含CYP2E1基因的重组腺病毒载体转染人骨髓间充质干细胞联合达卡巴嗪的抗肿瘤效应

目的 构建含人细胞色素P-450 CYP2E1(CYP2E1)基因的缺陷型重组腺病毒载体,检测其协同化疗药物的抗肿瘤效应,为基因介导酶前药治疗提供新的思路.方法 克隆人肝CYP2E1全长cDNA,制备高滴度的重组腺病毒颗粒(1.2×1012 pfu/ml).分离、培养、传代纯化及鉴定人骨髓间充质干细胞(BMSC).用Transwell小室检测BMSC向肿瘤细胞的趋化迁移.将重组腺病毒分别转染BMSC和人黑色素瘤细胞A375细胞.荧光显微镜和RT-PCR、Western印迹法分别检测转基因细胞中外源增强绿色荧光蛋白(EGFP)、CYP2E1的表达.倒置显微镜、四甲基偶氮唑盐(MTT)和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)双染色法检测CYP2E1协同酶前药达卡巴嗪(DTIC)的抗肿瘤效应(实验分A375-CYP2E1组、BMSC-CYP2E1组和BMSC-CYP2E1+A375组,并以各自空载体组作为对照;细胞接种后分别加入不同浓度DTIC).结果 成功构建重组腺病毒载体pAd5CMV-NpA-CYP2E1和pAd5CMV-NpA-EGFP.成功分离BMSC,并证明BMSC可通过聚碳酸酯膜分别向下室内的K562和A375细胞迁移.荧光显微镜检测到转基因靶细胞EGFP表达,RT-PCR和Western印迹法均检测到目的基因在转基因细胞中高表达.倒置显微镜下见加入DTIC后BMSCCYP2E1+A375组的死亡细胞明显多于对照组.MTT法示DTIC呈浓度依赖性抑制转CYP2E1基因的细胞生长,其中BMSC-CYP2E1+A375组药物半数抑制量(IC50)值为(0.17±0.13)mmol/L,其对照组为(0.65±0.20)mmol/L,二者差异有统计学意义(P＜0.01),可选0.05 mmol/L DTIC浓度作人BMSC的相对安全浓度.Annexin V/PI法示0.05 mmol/L DTIC处理细胞48 h后BMSC-CYP2E1+A375组细胞凋亡率明显高于其对照组(26.8±2.0比8.7±1.3,P＜0.01).结论 BMSC体外具有向肿瘤细胞趋化迁移的特性.重组腺病毒载体介导的CYP2E1转染BMSC具有协同化疗前药的抗肿瘤效应.     

AdMaxTM重组腺病毒载体转染人脂肪间充质干细胞

目的 探讨AdMaxTM重组腺病毒载体转染人脂肪间充质干细胞(ADSCs)的最佳条件.方法 胶原酶消化法获得人ADSCs并行原代培养,流式细胞仪鉴定其表面标记;AdMaxTM重组腺病毒载体以梯度感染复数值(MOI)(10、50、100、200、400、800)转染人ADSCs,分别于转染后24、48、72、96 h,荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)表达,KS400型图像分析仪测定转染效率.结果 当MOI为400时可获得较佳的转染效率,GFP阳性细胞数量达到峰值,转染率达到91.25%.空载体转染人ADSCs的效率与转染时间无显著相关性.结论 AdMaxTM重组腺病毒是转染人ADSCs的较理想载体.通过选择恰当的MOI值能提高细胞对重组腺病毒的摄入,从而提高转染效率.     

AdMax~(TM)重组腺病毒载体转染人脂肪间充质干细胞

目的 探讨AdMaxTM重组腺病毒载体转染人脂肪间充质干细胞(ADSCs)的最佳条件.方法 胶原酶消化法获得人ADSCs并行原代培养,流式细胞仪鉴定其表面标记;AdMaxTM重组腺病毒载体以梯度感染复数值(MOI)(10、50、100、200、400、800)转染人ADSCs,分别于转染后24、48、72、96 h,荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)表达,KS400型图像分析仪测定转染效率.结果 当MOI为400时可获得较佳的转染效率,GFP阳性细胞数量达到峰值,转染率达到91.25%.空载体转染人ADSCs的效率与转染时间无显著相关性.结论 AdMaxTM重组腺病毒是转染人ADSCs的较理想载体.通过选择恰当的MOI值能提高细胞对重组腺病毒的摄入,从而提高转染效率.     

hBcl-2和hVEGF165双基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 将hBcl-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测目的 基因的表达及表达产物的生物学效应.方法 贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞;重组腺病毒转染BMSCs,用PCR法验证目的 基因mRNA在间充质干细胞中的表达;用ELISA及Western Blot检测双...     

