质粒pUDKH基因治疗大鼠肢体动脉闭塞病的实验研究

目的　研究携带人肝细胞生长因子 (HGF)基因的质粒pUDKH对大鼠肢体动脉闭塞病的治疗效果及最低有效剂量。方法　手术结扎大鼠左侧后肢股动脉 ,造成急性缺血性血管病模型。并随机分为 5组 ,每组 10只 ,在手术后即刻将 pUDKH以 5 0 μg、10 0 μg、2 0 0 μg、4 0 0 μg、0 μg剂量一次多点注射于结扎部位肌肉内 ,并于注射后第 10天 ,评价各组血管新生及肌肉组织的情况。另 12只大鼠手术后即刻局部多点注射 2 0 0 μgpUDKH( 6只 )或pUDK( 6只 ) ,注射后不同时间点 (第 3,5 ,10 ,14 ,2 1天 )检测骨骼肌组织中HGF的表达。结果　于转移pUDKH质粒后第 3、5、10、14天肌肉标本与对照组比较均可见较强的HGF的表达。第 10天观察到pUDKH组 (除 5 0 μg组外 ) ,在肌肉组织间或软组织中有丰富的小血管形成。半定量评价各组血管再生程度 ,pUDKH 10 0 μg组 ( 0 96± 0 0 7)、2 0 0 μg组 ( 1 97± 0 91)、4 0 0 μg组 ( 2 2 6± 1 0 0 )与对照组 ( 0 2 7± 0 0 4 )之间差异有显著意义 (P <0 0 5 )。结论　人肝细胞生长因子基因治疗大鼠肢体动脉闭塞病是有效的 ,且以 10 0 μg组为最低有效剂量。     

腰椎管狭窄动物模型的实验研究

目的：建立腰椎管狭窄(lumbar spinal canal stenosis,LSCS)的动物模型,在此基础上进行步态、知觉过敏、电生理及组织学研究。方法：LSCS组选用8周的Wistar大鼠28只,切除腰5腰椎棘突、椎弓,并移植碎骨片于此处。Sham手术组为6只,仅切除椎弓。对照组为3只,不作任何处理。术后8、9个月进行步态、知觉过敏及脊髓体感诱发电位的波幅(SSEP)的测定,同时,术后9个月进行组织学分析。结果：LSCS组,术后8个月步行距离明显减少,步容出现变化,Seep的振幅明显减小及知觉出现过敏。术后9个月步行距离明显减少、步容出现变化、知觉出现过敏及Seep的振幅明显减小的同时,椎管横断面积减少,粗纤维减少而细纤维增多。结论：腰椎管狭窄后,大鼠步行分析、电生理学及组织学均出现明显异常。为以后药物治疗的研究打下基础。     

An experimental study on N-ethyl-N-nitrosourea-induced rat brain gliomas

ＡｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｙｏｎＮ－ｅｔｈｙｌ－Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ－ｉｎｄｕｃｅｄｒａｔｂｒａｉｎｇｌｉｏｍａｓＢｉａｎＸｉｕｗｕ（卞修武）；ＳｈｉＪｉｎｇｑｕａｎ（史景泉）；ＴａｏＨａｉｐｅｎｇ（陶海鹏）；ＹａｎｇＧｕａｎｇｈｕａ...     

