb）。处死动物后计算肾重指数（KI）;分光光度计测定大鼠肾皮质丙二醛（MDA）含量和总超氧化物歧化酶（SOD）活性;免疫组化法检测肾小球FoxO1蛋白、胶原Ⅳ及纤连蛋白水平;RT—PCR检测肾皮质Fox01mRNA水平;光镜及电镜下观察肾脏组织形态学变化。组间比较采用独立样本t检验。结果糖尿病肾病组肾皮质MDA蛋白、肾小球胶原Ⅳ和纤连蛋白水平显著高于糖尿病组[分别为（3．49±0．31）VS（2．34±0．28）nmol／mgProt,20．1±1．3VS10．1±1．0,10．6±1．3VS6．3±1．0,t值分别为9．290、20．967、9．119,均P〈0．05];糖尿病肾病组肾皮质SOD活性蛋白、Fox01mRNA表达水平明显低于糖尿病组[分别为（23±8）VS（43±6）U／mgProt,0．20±0．06VS0．35±0．05,t值分别为7．069、6．717,均P〈0．05]。FoxO1蛋白表达水平各组问比较无显著差异（均P〉0．05）。结论糖尿病肾病大鼠肾皮质FoxO1 mRNA表达水平降低,其机制可能通过下调其抗氧化靶基因使。肾脏氧化应激反应增强,从而参与糖尿病肾病发生发展的过程。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对高糖环境下内皮细胞氧化应激的影响

目的研究不同剂型表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对高糖诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）氧化应激损伤所引起凋亡的抑制作用及人核因子-κB P65（NF-κB P65）表达的影响。方法从新鲜脐带中分离培养HUVEC。用高糖诱导HUVEC表达NF-κB P65,实验组加入不同浓度的EGCG（12．5、25、50、100、200μmol／L）进行干预,PCR检测NF-κB P65mRNA的表达,AV-PI法检测凋亡细胞。结果高糖可诱导HUVEC凋亡,NF-κB P65表达增高;EGCG可抑制NF-κB P65的表达,降低凋亡指数,具有一定的时效关系、剂量关系。结论EGCG可在一定程度上抑制高糖诱导的氧化应激损伤所致的细胞凋亡。EGCG可能是通过抑制高糖所致的NF-κB增高,从而调控HUVEC细胞凋亡过程,发挥对HUVEC的保护作用。     

罗格列酮对高糖诱导下大鼠肾小球系膜细胞增殖及细胞周期的影响

以大鼠肾小球系膜细胞株(HBZY-1)为靶细胞,观察不同浓度不同时间罗格列酮(RSG)对高糖培养的系膜细胞的作用,发现RSG在一定范围内以剂量和时间依赖关系抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖,阻止系膜细胞由G1期进入S期,并诱导细胞凋亡。RSG有效减轻了高糖诱导的肾小球系膜细胞的病理损伤。     

阿托伐他汀和卡托普利对高压培养下大鼠系膜细胞产生PAI-1和tPA的影响

目的:观察阿托伐他汀和卡托普利干预对连续周期性波动的高静水压下大鼠肾小球系膜细胞(MC)产生PAI-1和tPA的影响。方法:大鼠MC分别在生理压力(5.32kPa,PP)、中压(7.98kPa,MP)、高压(10.64kPa,HP)环境下,不同药物(阿托伐他汀、卡托普利)中培养1、3、5、7d。Western Blotting法测定细胞裂解液中组织型纤溶酶原激活物(tPA)、纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)含量。结果:与PP组1d相比,PP组3、5、7dtPA、PAI-1水平无明显变化;MP和HP组从1d开始可见PAI-1水平呈时间依赖性升高,7d达到最高。tPA呈时间依赖性下降,MP、HP组在1d开始下降,7d达到最低。阿托伐他汀和卡托普利均能抑制MP、HP组PAI-1水平上升及tPA水平下降,2者合用可进一步抑制PAI-1水平上升及tPA水平下降。结论:周期性波动的高静水压可使PAI-1水平上升,tPA水平下降。阿托伐他汀和卡托普利可缓解高静水压引起的PAI-1上升,tPA下降,2者存在协同作用。     

高糖对人肾小球系膜细胞p38MAPK／CREB通路与纤维化的影响

目的探讨高糖环境下人肾小球系膜细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶／cAMP反应元件结合蛋白（p38MAPK／CREB）通路的活性及细胞外基质成分纤维黏连蛋白（FN）的变化。方法以5．6mmol／L葡萄糖培养基培养肾小球系膜细胞为对照组,观察高糖（30mmol／L）培养12、24、48小时。肾小球系膜细胞p38MAPK／CREB活性和FNmRNA、FN的变化。结果与对照组比较,高糖组各时间p-p38MAPK、P—CREB的表达均上升,并随着时间的延长,其表达逐渐升高;FN的表达升高,并且随着时间的延长,其表达进一步升高。结论高糖环境下p38MAPK／CREB通路被激活,FN表达增加,p38MAPK／CREB通路参与了细胞外基质重构的过程。     

叉头状转录因子O1对糖尿病大鼠足细胞影响的实验研究

目的 探讨叉头状转录因子O1（Fox01）对糖尿病大鼠足细胞的影响.方法 链脲佐菌素（STZ）诱导构建糖尿病大鼠模型90只,并采用简单随机抽样法分为糖尿病（DM）＋空慢病毒载体（LV-pSC-GFP）感染组（LV-NC组,n=30）,DM＋大鼠结构性活性FoxO1慢病毒载体（LV-CA-FoxO1）感染组（LV-CA组,n=30）,DM组（n=30）,另设对照组（NG组,n=30）注射相应体积的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液.于慢病毒感染后的2、4、8周末,测大鼠尿白蛋白、体重、血糖、血肌酐、尿素氮,光镜和透射电镜观察肾小球及其足细胞结构变化,实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting法检测大鼠肾皮质中FoxO1、足盂蛋白（PCX）、nephrin mRNA和蛋白的表达.多组间比较采用单因素方差分析.结果 与LV-NC、DM组相比,LV-CA组大鼠肾脏中FoxO1 mRNA、蛋白表达水平明显升高（F8W值分别为10 919.75、3 867.34,均P＜0.05）,尿白蛋白、血肌酐、尿素氮明显降低（2周除外）（F8W值分别为132.72、187.68、503.69,均P＜0.05）,肾脏中PCX、nephrin mRNA和蛋白水平明显升高（mRNA F8w值分别为778.94、478.10;蛋白F8W值分别为393.64、255.79,均P＜0.05）,肾脏病理学变化也明显改善,可见肾小球体积减小,系膜细胞及基底膜增生程度降低,足突融合也有一定程度改善.结论 通过靶向注射慢病毒载体来上调FoxO1的表达可改善DM大鼠足细胞的损伤.