人VEGF基因腺病毒表达载体修饰大鼠骨髓间充质干细胞

目的 探讨含人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因腺病毒表达载体Ad-VEGF转染大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的可行性.方法 采用贴壁培养筛选法富集大鼠BM-MSCs.将HEK293细胞中扩增并经效价分析后的Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs,通过对细胞转染效率、生长和活力的观察分析,以确定理想的感染复数(MOI)值.结果 本实验经HEK293细胞扩增制备的Ad-VEGF的病毒效价达8×108 pfu/ml;当MOI值为50时,Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs效率可达最高值53％;而MOI值高于50时,Ad-VEGF转染对BM-MSCs活性抑制明显.结论 成功实现Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs,其最适MOI值为50.     

重组hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞及其表达

目的 探讨携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(adeno-hTGF-β1)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其表达的可行性.方法 重组adeno-hTGF-β1经293细胞包装、扩增后,转染猪BMSCs.转染后72 h,RT-PCR检测BMSCs的hTGF-β1mRNA表达;免疫细胞化学染色定性和酶联免疫吸附定量测定(ELISA法)hTGF-β1蛋白表达;MTT法测定水貂肺上皮细胞(MV-1-Lu)的生长抑制率,以验证转染后所表达的hTGF-β1蛋白的生物学活性.结果 转染后72 h,BMSCs能有效表达hTGF-β1mRNA,胞浆内有大量棕黄色的hTGF-β1蛋白表达,其蛋白表达量是转染adeno-lacZ的2.65倍(P＜0.05);MTT法检测结果显示,转染adeno-hTGF-β1的BMSCs所分泌的hTGF-β1蛋白对MV-1-Lu细胞的生长有显著抑制作用.结论 重组adeno-hTGF-β1能够被导入BMSCs,并表达有生物学活性的hTGF-β1蛋白.为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础.     

重组hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞及其表达

目的探讨携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(adeno-hTGF-β1)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其表达的可行性。方法重组adeno-hTGF-β1经293细胞包装、扩增后,转染猪BMSCs。转染后72 h,RT-PCR检测BMSCs的hTGF-β1mRNA表达;免疫细胞化学染色定性和酶联免疫吸附定量测定(ELISA法)hTGF-β1蛋白表达;MTT法测定水貂肺上皮细胞(MV-1-Lu)的生长抑制率,以验证转染后所表达的hTGF-β1蛋白的生物学活性。结果转染后72 h,BMSCs能有效表达hTGF-β1mRNA,胞浆内有大量棕黄色的hTGF-β1蛋白表达,其蛋白表达量是转染adeno-lacZ的2.65倍(P<0.05);MTT法检测结果显示,转染adeno-hTGF-β1的BMSCs所分泌的hTGF-β1蛋白对MV-1-Lu细胞的生长有显著抑制作用。结论重组adeno-hTGF-β1能够被导入BMSCs,并表达有生物学活性的hTGF-β1蛋白。为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础。     

绿色荧光蛋白基因腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

[摘要] 目的：研究腺病毒载体绿色荧光蛋白基因（Ad-GFP）在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCc)转染和表达的量效关系及对细胞生物学特性的影响,探讨用该载体构建基因修饰BMSCc的可行性。方法：在体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞免疫表型,293细胞包装制备病毒,以不同滴度的Ad-GFP(1×103-1×1010 PFU/ml)转染BMSCc,细胞计数法分析转染率,倒置显微镜观察细胞形态学改变,CCK8法检测细胞增殖活性,用血清撤离加入β- 巯基乙醇诱导感染Ad-GFP的BMSCc向神经样细胞定向分化。结果：3-6代BMSCc表面标志CD34、CD45阴性而CD29、CD44阳性,当病毒滴度为1×107PFU/ml时感染率为55%,为1×109及1×1010PFU/ml感染率均为85%,但1×1010PFU/ml时出现细胞病理现象,7d荧光表达最强,28d 仍可见荧光表达,感染Ad-GFP的BMSCc经β- 巯基乙醇诱导可分化为神经元样细胞,神经元特异性烯醇化酶（NSE）阳性。结论：合适滴度的Ad-GFP可以高效感染BMSCc,对细胞的生物学特性影响较小不影响诱导分化功能,BMSCc可以作为Ad-GFP载体系统进行基因治疗的种子细胞。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

