人全外显子组测序IDT捕获探针的性能验证

目的探讨已建立的二代测序技术进行人全外显子组测序项目对变异的检出性能。 方法对4例实验室能力比对验证样本和4例已知结果样本进行全外显子组检测,分析点变异和插入缺失变异,从检测准确度、检测灵敏度、检测特异性、精密度和可报告范围等方面进行性能评估。数据质量控制以目标区域覆盖率、捕获特异性和平均深度为基础。 结果数据输出量大于8G,实现了目标序列区域99.7%以上的覆盖率,捕获特异性86%以上,平均测序深度100×以上,Q30大于90%,对SNV的检出率达100%,50 bp以下Indel检出率达100%。 结论本标准操作在验证范围内对变异的检出能力达到应用的要求。     

无精子症患者基因检测分析

目的:利用全外显子测序技术,筛选无精子症患者相关基因,丰富男性不育基因库。方法:抽取20例无精子症患者外周血,提取DNA,使用杂交捕获方法构建DNA文库,采用高通量测序技术检测人类全外显子组中20099个基因的外显子区及旁侧内含子区(20bp),将测序数据与人类基因组hg19参考序列进行比对,筛选变异基因,变异位点进行Sanger测序验证。结果:共计筛选出26个基因43个变异位点,排除15个常染色体隐性遗传的单个变异位点及13个与精子运动相关的变异位点,剩余11个基因的15个变异位点可能与精子发生障碍相关,其中包括FAM71B、STARD9、CLTCL1、PCBP3、S100PBP等5个在睾丸组织高表达基因,SYCE3、EFCAB6、DDX4、KDM5D、RGS22、MTL5等6个基因可能与精子发生障碍相关。结论:通过研究筛选到可能影响男性不育的基因,为男性不育的基因诊断研究提供参考。     

靶向捕获高通量测序技术在遗传性疾病分子诊疗中的应用

目的应用靶向捕获高通量测序技术对常见遗传性疾病进行基因突变分析,为患者及家庭提供基因诊断的依据。方法对1例神经纤维瘤家系和1个脊椎骨骺发育不良的家系应用高通量测序技术进行相关基因检测。结果在神经纤维瘤患者中检测到符合临床提示的致病性基因突变,NF1基因第16内含子c. 1845+1_1845+5delGTAAG,脊椎骨骺发育不良的家系中检测到TRAPPC2基因第5外显子c. 271_275delCAAGA半合子致病突变。Sanger测序的验证结果与高通量测序一致。结论靶向捕获高通量测序技术可以在基因组水平对一些遗传性疾病进行分子诊断,评估预后,并为患者及亲属提供遗传咨询,预测再发风险以及提供产前诊断。     

常染色体隐性遗传多囊肾病 PKHD1基因检测

目的对1例引产的常染色体隐性遗传性多囊肾病胎儿的多囊肾/多囊肝病变1基因（ PKHD1）进行基因突变鉴定和结果分析。方法采集引产胎儿及其父母外周静脉血,分别提取基因组DNA,应用PCR扩增、DNA直接测序等技术手段对该胎儿及其父母进行PKHD1基因突变分析。结果胎儿PKHD1基因出现几种序列变异：PKHD1基因第7号内含子发生ISV7＋51G＞T变异;第17号外显子发生c．1587T＞C（p．N529N）变异;第32号外显子发生c．3785C＞T（p．A1262V）变异,导致编码PKHD1蛋白多肽链第1262号氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸。结论 PKHD1基因序列变异可能是常染色体隐性遗传性多囊肾病的病因,PKHD1基因检测可作为产前筛查的有效诊断手段。     

通过外显子组测序对1例孤独症谱系障碍患者的致病基因分析

目的 应用外显子测序技术对1例孤独症谱系障碍的男童进行外显子组测序分析,寻找致病基因。方法 选择1例就读于自闭症特殊学校的5岁男童,收集其临床资料,提取外周静脉血DNA,应用Nimblegen外显子序列捕获芯片及高通量测序技术对外显子区域进行测序。结果 通过全外显子组捕获测序发现了非同义突变11 309个,移码突变365个,同义突变23 075个,其中发现有4个基因的突变已有文献报道可能与孤独症谱系障碍的发病有关,这4个基因包括PTEN、AFF2、LAMB1、NRCAM。结论 应用外显子组捕获测序对该例孤独症谱系障碍的男童进行测序分析显示,大量单核苷酸多态性可能与该病的发生有关,也进一步证实了PTEN、AFF2、LAMB1、NRCAM这4个基因可能与孤独症谱系障碍的发生有关,有待进一步大样本研究及实验室研究验证其在孤独症谱系障碍发病中的具体机制。     

