胚鼠神经干细胞培养与鉴定

目的　体外获取高浓度神经干细胞 (NSC)。方法　加入bFGF培养E12天大鼠胚脑的全部细胞 ,用荧光免疫组化法显示。结果　加bFGF的神经干细胞 (Neuralstemcell,NSC)大量分裂 ,形成大量的细胞分裂球 ,传到 4代时 ,90 %以上的细胞表达nestin。对照组分裂的细胞少 ,维持到第二代细胞逐渐死亡。结论　bFGF对胚胎E12天大鼠脑细胞的NSC有明显的促分裂作用 ,应用此种方法可获得高浓度的NSC     

成年大鼠最后区神经干细胞的检测及鉴定

目的 观察性别决定基因高迁移率组蛋白( SOX2)和巢蛋白(Nestin)阳性表达细胞及溴脱氧尿密啶核苷（BrdU）阳性标记细胞在最后区的分布。方法 成年雄性SD大鼠12只,6~8周龄,随机分为两组,每组6只。一组大鼠按照50mg/kg（0.3ml）腹腔注射BrdU,连续3d给药,每天2次;另一组注射等量生理盐水。4d后灌注大鼠,行免疫组织化学及免疫荧光检测。 结果 免疫组织化学染色显示,SOX2阳性表达细胞在最后区的腹侧部呈明显的V字形分布,背侧部呈带状分布,中央部散在分布。Nestin阳性表达细胞在最后区的腹侧部呈明显的V字形强阳性分布,中央部呈弱阳性表达。在最后区可见少量阳性BrdU标记细胞。SOX2/BrdU荧光双标染色显示,SOX2阳性表达细胞较密集分布,可见少量SOX2/BrdU双阳性细胞。SOX2/Nestin荧光双标染色显示,SOX2阳性表达细胞较密集分布,可见少量SOX2/Nestin双阳性表达细胞。结论 最后区SOX2及Nestin阳性细胞密集表达,呈明显的区域分布;在最后区内存在少量BrdU阳性标记细胞及SOX2/BrdU和SOX2/Nestin双阳性细胞;最后区可能存在神经干细胞/祖细胞。     

穹窿海马伞切割后大鼠海马伞内神经干细胞的观察研究

目的观察穹窿海马伞切割侧和非切割侧大鼠海马伞内神经干细胞的表达情况。方法切割SD大鼠右侧穹窿海马伞,于术后2d经腹腔注射BrdU,连续5d,术后7d取脑冰冻切片,进行BrdU/Nestin免疫荧光双标检测。结果穹窿海马伞切割侧海马伞内的BrdU阳性细胞数和Nestin阳性细胞数均明显多于非切割侧,且出现较多的BrdU/Nestin双标的阳性细胞,而非切割侧未见BrdU/Nestin双标的阳性细胞。结论穹窿海马伞切割后,切割侧海马伞内出现较多增殖的神经干细胞,我们推测海马伞的损伤,导致海马伞内局部微环境发生变化,产生某些信号物质,刺激脑内其他部位的神经干细胞增殖并迁移到海马伞内。     

局灶性脑缺血大鼠皮质和尾壳核神经干细胞增殖分化与nNOS的表达

本研究旨在探讨局灶性脑缺血再灌注大鼠皮质和尾壳核神经干细胞的增殖分化与nNOS表达的关系。大脑中动脉线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,5溴脱氧尿核苷(BrdU)标记分裂增殖细胞,免疫组化单标和双标记技术检测各组大鼠缺血侧皮质和尾壳核BrdU阳性细胞和nNOS的表达。模型组大鼠皮质和尾壳核BrdU阳性细胞再灌注后3d开始增多,14d达高峰,nNOS阳性细胞再灌注后7d表达增强,28d达高峰,BrdU/nNOS双标细胞在14d达高峰,占皮质BrdU阳性细胞数的42.95%,尾壳核内占42.56%。新生细胞分化组BrdU阳性细胞和BrdU/nNOS双标细胞显著多于模型组(P<0.05),皮质双标细胞占BrdU阳性细胞数的54.08%,尾壳核内占47.84%。提示局灶性脑缺血可增强大鼠皮质和尾壳核的增殖能力,部分增殖细胞分化为nNOS阳性神经元,参与神经网络的重建。     