转Nurr1基因联合全反式维甲酸及银杏提取物诱导的神经干细胞治疗帕金森病大鼠模型

目的探讨核受体相关因子(Nurr1)基因修饰联合全反式维甲酸(ATRA)及银杏提取物(Egb)诱导的神经干细胞(NSCs)移植治疗帕金森病动物模型的疗效及作用机制。方法将建模成功的帕金森病SD大鼠模型分为4组,将溴尿嘧啶(Brdu)标记的单纯胚胎NSCs(NSCs组)、RA/Egb诱导分化的NSCs(RA/Egb组)、单纯转Nurr1基因的NSCs(Nurr1组)和转Nurr1基因联合RA/Egb诱导分化的NSCs(Nurr1 RA/Egb组)分别注入模型鼠右侧纹状体。观察其病理性旋转行为的改善,采用免疫组化染色方法检测酪氨酸羟化酶(TH)、Nurr1、神经丝巢蛋白(nestin)表达及Brdu标记情况,观察移植的NSCs在体内的存活、迁移与分化,并进行TH阳性细胞计数研究脑内多巴胺含量的变化。结果各组动物脑内移植后动物旋转行为较前均有改善,尤以Nurr1 RA/Egb组改善最明显,RA/Egb组次之。免疫组化可见各组移植区均有TH阳性细胞表达,其中Nurr1 RA/Egb组TH染色细胞数更密集,形态更成熟,病理学改善最明显。在Nurr1组和Nurr1 RA/Egb组移植区可见有Nurr1散在表达,在NSCs组和RA/Egb组移植区未见Nurr1明显表达。nestin检测未见有明显阳性表达。结论转Nurr1基因联合全反式维甲酸及银杏提取物诱导的神经干细胞脑内移植后可以存活、迁移、分化并表达TH和Nurr1,部分地改善PD模型旋转行为,增加脑内TH表达。     

成纤维细胞介导的人IL-10基因疗法的实验研究

目的：建立ＩＬ－１０基因疗法的实验模型，并动态观察其体内ＩＬ－１０分泌水平。方法和结果：构建携带鼠ＩＬ－１０基因的重组逆转录病毒载体，体外转染小鼠ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞，筛选到１株高分泌ＩＬ－１０的细胞克隆株；将此阳性克隆株移植到小鼠腹腔内，可在小鼠血清中检测出ＩＬ－１０的活性。结论：成纤维细胞能成功地将ＩＬ－１０基因导入体内并有效表达     

转GGCX基因治疗兔骨性关节炎的体外实验研究

目的 探索GGCX基因对兔骨性关节炎软骨细胞MMP13的影响及其在兔骨性关节炎软骨退变中的作用.方法 取体质量(2.0±0.2)kg日本大耳兔6只,随机分为3组,每组设立一只对照兔,分别在2、4、6周使用膝前交叉韧带切断术构建模型,6周后模型兔构建成功,分离关节软骨,经消化分离后将软骨细胞接种到6孔细胞培养板,将软骨细胞分为空白组、阴性对照组(转染不合GGCX基因慢病毒)、转染组(转染含GGCX基因慢病毒)3组.转染组则均以LipofectamineTM 2000为转染媒介.用PCR法及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测GGCX和MMP13的表达.结果 转染组GGCX有较高的表达水平;转染组MMP13的表达水平降低,且二者与空白组及阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P＜o.05).结论 GGCX基因过表达可明显降低其软骨细胞MMP13的表达,为将基因治疗运用于体外骨性关节炎提供实验基础.     

下颌骨骨缺损基因治疗动物模型的建立

目的：建立用于研究下颌骨骨缺损基因治疗的实验动物模型及基因导入方法。方法：用30只新西兰大白兔作为实验动物,在左侧下颌骨体部造成直径5mm圆形贯通性骨缺损．以明胶海绵作为载体。将含有人肝细胞生长因子全长cDNA片段的表达型质粒(pUDKH)直接应用于15只兔骨缺损的局部．对另外15只应用等量空质粒(pUDK)作为对照,对骨缺损的愈合情况进行大体形态学、X线和组织学评价。结果：下颌骨骨缺损修复过程中,在形态学、X线和组织学等方面,应用pUDKH组的骨愈合情况优于pUDK组。结论：此实验建立的下颌骨骨缺损实验动物模型,以及通过直接应用细胞因子裸DNA治疗下颌骨骨缺损的基因导入途径．为骨再生和骨缺损的基因治疗研究提供了新的方法。     

经眶下孔注射相关炎症因子制造大鼠三叉神经痛模型的实验研究

目的：经 SD 大鼠眶下孔注射炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）以制造一种新型的大鼠三叉神经痛（TGN）模型。方法将大鼠随机分为4组,即生理盐水组（NS 组）、TNF-α组、IL-1β组、TNF-α+ IL-1β组;各组分别于大鼠眶下孔注射等量的生理盐水和 TNF-α或 IL-1β。观察并比较注射后不同时段各组大鼠注射侧触须垫机械痛阈、自发行为学改变以及电镜观察组织改变。结果从注射后3 d 至注射后8周,各炎症因子注射组大鼠均出现注射侧触须垫痛觉过敏及搔抓面部次数增多,同 NS 组相比,差异有统计学意义（P <0.05）;各炎症因子注射组间差异无统计学意义。各炎症因子注射组大鼠眶下神经及三叉神经节均出现不同程度的脱髓鞘改变,而 NS 组大鼠则无脱髓鞘现象。结论利用炎症因子 TNF-α、IL-1β经大鼠眶下孔注射,可使大鼠产生类似 TGN 症状和病理学变化,该 TGN 模型更接近于临床且造模方法简便。     