三种人全外显子组捕获探针的性能比较

目的比较不同平台3个全外显子组探针的性能,为以后建立标准流程提供数据支撑。 方法提取人EDTA全血或FFPE组织gDNA,通过酶切方法将gDNA片段化,并为每一个样本的片段化后的DNA加上特异序列的接头,利用IDT、Human Exome和MedExomed三种不同的液相探针的方法将目标基因捕获出来,用Illumina的NextSeq 500二代测序仪进行测序;分析测序数据,比较不同捕获探针的靶向覆盖率、捕获特异性、变异检出能力等。 结果本研究所选入组的3种探针,IDT和MedExome展示了对CCDS和Refseq数据库很好的覆盖率(均>95%);都表现了对靶区域很高的覆盖率(均>99%);IDT探针对血样gDNA捕获特异性(76.96%±0.75%,n=6),明显高于Human Exome (67.63%±1.62%,n=6) (P<0.001);IDT对FFPE标准品捕获特异性为84.48%±0.64%(n=3),明显高于MedExome的71.07%±0.91%(n=3)(P<0.01)。变异输出数量上,Human Exome最高。 结论IDT探针的捕获特异性明显高于其它2种,而在变异输出数量上,Human Exome探针最高。     

高通量检测技术对假肥大型肌营养不良分子诊断的研究

目的利用高通量检测技术对假肥大型肌营养不良(DMD/BMD)患者进行分子诊断,检测DMD基因上各种类型的变异,评估组合的分子诊断技术应用于假肥大型肌营养不良患者的价值。方法对106例临床疑似为假肥大型肌营养不良的患者,利用CNVplex?技术检测致病基因拷贝数变异,同时利用靶向捕获及高通量测序检测致病基因单核苷酸水平变异,对患者进行精确的分子诊断。结果通过组合的高通量检测技术,检测到其中85例患者存在DMD基因的致病性变异,包括62例不同大小的外显子缺失和重复,9例单核苷酸水平小缺失和重复,8例无义变异,2例错义变异和2例剪接位点变异。结论分子诊断对假肥大型肌营养不良患者意义重大,组合的高通量检测技术能检测到不同类型的致病基因变异,精确的分子诊断结果对假肥大型肌营养不良患者的诊断和家系的遗传咨询有着重要意义。     

常染色体显性多囊肾病治疗进展

常染色体显性多囊肾病(ADPKD)是一种常见的遗传性疾病,其特点是肾脏、肝脏和其他器官有多发囊肿形成,囊肿进行性增大,约在50岁时导致终末期肾脏病.ADPKD主要由两个基因的变异引起:PKD1和PKD2.     

citrin缺陷所致新生儿肝内胆汁淤积症的SLC25A13基因IVS16ins3kb突变类型分析

目的探讨citrin缺陷所致新生儿肝内胆汁淤积症(NICCD)患儿SLC25A13基因IVS16ins3kb突变类型的第二代测序技术(NGS)数据分析特点。方法选择2017年7月与2020年4月,浙江大学医学院附属金华医院儿科收治的符合NICCD临床诊断标准,采用染色体组分析工具箱(GATK)、XHMM、CNVkit软件,对患儿NGS靶向外显子捕获测序数据进行单核苷酸变异(SNV)、插入与缺失突变、拷贝数变异(CNV)分析,仅提示SLC25A13基因单个位点杂合突变的2例患儿(患儿1、2)为研究对象。采用回顾性分析方法,收集患儿1、2的临床病例资料,包括病史、实验室检查结果、基因检测结果、治疗与预后等。利用福君基因动态实验室信息管理系统3.0(FLIMS系统),采用split read方法,对患儿1、2的NGS靶向外显子捕获测序原始数据(fastq格式)进行IVS16ins3kb突变类型分析,并采用长链、高保真PCR(LA-PCR)方法进行验证。本研究遵循的程序符合浙江大学医学院附属金华医院医学伦理委员会规定,并获得该委员会批准(审批文号:2018-119)。结果①病史采集:患儿1(女性)与患儿2(男性),分别因皮肤黄染2个月余与4个月余,于本院就诊,就诊时年龄分别为2个月+19 d、4个月+16 d,均为足月儿、均无家族遗传性疾病史。②实验室检查、治疗:入院时,对患儿1、2干血片采取串联质谱仪进行遗传代谢病检测结果显示,血液中瓜氨酸、甲硫氨酸等多种氨基酸含量显著增高;肘静脉血生化检查结果显示,血清氨、乳酸浓度及血清总胆红素(STB)、血清直接胆红素(SDB)、血清间接胆红素(SIB)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰转移酶、碱性磷酸酶均异常增高。对患儿1、2均采取无乳糖配方奶喂养3个月后,血液生化指标均明显好转。③NGS靶向外显子捕获及Sanger测序法验证结果:采用GATK、XHMM、CNVki软件对患儿1、2的NGS靶向外显子捕获测序数据进行SNV、插入与缺失突变、CNV分析结果提示,分别存在SLC25A13基因9号外显子c.852_855delTATG、16号外显子c.1638_1660dup杂合移码、功能缺失性热点突变,经Sanger测序法验证,上述突变分别遗传自患儿1、2父亲。④使用split read方法,对患儿1、2的NGS靶向外显子捕获测序原始数据(fastq格式)进行分析发现,SLC25A13基因16号内含子区域特征性split read一端为6号染色体DNA序列,另一端为7号染色体DNA序列,SLC25A13基因16号内含子区域特征性split read发生结构变异,可能为7号染色体SLC25A13基因发生IVS16ins3kb插入突变。⑤采用LA-PCR方法验证结果提示,患儿1、2分别存在SLC25A13基因c.852_855delTATG+IVS16ins3kb及c.1638_1660dup+IVS16ins3kb复合杂合热点突变,均被确诊为NICCD患儿。结论对于NGS结果呈阴性或检出SLC25A13基因单个位点杂合突变的临床疑似NICCD患儿,可采用split read方法,对其NGS原始数据(fastq格式)进一步进行IVS16ins3kb突变分析,降低对该病患儿漏诊及误诊率。     