骨形态发生蛋白-4在体内外诱导成年大鼠脑神经干细胞向胆碱能细胞分化的效应

目的了解骨形态发生蛋白4(BMP4)是否具有诱导成年大鼠脑神经干细胞(NSCs)向胆碱能细胞分化的效应。方法将从两月龄大鼠脑海马、纹状体等区域分离的细胞培养于含EGF、bFGF的DMEM/F12培养液中,在光镜下观察细胞的形态特征,并行Nestin细胞化学染色,24h后换成含有BMP4的培养液,培养8d时,行ChAT间接免疫荧光染色,在光镜下观察细胞形态的变化,并行FITC标记的流式细胞术检测NSCs分化。以脑立体定位术给成年大鼠右侧海马齿状回内注射BMP4或生理盐水0.5μL;14d后取大鼠脑组织切片,行ChAT免疫组织化学染色;以图像分析仪测量ChAT阳性细胞总面积。结果分离出的大鼠脑海马、纹状体等区的细胞约48%为Nestin阳性的NSCs。培养8d时,光镜下见加BMP4组约34%的细胞呈神经元形态特征;间接免疫荧光染色见呈较强绿色荧光的ChAT阳性细胞较多;FITC标记流式细胞术检测到16%的细胞呈ChAT阳性。而未加BMP4组呈ChAT阳性的细胞约7%,明显少于加BMP4组,且荧光较弱。给大鼠海马齿状回区脑组织中注射BMP4后14d时,可见该区细胞出现较高的胆碱能表达。结论 BMP4可在体外培养及体内注射条件下诱导大鼠脑神经干细胞向胆碱能细胞分化。     

成年肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因鼠脊髓细胞增殖的研究

目的观察成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型鼠脊髓内源性细胞的增殖和存活情况。方法对ALS转基因鼠进行BrdU注射,分别于不同时间点取材,冷冻切片,应用免疫荧光染色技术检测脊髓内细胞的增殖、分布和存活情况。结果成年ALS鼠脊髓的中央管、灰质、白质均可检测到BrdU阳性细胞,经常可检测到形状相似、成对出现的细胞。在灰质内,BrdU阳性细胞主要分布于脊髓前角。在白质内,BrdU阳性细胞散在分布。前角ALS鼠脊髓内BrdU阳性细胞数量较野生型鼠多。BrdU末次注射后1d、14d均可检测到BrdU阳性细胞,但细胞数量逐渐减少,28d ALS鼠脊髓内仍可检测到少量BrdU阳性细胞,主要分布于中央管部位。增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞的分布和变化规律与BrdU阳性细胞一致。在95d龄ALS鼠(BrdU末次注射1d后),脊髓中Nestin阳性细胞较野生型鼠多,多数Nestin阳性细胞分布于脊髓前角,某些细胞呈BrdU/Nestin双标阳性。在BrdU注射后14d、28d脊髓中,未检测到BrdU/Nestin双标阳性细胞。结论神经退行性病变可激活ALS转基因鼠脊髓的细胞增殖,且细胞存活可达28d。     

成年肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因鼠脊髓增殖细胞的分化

目的 探讨成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型鼠脊髓内增殖细胞的类型及分化情况. 方法 对ALS转基因鼠发病期进行BrdU标记,分别于不同时间点取材,冷冻切片,应用免疫荧光双标及三标染色技术检测ALS转基因鼠病变进展过程中脊髓内增殖细胞的分化情况. 结果 成年ALS转基因鼠发病期脊髓的中央管、灰质、白质均未检测到BrdU/DCX双标记阳性细胞和BrdU/NeuN双标记阳性细胞.灰质、白质和中央管周围检测到大量NG2阳性细胞,阳性细胞数量随病变进展逐渐减少,NG2阳性细胞多呈BrdU阳性表达;可检测到少量BrdU/A2B5双标记阳性细胞;ALS转基因鼠发病期脊髓BrdU/GFAP双标记阳性细胞较多,部分双阳性细胞呈Nestin阳性,而野生型鼠脊髓内未检测到BrdU/GFAP双标记阳性细胞.结论 神经退行性病变激活ALS转基因鼠脊髓内源性增殖细胞向神经胶质细胞方向分化,未检测到向神经元方向分化,内源性增殖细胞尚不能有效地促进退行性病变的修复.     