普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤作用机制的动物实验研究

目的探讨普萘洛尔对人增生期血管瘤裸鼠种植瘤生长的影响。方法将手术切除的1例儿童增生期毛细血管瘤瘤体组织分切成组织块,分别植入16只幼小裸鼠( BALB/c nu/nu)的皮下,每只4处。建立人增生期血管瘤裸鼠模型,于第45天随机分成两组：普萘洛尔组的每只裸鼠用0.01%普萘洛尔溶液0.4 ml灌胃,每天1次,连续1周;给予同样体积的蒸馏水每天1次,连续1周灌胃作为对照组。密切观察裸鼠及移植瘤体的生长情况并做相应记录,通过免疫组织化学方法以及Western blot方法分别检测血管内皮生长因子( VEGF)及胰岛素样生长因子-2( IGF-2)的表达情况。结果普萘洛尔组裸鼠的肿瘤体积在干预期内明显下降,而对照组瘤体体积增加。使用普萘洛尔后,移植血管瘤VEGF、IGF-2蛋白的表达明显减弱。结论普萘洛尔可以有效地抑制人血管瘤移植瘤生长速度,抑制VEGF和IGF-2的分泌,从而有效抑制肿瘤血管生成,加速肿瘤转化为消退期。     

糖皮质激素治疗血管瘤的实验研究

目的　探讨糖皮质激素治疗血管瘤的相关机制。方法　以裸鼠为载体,将婴幼儿增生期毛细血管瘤标本剪成小块转种于裸鼠皮下。转种后第45天随机分成两组:曲安缩松组的每个瘤体瘤内注射曲安缩松0 .05ml(4mg/ml),生理盐水组的每个瘤体瘤内注射生理盐水0. 05ml。于注射前当天、注射后第3天、1、2周观察移植血管瘤变化,检测糖皮质激素受体、血管内皮细胞生长因子、细胞增殖核抗原Ki -67的表达。结果　移植血管瘤瘤内注射曲安缩松后,大多数瘤体迅速在2周内消退,而生理盐水组瘤体继续生长,光镜及透射电子显微镜观察均显示血管瘤处于消退状态。注射曲安缩松后,移植血管瘤糖皮质激素受体、血管内皮细胞生长因子、Ki- 67表达明显减弱。瘤糖皮质激素受体阳性颗粒积分光密度在注射后第3天、注射后1、2周与注射前及同期生理盐水组比较差异有统计学意义(8044±585比495±48;P<0 .05,P<0. 01)。血管内皮细胞生长因子阳性颗粒积分光密度在注射后第3天、注射后1周、注射后2周与注射前及同期生理盐水组比较差异有统计学意义(8499±1336比407±76;P<0. 05,P<0 .01)。细胞增殖核抗原Ki- 67注射后2周与注射前及同期生理盐水组比较比较差异有统计学意义(8919±2810比399±46;P<0. 01)。糖皮质激素受体与血管内皮细胞生长因子及Ki     