 【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体,利用贴壁法分离培养MSCs后,用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率,用免疫组化、Western-Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率,转染效率与病毒感染复制数(multiplicyties of infection,MOI)具有量效关系。MOI为150倍时,转染效率>95%,转染VEGF后,MSCs可有效表达VEGF,9d时达到表达高峰(1125pg/mL),13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs,MSCs是一种理想的基因载体细胞,其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子（VEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体，利用贴壁法分离培养MSCs后，用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率，用免疫组化、Western—Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率，转染效率与病毒感染复制数（multipcyties of infection，MOI）具有量效关系。MOI为150倍时，转染效率〉95％，转染VEGF后，MSCs可有效表达VEGF，9d时达到表达高峰（1125pg／mL），13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs，MSCs是一种理想的基因载体细胞，其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

重组hCDMP1腺病毒转染骨髓间充质干细胞对其向软骨分化的影响

目的探讨人软骨源性形态发生蛋白1(CDMP1)基因转染对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及分化的影响。方法采用腺病毒转染方法将重组人CDMP1(hCDMP1)基因转入体外培养的兔BMSCs,用免疫印迹法(Western blot)检测hCDMP1蛋白质的表达,并通过检测细胞增殖能力(MTT法)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)以及蛋白多糖的表达,分析转染hCDMP1对BMsCs增殖、分化的影响。结果 hCDMP1蛋白在基因转染细胞内得到正确表达;hCDMP1基因转染组和对照组相比,ColⅡ、蛋白多糖表达水平显著增高(P<0.05),而细胞增殖能力无明显变化(P>0.05)。结论外源基因转染可以使BMSCs表达有生物活性的hC-DMP1,高表达的hCDMP1可以促进BMSCs向软骨表型分化,但对细胞增殖无明显影响。     

不同基因载体转导人骨髓间充质干细胞比较

目的比较腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体和质粒载体对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的转导效率。方法体外原代培养hBMSCs,进行腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体和质粒载体转染实验。采用倒置荧光显微镜及流式细胞仪检测经基因载体转染后的hBMSCs胞内目的蛋白表达情况。结果倒置荧光显微镜观察结果显示,基因载体转染后的部分hBMSCs胞内有GFP表达而发绿色荧光,其中杆状病毒转导的hBMSCs荧光强度较强。流式细胞仪检测结果表明,腺病毒载体、腺相关病毒载体及质粒载体的转导效率和绿色荧光蛋白阳性细胞平均荧光强度分别是42%、37%、22%和158、115、77,均明显低于杆状病毒的70%(P<0.01)和212(P<0.05)。结论杆状病毒载体对hBMSCs的转导效率高于腺病毒载体、腺相关病毒载体和质粒载体,有望成为人体基因治疗研究中更为理想的基因载体。     

PDGF-B基因转染骨髓间充质干细胞的研究

目的：探讨血小板源性生长因子B（PDGF-B）基因转染修饰大鼠骨髓闻克质干细胞（MSC）的可行性。方法：应用FAM标记重组真核表达载体系统（pcDNA3-PDGF-B）。以脂质体法转染原代MSC。观察转染结果、表达情况孕对靶细胞活力的影响。结果：MSC的基因转染成功，持续表达时间超过了8周，没有发现明显的细胞毒作用及对细胞活力的显著影响。结论：采用真柱转染技术可以介导外源基因转染MSC，MSC是一种理想的基因载体细胞。可用于PDGF-B的基因治疗。     

携带小鼠noggin基因的重组腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞的神经样诱导作用

目的观察noggin基因能否单独将人骨髓间充质干细胞诱导为神经细胞以成为挽救神经退行性病变的"种子细胞"。方法原代培养人骨髓间充质干细胞,分为对照组、空白载体转染的Ad组和含有noggin基因的腺病毒载体转染的Ad-noggin组,观察转染后48h、4、7、10d等时相点各组细胞的形态学变化并行统计学分析。结果2种载体皆可成功转染人骨髓间充质干细胞使其自发绿色荧光,但Ad组形态无显著变化,而Ad-noggin组细胞在转染后48h即可见少量细胞分化为神经样细胞,转染后4d可见神经样细胞数目增多且伸出少量神经细胞样突起,10d时分化的细胞明显增多。与转染后7d相比,Ad-noggin组转染10d时胞体直经和树突直径明显增加(P0.05),但形态无改变。结论单独以含noggin基因的腺病毒载体转染人骨髓间充质干细胞可以使其向神经样细胞分化。     

人VEGF基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：建立人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的方法。方法：采用密度梯度离心-贴壁培养法获Wistar大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,测定其生长曲线和表面标志CD34,CD44,CD45及SH3,检测其向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化潜能后;用脂质体介导法将pcDNA3.1-hVEGF165导入MSCs,观察转染后细胞形态和生长状况,通过RT-PCR,Western blot和ELISA鉴定VEGF在MSCs中的表达情况。结果：大鼠MSCs经检测为CD44和SH3阳性,CD45和CD34阴性,可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞;经RT-PCR,Western和ELISA检测证实阳离子脂质体能成功地将hVEGF。转染至大鼠MSCs,并获得有效的表达。结论：真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165在MSCs中获有效表达。     