碱性成纤维细胞生长因子对全脑缺血再灌注大鼠脑皮质内源性神经干细胞的影响

探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对全脑缺血再灌注大鼠脑皮质内源性神经干细胞增殖、迁移和分化的影响。本研究以"四血管法"制作全脑缺血再灌注模型,采用免疫组化方法检测BrdU和Nestin在不同组别各时间点的表达,用RT-PCR技术半定量检测大鼠脑皮质NSE mRNA的表达。结果显示假手术组大鼠脑皮质基本未见到BrdU和Nestin阳性细胞表达,NSE mRNA表达没有变化;模型组大鼠脑皮质的BrdU和Nestin阳性细胞在全脑缺血再灌注3d后开始增加,7d达到高峰,NSE mRNA表达无明显增加;bFGF治疗组BrdU、Nestin阳性细胞较模型组在缺血各时间点均明显增加(P0.05),11d达到高峰,NSE mRNA表达与假手术组和模型组相比第15d表达有明显增加(P0.05)。结果表明全脑缺血再灌注能够引起内源性神经干细胞的原位增殖,bFGF可促进全脑缺血再灌注大鼠内源性神经干细胞原位增殖,并延长增殖期,而且有明显促进内源性神经干细胞向神经元分化的作用。     

N-甲基-D-天(门)冬氨酸致兴奋性毒性脑损伤大鼠海马内BMP4、BrdU与GFAP的表达

目的:观察N-甲基-D-天(门)冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)致兴奋性毒性脑损伤大鼠海马内BMP4mRNA、BrdU与GFAP的表达。方法:原位杂交检测BMP4的表达, 流式细胞仪检测NMDA致兴奋性毒性脑损伤后齿回内BrdU与GFAP阳性细胞的比例, 免疫荧光双标法检测BrdU标记细胞与GFAP蛋白的共存。结果:BMP4mRNA阳性细胞数在NMDA致兴奋性毒性损伤后1d与3d显著升高, 7d与15d组海马内BMP4mRNA阳性细胞数降低。流式细胞仪检测发现, NMDA致兴奋性毒性脑损伤使齿回内BrdU阳性细胞的比例降低, 而GFAP阳性细胞的比例显著升高, 并在7d与15d组表达最高。免疫荧光双标法检测BrdU标记细胞与GFAP蛋白的共存, 证实70％的BrdU标记细胞为GFAP免疫反应阳性细胞, 表明NMDA致兴奋性毒性损伤有明显的促胶质发生作用。结论:以上结果提示NMDA致兴奋性毒性损伤有明显的促胶质发生作用, 而该作用可能与海马内BMP4的过度表达相关。     

小鼠垂体巢蛋白阳性细胞在体外具有集落生长能力

目的 研究小鼠垂体前叶中巢蛋白(Nestin)阳性细胞在体外培养环境中的自我增殖能力. 方法建立小鼠垂体Nestin阳性细胞克隆生长培养条件,观察次代细胞在其中的生长情况.应用野生型细胞和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)细胞混合培养,以及BrdU渗核实验鉴定次代Nestin阳性细胞培养过程中新生细胞群的来源.结果次代Nestin阳性细胞在克隆生长培养基中能够自我增殖.野生型细胞和EGFP细胞混合培养实验表明,新生细胞群由纯野生型细胞或纯EGFP细胞构成.BrdU渗核实验显示,24h内新生细胞群中有13%的细胞由分裂产生(n=20). 结论 部分小鼠垂体前叶Nestin阳性细胞在体外培养环境中具有克隆生长能力.     