纳米羟基磷灰石修复鼠下颌骨缺损

目的:比较纳米羟基磷灰石(nanoHA)和HA修复下颌骨缺损的成骨能力,探讨nanoHA材料的优越性.方法:选择SD大鼠75只,随机分1,2,3,4,8wk共5个时间段,每时间段15只,对大鼠下颌骨下缘作一4.0mm×2.5mm的矩形骨缺损区,分别用大小为1.5mm×2.5mm×4.0mm的nanoHA材料、HA材料修复缺损区,另设一组空白对照组.分期取出缺损区骨组织,进行肉眼观察、光镜和免疫组化(TGFβ1)检测,最后对免疫组化检测结果量化并进行统计学分析.结果:大体观察见nanoHA修复组缺损区骨痂出现早而厚.光镜见nanoHA组骨细胞增生活跃,1wk有新生骨形成,炎症反应轻;HA组骨修复细胞较活跃,炎症反应较明显,且术后3wk才逐渐消退.免疫组化结果显示:在原始骨痂中的成骨细胞、骨端骨细胞、新生成的软骨基质,以及肉芽组织中的单核巨噬细胞、多核巨噬细胞和间质细胞中均可见TGFβ1的表达.nanoHA组TGFβ1的表达值在各时间段均大于HA组,两者均大于空白对照组.结论:nanoHA是修复骨缺损较理想的生物材料,nanoHA在生物相容性、促进骨修复再生等方面均优于普通HA.     

不同直径自体神经移植效果的比较研究

目的　建立不同直径鼠自体神经移植模型,探讨在自体神经移植中神经直径对移植效果的影响。方法　将4 0只SD大鼠随机分成A、B、C、D 4组,均造成右侧坐骨神经缺损模型,分别用自体坐骨神经、桡神经、正中神经、尺神经进行修复。术后4周、6周,各组分别取5只动物观察足部溃疡情况,记录运动神经传导速度,取神经组织镜下观察神经再生情况。结果　术后6周神经再生较术后4周好(P <0 .0 1) ,而A、B、C、D各组间无显著性差异(P >0 .0 5 )。术后的时间与移植神经的直径之间无交互作用(P >0 .0 5 )。结论　粗神经移植在神经冲动的电传导上占优势,而细神经移植段能够优先获得良好的血供,并不能简单地认为越粗越好或越细越好,临床上应根据具体病情来选择供体神经的粗细。     

不同剂量青霉素致SD大鼠癫痫的实验研究

目的:建立不同剂量青霉素诱导的急性癫痫大鼠模型并观察其行为和脑电图变化。方法:将24只SD大鼠随机分为对照组、青霉素模型Ⅰ组和青霉素模型Ⅱ组,每组8只。对照组注射生理盐水,模型Ⅰ、Ⅱ组分别于大鼠腹腔按500万U.kg-1、700万U.kg-1注射青霉素,观察并比较大鼠行为变化和脑电图记录。结果:两个剂量青霉素组均能成功诱发大鼠癫痫,癫痫大鼠的行为以强直和阵挛为主,同时其脑电图上具有明显的痫样放电。结论:500万U.kg-1、700万U.kg-1的青霉素诱导的急性癫痫大鼠模型是一种稳定而可靠的动物模型。     

pcDPG基因治疗甲状旁腺功能减退症的实验研究

目的构建甲状旁腺激素(PTH)基因的重组真核表达质粒,评价体外转染后PTH基因的表达与生物学活性,同时观察其对甲状旁腺功能减退动物的基因治疗作用。方法(1)从人胚甲状旁腺组织中克隆PTH基因,拓扑法构建其重组真核表达质粒pcDNA3.1-PTH-GFP(pcDPG),并采用酶切、聚合酶链反应(PCR)及DNA测序鉴定;(2)用脂质体转染pcDPG入293细胞,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达并计算转染率,同时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)验证PTH基因的表达;(3)纯化转染细胞上清中PTH蛋白,进行生物学活性鉴定;(4)建立甲状旁腺功能减退症的家兔模型,将pcDPG质粒以肌肉注射进行分组治疗,监测血钙、磷和PTH值及存活时间,通过形态学观察各器官的病理变化。结果(1)酶切与PCR结果与预期相同,测序结果与文献中序列同源性为99.3%;(2)细胞转染后24h即可见GFP表达,随时间延长而表达增强,48h转染率达38.9%和62.5%,同时RT-PCR见PTH基因表达;(3)纯化的PTH蛋白可对抗甲状旁腺切除小鼠的抽搐症状;(4)模型兔术后第2d血钙(1.71mmol/L±0.09mmol/L,1.73mmol/L±0.03mmol/L,1.75mmol/L±0.03mmol/L,1.65mmol/L±0.04mmol/L)明显低于术前(2.82mmol/L±0.21mmol/L,P<0.05),术后第2d PTH值(5.03pg/ml±0.05pg/ml,5.04pg/ml±0.05pg/ml,5.03pg/ml±0.07pg/ml,5.29pg/ml±0.03pg/ml)也明显低于术前(11.63pg/ml±1.60pg/ml),但是术后第2d血磷增高(P<0.05),pcDPG质粒大、中剂量组治疗后48h血钙、磷与PTH值均恢复至正常。结论脂质体介导的质粒pcDPG体外转染率较高,能表达有活性的PTH蛋白,同时对甲状旁腺功能减退家兔有较好的疗效,从而为甲状旁腺功能减退症基因治疗的进一步研究奠定了基础。     

