重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1的构建及表达

目的:构建人肿瘤相关抗原MAGE-1基因原核表达载体.方法:从人肝细胞性肝癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增出MAGE-1基因.酶切鉴定后,将其插入pGEM-T载体,再克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h,SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况.结果:RT-PCR扩增出长度为927 bp的MAGE-1基因.重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导表达,目的蛋白约57 000,占菌体总蛋白的23%.结论:成功构建出重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1,该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.     

人黑色素瘤抗原MAGE-A10的基因克隆及原核表达

目的:扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A10(melanoma antigen A10)cDNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达. 方法:从人黑色素瘤细胞系LiBr中提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出MAGE-A10 cDNA,插入载体pMD18-T中. 测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达载体pGEX-4T-3-MAGE-A10,转化大肠杆菌BL21株进行表达. 经IPTG诱导表达,谷胱甘肽亲和层析获得重组目的蛋白. 结果:成功获得MAGE-A10编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致. 可以获得部分可溶性的原核重组蛋白,经亲和层析和分析,证实融合蛋白占总量的58.9%. SDS-PAGE分析其相对分子质量(Mr)为67 000,Western blot证实为目的蛋白. 结论:成功获得MAGE-A10 cDNA,构建得原核表达载体并获得高效表达. 本研究为制备MAGE-A10 mAb及研究MAGE-A10可能参与肿瘤发生发展的机制奠定了基础.     

PRL-3基因的克隆及其原核表达载体的构建表达

目的 克隆人PRL-3基因并构建其原核表达载体.方法 设计PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW480总RNA,用RT-PCR方法获取人PRL-3 cDNA.经T-A克隆,通过双酶切鉴定及测序确认后,构建人PRL-3基因的原核表达载体pGEX-4T-1-PRL-3.结果 成功扩增出人PRL-3全长cDNA,并构建pGEX-4T-1-PRL-3原核表达载体,测序结果表明PRL-3全长cDNA与GenBank中PRL-3序列完全一致,SDS-PAGE胶分析表明,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了重组蛋白.结论 获得人PRL-3基因全长cDNA并构建其原核表达载体,使其在大肠杆菌中获得了高效表达,为深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定了基础.     

膜联蛋白A5 cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人膜联蛋白A5 cDNA并在大肠杆菌系统内作表达.方法:利用RT-PCR技术从人胎盘组织的总RNA扩增膜联蛋白A5的cDNA序列,将该基因插入GST融合表达载体pGEX-5T,在tac 启动子控制下,IPTG诱导表达GST融合蛋白.以亲合层析法纯化表达的融合蛋白,用KPTT法验证抗凝血活性.结果:凝胶电泳显示PCR扩增产物的长度为978 bp,重组质粒测序结果表明,插入片段与人膜联蛋白A5的序列完全一致.在IPTG诱导下,K802重组菌高效表达出相对分子质量为58 000的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26%.纯化蛋白具有很强的抗凝血活性.结论:成功克隆人膜联蛋白A5基因并在大肠杆菌中高效表达.     

人Ⅱ型穿膜蛋白CD74基因片段的克隆及原核表达

[目的]扩增、克隆人Ⅱ型穿膜蛋白CD74基因片段,并在大肠杆菌中表达出具有生物活性的重组CD74蛋白.[方法]根据人CD74基因序列,设计、合成PCR引物,利用RT-PCR技术,从人Raji B细胞中扩增CD74基因片段.将CD74基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达载体pGEX-4T-CD74,并转化工程菌BL21(DE3).用IPTG诱导BL21(DE3)中导入的CD74基因的表达,并行SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.用GSTrap亲合柱纯化重组CD74蛋白,通过体外血管生成实验鉴定重组CD74蛋白对巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的阻断作用.[结果]扩增出人CD74基因片段,并成功构建了重组质粒pGEX-4T-CD74.测序结果显示,克隆的CD74 cDNA长480 bp,序列与文献报道一致.经IPTG诱导,特异表达出可溶性的44 KDa的重组蛋白,其可被人CD74抗体识别.体外血管生成实验结果显示,重组CD74蛋白能特异地阻断MIF的促血管生成作用.[结论]克隆了人CD74基因片段,并在大肠杆菌中表达出具有生物活性的重组CD74蛋白.     

人DNA聚合酶δ结合蛋白PDIP38的克隆、表达和纯化

[目的] 克隆表达和纯化野生型及 3种缺失突变型人 PDIP38 谷胱甘肽 S 转移酶( glutathion S transferase,GST)融合蛋白.[方法]采用常规 PCR扩增法得到野生型及 3种缺失突变型人 PDIP38的 cDNA; 4种 cDNA与 GST融合载体 pGEX-4T-1重组并转化大肠杆菌 DH5α;采用 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切鉴定插入的 DNA序列;采用谷胱甘肽-sepharose 4B亲和层析柱纯化重组蛋白.[结果] 野生型和 3种缺失突变型人 PDIP38 GST融合蛋白在 DH5α中高效表达;经谷胱甘肽-sepharose 4B亲和层析柱一步纯化后, 4种蛋白的纯度均达到 85%以上.[结论] pGEX-4T-1 GST蛋白融合载体可高效表达人 PDIP38蛋白;用谷胱甘肽-sepharose 4B亲和层析柱一步纯化法可简单、快速地得到高纯度的蛋白.     