大鼠大脑皮质神经前体细胞的分离培养及其增殖分化鉴定

目的:体外分离和培养大鼠大脑皮质神经前体细胞并进行增殖和分化鉴定。方法:分离2周龄大鼠皮质神经前体细胞,在含EGF、bFGF和GDNF的NSC培养基中进行体外培养,使用免疫细胞荧光染色技术对细胞的分化特性进行鉴定。结果:EGF、bFGF和GDNF可促进神经前体细胞的增殖及神经球的克隆形成,并获得了Nestin阳性的神经前体细胞,其可分化为分别表达β-Ⅲtubulin、GFAP和GalC的阳性细胞。结论:体外分离和培养的大脑皮质神经前体细胞,在含EGF、bFGF和GDNF的NSC培养基中培养,具有增殖分化的能力,有望应用于神经系统疾病的细胞移植治疗。     

碱性成纤维细胞生长因子对胚鼠海马神经前体细胞的增殖和分化作用

为观察碱性成纤维细胞生长因子对体外培养的神经前体细胞的增殖和分化作用 ,本实验取胚胎 18d大鼠海马神经细胞 ,加入 2 5 ng/ m l碱性成纤维细胞生长因子置无血清培养基中进行培养。于培养第 4d和第 8d,用四唑盐比色法测定细胞活性 ,并用免疫组化方法定性、定量分析神经前体细胞的分裂和分化为神经元及神经胶质细胞的状态。结果显示 ,培养第 4d和第 8d,实验组的 OD值均增高 ,分别是对照组的 1.5倍和 1.8倍。免疫组化细胞分类计数显示 :培养第 4d,实验组神经前体细胞、神经元和少突胶质细胞数均明显增加 ,约是对照组的 2倍 ;但星形胶质细胞数无明显的变化。培养第 8d,实验组四类细胞均增加 ,约是对照组的 1.7倍。本实验提示 ,碱性成纤维细胞生长因子既能促进 E18的神经前体细胞的存活和分裂又能促进其向神经元和神经胶质细胞分化。并提示如拟在体外获得较大量和较高纯度的神经前体细胞 ,E18不是最理想的胚龄 ,需考虑选取胎龄更小的脑组织和加进足量的碱性成纤维细胞生长因子并进行传代培养。     

A simplified method for generating oligodendrocyte progenitor cells from neural precursor cells isolated from the E16 rat spinal cord

Conditioned medium obtained from B104 neuroblastoma cells (B104CM) has been used widely for inducing oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) from neural precursor cells (NPCs). Our previous studies have demonstrated that E16 rat spinal cord-derived NPCs could be induced to differentiate into OPCs using a combination of B104CM and basic fibroblast growth factor (bFGF). Here we report the development of a more efficient and reliable approach to generate large quantities of highly purified OPCs from spinal cord-derived NPCs using a combination of platelet derived growth factor (PDGF) and bFGF. We demonstrated that, after the two factors application, over 90% cells displayed typical bipolar or tripolar morphology and expressed markers for OPCs including A2B5 (90.36 +/- 4.59%), NG2 (93.63 +/- 3.37%) and platelet derived growth factor alpha receptor (PDGFR; 90.35 +/- 1.95%). Our results indicated that the PDGF/bFGF combination is more efficient in generating OPCs than the B104CM/bFGF. And it is a more potent combination of factors in promoting proliferation of OPCs.     

人骨髓间充质干细胞的生物学特性及向神经前体细胞分化的实验研究

目的 观察体外培养的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的生物学特性,并探讨使其转分化为神经前体细胞(NPCs)的方法.方法以密度梯度离心和贴壁法相结合分离成人骨髓间充质干细胞,并观察细胞形态、生长、表面标记以及成骨和成软骨及成脂肪能力的情况.选用第3代细胞进行诱导,先经胚胎干细胞培养液扩增,再用加有5-氮胞苷和曲古菌素A的神经诱导液诱导,7d后,一部分样本进行Nestin、Sox2免疫荧光染色和RT-PCR检测;另一部分样本在含有B27的神经培养液中继续培养7d,然后进行NF-L的免疫荧光检测.结果分离培养的hMSCs纯度较高,CD29、CD44的阳性率均在90%以上;具有明显的成骨、成软骨和成脂肪能力;经5-氮杂胞苷和曲古菌素A作用后能向神经前体细胞分化,免疫荧光染色及RT-PCR结果显示,诱导后的细胞能特异性表达神经前体细胞标志物Nestin和Sox2;在神经培养液中继续培养后检测神经细胞标记物NF-L,可见较多阳性细胞.结论 hMSCs可在体外进行分离培养扩增,经药物修饰后具有向神经前体细胞分化的潜能.     