靶向捕获-高通量测序法对一个先天性白内障家系致病基因的研究

目的:应用靶向高通量测序技术鉴定一个常染色体显性遗传先天性白内障家系的致病基因。方法:采用靶向捕获已知白内障致病基因并行高通量测序,筛选出候选基因,并对其进行家系内外的共分离检验。结果:该家系符合常染色体显性遗传规律,所有患者均为核性白内障。靶向基因测序发现,位于主要内源性蛋白MIP基因的一个杂合突变c.97CT(p.R33C)可能是该家系的致病突变,该变异造成MIP基因编码的水通道蛋白氨基酸序列错义改变,并引起蛋白质结构异常,从而影响其功能。通过一代测序验证并确定该杂合突变为该家系的致病突变。结论:MIP基因c.97CT(p.R33C)突变是造成该先天性白内障家系致病的分子机制。     

Targeted capture and sequencing of Orientia tsutsugamushi genomes from chiggers and humans

Scrub typhus is a febrile disease caused by Orientia tsutsugamushi, transmitted by larval stage Trombiculid mites (chiggers), whose primary hosts are small mammals. The phylogenomics of O. tsutsugamushi in chiggers, small mammals and humans remains poorly understood. To combat the limitations imposed by the low relative quantities of pathogen DNA in typical O. tsutsugamushi clinical and ecological samples, along with the technical, safety and cost limitations of cell culture, a novel probe-based target enrichment sequencing protocol was developed. The method was designed to capture variation among conserved genes and facilitate phylogenomic analysis at the scale of population samples. A whole-genome amplification step was incorporated to enhance the efficiency of sequencing by reducing duplication rates. This resulted in on-target capture rates of up to 93% for a diverse set of human, chigger, and rodent samples, with the greatest success rate in samples with real-time PCR C_t values below 35. Analysis of the best-performing samples revealed phylogeographic clustering at local, provincial and international scales. Applying the methodology to a comprehensive set of samples could yield a more complete understanding of the ecology, genomic evolution and population structure of O. tsutsugamushi and other similarly challenging organisms, with potential benefits in the development of diagnostic tests and vaccines.     

混合测序技术在高通量测序中的应用

介绍了高通量测序在面向大样本时所面临的问题,分析了高通量测序技术的原理和特点及其在解决大样本测序时的技术优势,并总结了检测矩阵的构建方法,指出了混合测序能够应用于部分高通量测序实验并可大幅节约测序成本,展望了混合测序技术在高通量测序中的应用前景.     

DA8600测序平台对EGFR基因检测最低DNA用量的探讨

目的基于DA8600测序平台,探讨Ampli Seq建库方法检测EGFR基因突变所需最低样本DNA用量,以评估下一代测序(next generation sequencing,NGS)检测技术的性能。方法本研究选择10例EGFR突变的石蜡包埋组织样本,分别取1 ng、5 ng、10 ng、20 ng样本DNA进行文库构建,使用DA8600半导体测序仪进行检测,并比较检测结果。结果 10 ng和20 ng DNA用量均可全部准确检出EGFR基因突变;5 ng DNA用量准确检出7例EGFR基因突变,1例文库质量不合格无法进行测序,1例无法检出EGFR突变,1例测序数据量不足检测失败;1 ng DNA用量构建文库全部质量不合格,无法进行测序。结论通过对10例样本不同DNA用量构建文库的检测结果分析,说明10 ng DNA即可采用Ampli Seq建库方法在DA8600半导体测序仪进行EGFR基因突变检测。