实验性糖尿病诱导大鼠胸腺细胞凋亡的电镜观察

目的：探讨糖尿病诱导大鼠胸腺细胞凋亡的形态学变化,从而了解其引起胸腺萎缩的可能机制。方法：采用四氧嘧啶诱导复制的大鼠实验性糖尿病动物模型,在电镜下观察了糖尿病大鼠胸腺细胞凋亡的形态学变化。结果：在糖尿病大鼠胸腺皮质中发现了大量凋亡的胸腺细胞,主要表现为细胞皱缩变小,表面形成许多皱突,似发泡状,细胞质浓缩,电子密度增强,线粒体肿胀,嵴减少与紊乱,空泡化细胞核染色质固缩边聚,核变成花瓣状,黑环状与黑洞状,核与细胞发生裂解形成凋亡小体,被巨噬细胞和上皮细胞吞噬清除。此外,在凋亡细胞与小体的周围还聚着许多浆细胞,结论：实验性糖尿病可诱导大鼠脑腺细胞发生大量凋亡,这可能是导致胸腺细胞大量减少及胸腺萎缩的主要机制之一。     

逆转录病毒介导的人卵巢癌 p53基因治疗体外及小鼠体内实验研究

目的 :评价人卵巢癌的 p5 3基因治疗效果。 方法 :用携带人野生型 p5 3的逆转录病毒转导 p5 3蛋白表达缺如的人卵巢癌细胞系SK OV 3,通过体外及小鼠体内实验研究转基因的表达及对肿瘤的抑制作用。结果 :逆转录病毒介导的 p5 3基因能够在体外及小鼠体内人卵巢癌细胞SK OV 3中表达 ,并对人卵巢癌生长有抑制作用。体外抑制率为 5 7%～ 88% ;对体内肿瘤抑制率为 40 %。结论 :逆转录病毒介导的外源野生型p5 3能够抑制人卵巢癌生长 ,增加病毒滴度将进一步提高体内治疗效果     

联合自杀基因及内皮抑素基因双靶点治疗膀胱癌的实验研究

目的 探讨基因重组腺相关病毒自杀基因及内皮抑素(KS)联合基因治疗膀胱癌的效果.方法 (1)通过重组腺相关病毒(rAAV)-增强绿色荧光蛋白(EGFP)转染膀胱肿瘤T24细胞,来确定rAAV对该细胞的转染情况及转染效率;(2)通过rAAV-胸苷激酶(TK)-核糖体插入位点(IRES)-ES(简称rAAV-TIE)体外转染T24膀胱肿瘤细胞及人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞),应用MTT法、流式细胞仪等方法 来检测其对T24细胞及HUVEC细胞凋亡的诱导作用;(3)构建裸鼠膀胱癌模型,分析rAAV-TIE联合基因治疗膀胱癌的体内效果.结果 (1)rAAV-EGFP转染T24细胞后可以表达携带的外源基因EGFP;(2)rAAV-TK、rAAV-TIE转染T24细胞72 h后,流式细胞仪检测结果 显示,rAAV-TK、rAAV-TIE两组凋亡率分别是34.12%和36.91%,明显高于空病毒转染组[rAAV-多克隆位点(MCS)组](3.08%)和空白对照组(0.84%);(3)瘤内注射rAAV-KS、rAAV-TK、rAAV-TIE大约9 d后,肿瘤生长受到显著抑制,治疗结束后:各组肿瘤的体积分别是:rAAV-Es组(0.75±0.08)cm3、rAAV-TK组(0.71±0.11)cm3、rAAV-r11E组(0.52±0.09)cm3、rAAV-MCS组(1.27±0.13)cm3和空白对照组(1.24±0.17)cm3,除rAAV-ES组与rAAV-TK组间比较差异无统计学意义外,其余组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05).结论 体外和体内实验表明rAAV-TIE可有效抑制膀胱癌的血管生成和肿瘤的生长,能够双靶点基因治疗膀胱肿瘤.     