BMP7和EGFP重组腺病毒体外转染兔骨髓间充质干细胞的研究

目的 观测体外培养的兔骨髓间充质干细胞生物学特性,并转染重组腺病毒Ad5-EGFP-BMP7,观察BMP7与EGFP的表达情况.方法 通过密度梯度离心联合贴壁法,分离、纯化间充质干细胞;流式细胞仪检测细胞周期和表面标记;体外诱导间充质干细胞向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定.转染后,荧光显微镜及免疫细胞化学染色检测外源基因的表达.结果 原代及传代间充质干细胞为成纤维细胞样细胞;87%以上处于G0/G1期;CD44表达阳性,CD45表达阴性;经成骨细胞诱导后,碱性磷酸酶染色阳性,并有矿化结节形成;经成脂肪细胞诱导后,细胞内出现大量脂滴.转染Ad5-EGFP-BMP7后,荧光显微镜下可见EGFP表达阳性;免疫细胞化学染色显示细胞内BMF7表达阳性.结论 成功分离、纯化间充质干细胞,并鉴定其具有成体干细胞特性;重组腺病毒介导BMP7和EGFP体外成功转染间充质干细胞,并稳定表达BMP7、EGFP,为下一步实验奠定了基础.     

重组质粒pIRESneo-EGFP-BDNF构建及转染骨髓间充质干细胞

目的 探讨重组质粒pIRESneo-EGFP-BDNF构建及转染至骨髓间充质干细胞(MSCs)制备BDNF基因工程细胞的方法.方法 将pEGFP(N1)-BDNF质粒进行改造与pIRESneo相连结,构建携带BDNF的高拷贝质粒pIRESneo-EGFP-BDNF,采用电转染技术转染骨髓MSCs,经G418筛选,通过倒置荧光显微镜判断转染效率,采用Western blot方式判定转染细胞是否表达BDNF蛋白.结果 经过双酶切鉴定,pIRESneo-EGFP-BDNF携带EGFP及BDNF基因,以EGFP为报告基因,质粒构建成功;通过电穿孔技术以及G418筛选,提高pIRESneo-EGFP-BDNF转染骨髓MSCs效率.结论 成功制备高效表达携带BDNF基因的质粒,且转染骨髓MSCs,为进一步开展BDNF基因治疗神经系统变性疾病奠定基础.     

腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞成骨特性研究

目的 通过腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞(human marrow mesenchymal stem cells, hMSCs),观察被修饰细胞CTLA-4Ig蛋白表达情况,以及基因修饰对hMSCs诱导成骨特性的影响.方法 采用荧光显微镜观察腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染hMSCs的绿色荧光蛋白表达,流式细胞术检测确定转染率,观察对比转染前后细胞形态和细胞周期,用免疫细胞化学方法检测转染hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达,转染hMSCs成骨诱导培养3周后进行成骨特异性标记检测.结果 分离培养的hMSCs CD105表达阳性, CD34表达阴性.重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hMSCs的转染率为81.14%, CTLA-4Ig基因转染hMSCs(CTLA-4Ig-hMSCs)的形态无明显变化,生长良好.免疫细胞化学结果显示,CTLA-4Ig-hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达阳性,诱导培养3周的CTLA-4Ig-hMSCs,碱性磷酸酶染色呈强阳性,免疫细胞化学检测骨钙素表达阳性,钙的四环素荧光标记法显示细胞间有钙的沉积.结论 腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hMSCs能够分泌CTLA-4Ig蛋白,并保持了成骨分化潜能,可用于异基因hMSCs作为骨组织工程种子细胞的应用研究.     

SPK1基因转染对大鼠骨髓间充质干细胞的影响

目的观察鞘氨醇激酶-1（SPK-1）基因修饰对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响。方法分别用携带SPK-1和绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒载体,感染大鼠骨髓间充质干细胞后用WesternBlot的方法检测SPK1蛋白表达,用[32P]ATP掺入法检测SPK-1酶活性,用MTT法测定细胞增殖,用特殊诱导剂在体外向成骨和成脂细胞诱导后检测碱性磷酸酶的活性及油红O染色,用AnnexinV-PI双标法检测去血清诱导后细胞凋亡比例。结果Ad-SPK感染大鼠骨髓间充质干细胞后可有效表达SPK-1蛋白且有较高的酶活性;基因转染不影响MSC的增殖和向成骨、成脂细胞的分化,但可显著抑制去血清诱导的细胞凋亡。结论腺病毒介导的SPK-1基因转染不影响MSC的增殖、分化等干细胞基本特性,但可显著增强其抗凋亡能力。