TTV病毒ORF1抗原的基因克隆及原核表达

目的 扩增和克隆TTV-ORF1 DNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达.方法 从TTV病毒感染者外周血中提取DNA,用PCR从中扩增出TTV-ORF1 DNA,插入载体pGEM-T Easy中;测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达载体pGEX-4T-1-ORF1,转化大肠杆菌BL21株进行表达.结果 成功获得TTV-ORF1编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致.诱导表达得到51kD的TTV-ORF1融合蛋白,占细菌总蛋白量的27.2%.Western blot证实为目的蛋白.结论 成功获得TTV-ORF1 DNA,构建得原核表达载体并获得高效表达.为TTV的ELISA检测和疫苗提供抗原.     

IgE低亲和力受体基因的克隆、表达及初步鉴定

目的 利用基因重组的方法建立IgE低亲和力受体(FceR Ⅱ)基因的原核表达系统.方法 用RTPCR方法从过敏性疾病病人外周血淋巴细胞扩增FceR Ⅱ cDNA基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建原核表达载体 FceR Ⅱ-pGEX-4T-1,将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta,诱导表达FceR Ⅱ蛋白,通过割胶回收纯化,并用Western blot检测FceR Ⅱ的表达.结果 测序表明所扩增FceR Ⅱ cDNA基因,与已报道的序列一致.获得的重组蛋白经Western blot鉴定可以和人IgE特异性结合.结论 成功构建了FceR Ⅱ-pGEX-4T-1表达载体,获得了能和人lgE特异性结合的重组蛋白,为下一步FceR Ⅱ单克隆抗体的制备及应用研究打下了基础.     

沙眼衣原体质粒蛋白pORF5原核表达及免疫原性鉴定

目的 构建沙眼衣原体(CT)pORF5蛋白基因重组质粒pGEX-6p/pORF5,表达并纯化质粒蛋白pORF5,并鉴定其免疫原性.方法 用PCR法扩增pORF5基因,定向插入pGEX-6p原核表达载体构建原核表达重组体pGEX-6p/pORF5,重组体经酶切、PCR及测序鉴定后,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达pORF5融合蛋白.融合蛋白纯化后免疫BALB/c鼠,ELISA及Western-blot分析pORF5质粒蛋白免疫原性及免疫反应性.结果 PCR扩增出795 bp基因片段,序列测定证实重组质粒插入片段与GenBank登陆的D型Ct一致;pORF5融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达;ELISA检测免疫小鼠的血清效价为1:25 600.结论 pORF5蛋白在原核细胞中可有效表达并具有较好的免疫原性,为进一步研究该蛋白的结构功能、阐明Ct的致病机制、研制基因工程疫苗提供了有利的条件.     

人神经营养因子-3基因在大肠杆菌中的克隆和表达

目的 :获得人神经营养因子 - 3 (hNT - 3 )在大肠杆菌中的克隆并表达。方法 :采用PCR方法从 2 0周人胎脑cDNA文库中扩增hNT - 3基因 ,通过双酶切法在M 13mp18载体上克隆获得全长基因 ,将正确全长基因插入PBV2 2 0载体 ,通过选择合适宿主菌获得hNT - 3的高效表达。结果 :获得全长基因完全正确的hNT - 3基因 ,获得占细菌总蛋白 3 0 %的hNT - 3表达菌株。结论 :本研究获得了序列正确的hNT - 3基因克隆 ,并实现了在大肠杆菌中的高效表达。     

人canstatin基因的克隆、表达、纯化及其生物活性测定

目的:克隆人Canstatin cDNA,在E.coli中融合表达和纯化,并测定表达产物抑制新生血管生成活性.方法:从中国人胎盘组织提取总RNA,RT-PCR扩增出Canstatin cDNA,克隆入pTYB1载体中并测序,构建原核表达载体pTYB1-hCAN,IPTG诱导表达,几丁质亲和纯化,鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成实验进行活性测定.结果:RT-PCR产物约为700bp,测序结果与文献报道序列一致.构建了人Canstatin原核表达载体vTYB1-hCAN,在大肠杆菌中表达.纯化的融合蛋白在CAM实验中能明显抑制血管生成.结论:克隆、表达了具有生物学活性的人canstatin蛋白.     

人胚生殖嵴干细胞多能性调节基因Oct4 的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人胚生殖系细胞多能性调节基因Oct4,并使其在大肠杆菌中表达.方法:取4～6周人胚胎分离生殖嵴和背侧肠系膜,利用RT-PCR技术扩增编码Oct4的全长cDNA,并插入到原核表达载体pGEX5T中,构建成 pGEX5T-Oct4重组质粒.β硫代半乳糖苷(IPTG)诱导使该基因在k802菌中表达.结果:用PCR方法扩增获得大小约1.1 kb条带;全自动测序与GenBank中登录的序列97％同源.获得了pGEX5T-Oct4 重组子并在k802菌中获得了表达,SDS-PAGE分析有一特异性的62 000条带.结论:扩增和克隆了人胚生殖系细胞多能性调节蛋白Oct4 全长cDNA并在大肠杆菌中获得表达,为进一步研究人胚生殖系细胞多能性调节与分化奠定了基础.     