pcDNA3.1甲状旁腺激素基因治疗甲状旁腺功能低下症的实验观察

目的　研究pcDNA3 1·PTH治疗甲状旁腺功能低下的治疗效果及最佳剂量。方法　手术切除家兔甲状旁腺 ,建立甲状旁腺功能低下症模型。将已构建的人甲状旁腺激素基因pcDNA3 1·PTH以 50 μg/kg、1 50 μg/kg、2 50 μg/kg剂量注射模型家兔的骨骼肌内 ,测定注射后不同时间的血钙及血PTH。结果　注射pcDNA3 1·PTH后 2 4h模型家兔的血钙及PTH升高 ,肌注 1 50 μg/kg组的模型兔 ,血钙和PTH值在 7d时达正常水平 ,各为 :2 83± 0 0 2 (mmol/L)、1 1 30 3± 0 0 2 5(pg/ml)。肌注 2 50 μg/kg组的模型兔 ,血钙和PTH值在 7d时达正常水平 ,各为 :2 81± 0 0 7(mmol/L)、1 2 0 0 1± 0 0 0 8(pg/ml)。并均持续 2个月时间。结论　人甲状旁腺激素基因治疗甲状旁腺功能低下是有效的 ,且以 1 50 μg /kg和 2 50 μg/kg为最佳剂量     

豚鼠耳蜗内基因治疗的安全性研究

目的　观察携带人神经营养素 3基因的腺病毒 (Ad NT3)导入豚鼠耳蜗内的安全性和NT3基因的表达以及导入手术对听觉功能的影响。方法　将 2 0只豚鼠随机分为 2组 ,经耳蜗底周鼓阶钻孔向外淋巴腔内导入目的基因 ,其中 10只导入Ad NT3,10只导入人工外淋巴液。导入前、导入后即刻及导入后 7d分别检测听觉脑干诱发电位。导入后 7d应用免疫组化方法观察Ad NT3在蜗内的转染。结果　Ad NT3导入前、导入后即刻、导入后 7dABR III波反应阈分别为 35dBSPL± 3 7dBSPL、4 0dBSPL± 2 5dBSPL和 35dBSPL± 3 0dBSPL ,10 0dBSPL短声下的ABR III波潜伏期分别为2 812ms± 0 0 87ms、2 793ms± 0 0 93ms和 2 82 2ms± 0 10 2ms。导入手术操作以及腺病毒导入对于耳蜗结构和听力无明显影响。应用免疫组化方法可以检测到耳蜗内NT3反应产物。结论　应用微量注射方法经鼓阶造孔将目的基因导入外淋巴腔对耳蜗形态及听觉功能无明显影响 ,耳蜗内局部实施基因治疗是安全可行的。     

siRNA沉默NPY抑制心肌梗死后大鼠心肌细胞肥大的实验研究

目的观察应用小RNA干扰（siRNA）技术沉默NPY对心肌梗死后大鼠心肌细胞肥大的治疗效果。方法构建沉默NPYmRNA表达的siRNA质粒;结扎冠状动脉左前降支,建立心肌梗死模型。分梗死组（MI组）、空载质粒组和NPYsiRNA治疗组;术后21d,测定大鼠左室重量指数,心肌细胞横断面积,RT-PCR检测NPYmRNA表达,Western-Blot检测NPY蛋白表达水平,并行病理切片HE染色。结果术后21d,NPYsiRNA治疗组大鼠心肌左室重量指数,心肌细胞表面积,NPYmRNA表达水平以及NPY蛋白表达水平较梗死组（MI组）、空载质粒组显著降低,且有统计学差异（P〈0.05）,与病理切片HE染色一致。结论 靶向NPY的siRNA技术通过对NPY的有效沉默可明显减轻心肌梗死后大鼠心肌细胞肥大发挥良好的治疗效果。