成年大鼠眼睫状体缘色素上皮组织的神经前体细胞的培养和鉴定

目的　探讨成年大鼠眼睫状体缘色素上皮产生神经前体细胞的潜力及其生物学特征。方法　取成年SD大鼠睫状体缘处的色素上皮组织块 ,置于含bFGF和B2 7的DMEM/F12 无血清培养液中进行神经前体细胞培养 ,免疫组化反应染色鉴定细胞的表型。结果　培养 5～ 8d ,组织块长出由众多无色素和色素细胞构成的细胞集落 ,集落的大多数细胞处于增殖状态(BrdU反应阳性 ) ,并表达神经前体细胞的标志物 (nestin)。撤掉bFGF和B2 7,加入胎牛血清培养 3～ 5d ,集落的细胞发生分化 ,分别表达神经元和星形胶质细胞的标志物 (NSE、GFAP) ,但不表达少突胶质细胞的标志物 (O4 )。结论　由成年大鼠睫状体缘色素上皮长出的细胞集落不仅含有增殖能力和多分化潜能的神经前体细胞 ,而且尚含有色素细胞 ,该部位可能是视网膜神经感觉层和色素上皮共同保守的细胞生发带     

小鼠胚胎干细胞来源的神经干细胞的稳定传代体系探索

目的探讨体外诱导、获取均一的神经干细胞群(NSCs)的有效方法,并建立神经干细胞体外稳定传代扩增体系。方法首先采用无血清的诱导培养基贴壁诱导mESCs形成神经上皮祖细胞(NPCs)。然后将经添加表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子-2(FGF2)的无血清培养基短暂悬浮培养后的NPCs再贴壁培养,诱导形成NSCs。通过细胞系46C监测NPCs的形成,同时对分化细胞进行定量PCR和免疫荧光染色,在不同水平检测细胞分化效果。结果 mESCs神经诱导5 d出现大量Sox1+的NPCs;NPCs悬浮培养后,进一步诱导可得到形态均一的NSCs。第2代和第6代NSCs的神经干细胞标志定量PCR检测结果为:Pax6、Nestin、Mash1、BLBP高表达。第8代NSCs免疫荧光染色显示90%以上的细胞均为Nestin、RC2和Pax6阳性。结论成功诱导mESC生成神经干细胞群,并且可以在体外连续稳定的传代。     

人胎脑神经干细胞的体外培养

目的从人胎脑纹状体中分离培养并鉴定神经干细胞。方法采用包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养和单细胞克隆技术,从36周自愿水囊引产人胎脑纹状体中分离出神经干细胞,并观察神经干细胞体外培养、传代、分化潜能。结果从36周人胎脑纹状体中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续克隆能力,可传代培养,呈Nestin免疫反应阳性细胞;在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论神经干细胞的存活和分裂有赖于EGF和bFGF的共同作用;36周人胎脑纹状体仍能培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞。     

无血清悬浮分离培养法分离、培养、鉴定脊髓源性神经干细胞

背景：目前临床上尚未发现完全治愈脊髓损伤,使其达到结构及功能恢复的治疗方法。已有的神经营养因子治疗方法促进神经细胞再生的效果有限,而干细胞移植治疗可能是现阶段修复脊髓损伤的有效方法之一。 目的：无血清悬浮分离培养法培养胎鼠脊髓源性神经干细胞,采用形态学、免疫荧光技术和多向分化能力进行神经干细胞鉴定。 方法：应用悬浮分离培养法,培养纯化孕13.5 d C57BL/6胎鼠的脊髓源性神经干细胞。倒置显微镜观察细胞形态学变化;CCK-8法检测细胞的增殖能力。免疫荧光技术检测Nestin和Sox2表达;使用自然分化法验证第4代脊髓源性神经干细胞多向分化特性,明确其分化能力。 结果与结论：采用无血清悬浮分离培养法可以顺利获取脊髓源性神经干细胞。培养的脊髓源性神经干细胞增殖活性良好,高表达Nestin和Sox2,且两种标记物与DAPI核染高度均匀吻合,说明细胞纯度高。进一步诱导分化显示,细胞可以向GFAP和Tuj1阳性细胞分化,证明脊髓源性神经干细胞分化潜能较好。该实验可建立一套体外培养脊髓源性神经干细胞分离、培养、纯化及鉴定体系,为后续神经干细胞的应用研究奠定基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程