人bit1 cDNA基因的克隆、测序及表达

目的: 克隆并在大肠杆菌中表达人bit1 cDNA基因. 方法: 从新鲜的胎盘组织中提取总RNA,经反转录成单链cDNA, 以此为模板扩增出人bit1 cDNA基因,将该基因克隆入载体pUC19中,测序正确后亚克隆入表达载体pGEX-4T3中进行表达. 结果: 利用所设计的引物扩增出完整的人bit1 cDNA基因.以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得表达,激光薄层扫描显示表达蛋白占总蛋白的40.6%. 结论: 获得了人bit1 cDNA基因及其原核表达产物,对研究人Bit1蛋白的功能具有重要的意义.     

人Delta-like4~(ext)-93-217原核表达、纯化及蛋白活性检测

目的:原核表达、纯化融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217,并对其活性进行检测.方法:采用PCR方法扩增hDll4ext-93-217多核苷酸序列,克隆入pMD18T载体.测序正确后,将其亚克隆入pET32a(+)原核表达载体,获得pET32a(+)-hDll4ext-93-217载体.以该载体转化E.coli菌株BL21,IPTG诱导其表达.以镍离子螯合柱纯化目的蛋白,采用SDS-PAGE,Western Blot方法鉴定目的蛋白的表达;采用萤光素酶报告基因系统检测目的蛋白活性.结果:通过PCR扩增获得了目的片段hDll4ext-93-217,成功构建了该蛋白的原核表达载体pET32a(+)-hDll4ext-93-217.采用SDS-PAGE,Western Blot等方法均可检测到目的可溶性融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217的表达.融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217在25℃,IPTG终浓度0.5mmol/L条件下诱导表达8h的蛋白表达量最高.以镍离子螯合柱纯化,获得纯化融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217浓度为1.5g/L,其荧光素酶报告基因的刺激活性与空白对照...     

人tau融合蛋白的原核表达及纯化

目的构建人His-tau和GST-tau融合蛋白表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达及纯化。方法以质粒pEGFP-tau为模板通过PCR扩增出人tau全长cDNA,并构建到原核表达载体pET28a和pGEX-5X-1中,挑选阳性重组子,经限制性内切酶鉴定后转化到大肠杆菌BL21中,然后用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE染色及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白。分别使用His Bind Resin和Glutathione Sepharose 4B与融合蛋白结合来纯化融合蛋白。结果成功构建原核表达质粒pET28a-tau和pGEX-5X-1-tau并在大肠杆菌BL21中诱导其大量表达。经His Bind Resin和Glutathione Sepharose 4B纯化后,可以得到较纯化的His-tau和GST-tau融合蛋白。SDS-PAGE及Western-blot分析显示,特异性的抗tau单克隆抗体(tau-5)所识别的融合蛋白分子量与理论值相近。结论构建了人tau两种原核表达的融合蛋白质粒,并高效表达和纯化了该蛋白,为进一步的tau与其它功能性蛋白的相互作用研究奠定了基础。     

杀菌/通透性增强蛋白N端cDNA的克隆和表达

目的　克隆杀菌 /通透性增强蛋白 (BPI) N端 c DNA,构建原核和真核表达载体 ,分别在大肠杆菌和 CHO细胞中表达 BPI蛋白 .方法　提取正常人外周血多形核粒细胞 (PMN)总 RNA,经套式 RT- PCR法扩增出 BPI N端 c DNA片段 ,将其克隆入 p GEM- T easy载体中并进行酶切鉴定和序列测定 .然后亚克隆入 p GEX- 4T- 1质粒 ,转化大肠杆菌 ,进行诱导表达 ,表达产物用 Western blot法鉴定 .同时将该基因片断克隆入 pc DNA3质粒 ,通过脂质体转染 CHO细胞 ,免疫荧光法鉴定 BPI的表达 .结果　获得 BPI N端长度为 72 6 bp的基因片断 .序列分析证实该片断中有 4个点突变 ,但均不在活性中心 .在大肠杆菌中的表达产物为相对分子质量 5 1× 10 3的GST- BPI融合蛋白 ,Western blot反应中在 5 1× 10 3处有显色区带 .G418筛选出的阳性 CHO细胞在免疫荧光反应中产生荧光反应 .结论　我们成功的在大肠杆菌和 CHO细胞中表达了 BPI2 5蛋白 ,为进一步研究 BPI生物学功能奠定了基础     

重组Trx-ApoO融合蛋白的构建与表达

目的:构建人载脂蛋白O (apolipoprotein O, ApoO)表达质粒,用pET原核表达系统制备重组抗原Trx-ApoO融合蛋白.方法:以人类肝脏cDNA文库为模板,聚合酶链反应(PCR) 法扩增ApoO DNA,将测序正确的目的基因片段插入质粒pET-32a (+)相应位点构建重组质粒并转化E.coli B...