腺病毒介导的RA538基因转移及其对人结肠癌细胞HCT的抑瘤作用

目的　进一步研究ＲＡ５３８ 对人结肠癌细胞系的生物学效应,选用介导ＲＡ５３８ 重组体腺病毒,观察其对人结肠癌细胞系ＨＣＴ 的作用。方法　通过重组体腺病毒将ＲＡ５３８ 基因转导到人结肠癌细胞系ＨＣＴ 中,观察转染ＲＡ５３８ 基因后的肿瘤细胞生长情况。经流式细胞仪、ＤＮＡ 片段化分析及ＴＵＮＥＬ 检测分析抑瘤机制。结果　由重组体腺病毒ＡｄＲＡ５３８ 介导基因ＲＡ５３８ 转导在ＨＣＴ 获得较高的转导效率, ＭＯＩ 为１００ 时可使８０ ％ 细胞转染,并显示对肿瘤细胞生长有明显的抑制作用,抑制率为７４ ％ 。裸鼠皮下注射ＲＡ５３８ 处理的ＨＣＴ 细胞肿瘤形成能力为２０ ％ 。ＤＮＡ 片段化分析、ＴＵＮＥＬ 和流式细胞仪检测,结果证明ＲＡ５３８诱导肿瘤细胞发生凋亡。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析表明,ＲＡ５３８ 具有明显下调ｃｍ ｙｃ 基因表达的作用。结论　ＲＡ５３８ 对人结肠肿瘤细胞有抑制生长和诱导凋亡的作用,可以作为结肠肿瘤基因治疗的１ 种新的治疗基因。     

重组RA538,反义c—myc腺病毒对bcl—2高表达细胞系的作用及分子 …

目的 研究重组ＲＡ５３８（Ａｄ－ＲＡ５３８）、反义ｃ－ｍｙｃ腺病毒（Ａｄ－ＡＳｃ－ｍｙｃ）在ｂｃｌ－２高表达细胞系中的作用及其分析机制。方法 采用细胞形态学观察、ＭＴＴ、ＲＴ－ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ等方法,研究ＲＡ５３８,反义ｃ０ｍｙｃ重组腺病毒在ｂｃｌ－２高表达的人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ－ｂｃｌ２和ＳｉＨａ－ｂｃｌ２以及在其亲本细胞中的生物学作用及其分子机制。结果 以ｌｉｐｏｆｅｃｔｉ     

重组腺病毒介导反义c-myc基因对人肝癌细胞系的治疗作用

目的：探讨重组腺病毒介导反义ｃ－ｍｙｃ基因（Ａｄ－ＡＳｍｙｃ）治疗人肝癌细胞的作用。方法：观察Ａｄ－ＡＳｍｙｃ对人肝癌细胞系的转导效率,通过细胞生长曲线、克隆形成实验、ＤＮＡ片段化分析、ＲＴ－ＰＣＲ、裸鼠皮下移植瘤治疗实验,分析Ａｄ－ＡＳｍｙｃ对人肝癌细胞系Ｂｅｌ－７４０２、ＱＳＧ－７７０１、ＳＭＭＣ－７７２１和ＨＣＣ－９２０４细胞生长和ｃ－ｍｙｃ基因表达及裸鼠肿瘤生长的抑制作用。结果：Ａｄ－ＡＳｍｙｃ可高效转导人肝癌细胞系,抑制细胞生长;转染细胞克隆形成能力降低,克隆成活率为对照组的５３．９％～６９．１％,ｃ－ｍｙｃ基因表达下降;Ａｄ－ＡＳｍｙｃ处理肝癌细胞,ＤＮＡ凝胶电泳出现明显的梯形条带,瘤内注射Ａｄ－ＡＳｍｙｃ可抑制裸鼠皮下移植瘤生长。结论：重组腺病毒介导的反义ｃ－ｍｙｃ基因转移,有可能成为肝癌基因治疗     

携带p16基因重组腺病毒的构建

目的 构建携带p16基因的重组腺病毒并对目的基因的表达进行研究。方法 lipofectamine介导质粒共转染293细胞构建重组腺病毒，病毒DNA提取及电泳，免疫组化检测p16蛋白表达。结果 构建的携带目的基因的重组体腺病毒，经扩增，纯化后，病毒滴度均达到了10^10 pfu/ml 以上。用Ad-LacZ为代表进行重组体腺病毒转导效率的检测，发现当MOI为625以上的感染强度时，就可使100％的体外培养的肿瘤细胞被转导。重组体腺病毒能介导p16外源基因在脑胶质瘤细胞系TJ899和TJ905细胞中表达。结论 腺病毒载体能携带p16基因在转导细胞中表达，并有很高的转导效率。     

腺病毒介导RA538基因转移及其对肿瘤的抑制作用

目的:RA538是从维甲酸诱导终末分化的人食管癌细胞系中分离出的一个与分化相关的基因,本研究探讨了其抗癌作用.方法:利用腺病毒介导基因转移观察对肿瘤细胞的抑制效应.结果:通过重组体腺病毒将RA538基因转导到人肺腺癌细胞系(GLC-82)和人结肠癌细胞系(HCY)中,获得较高的转导效率,显示出较明显的抑制肿瘤生长作用,抑制率分别为77.2%和77.9%,并能降低两细胞系体内肿瘤形成能力.流式细胞计数、DNA片段化分析及TUNEL检测证实RA538可诱导肿瘤细胞发生凋亡.Westem blot分析表明,RA538具有明显下调c-myc基因表达的作用,结论:研究结果提示,RA538是一个较广谱的抑癌基因,可以作为肿瘤基因治疗的一个新目的基因,具有良好的应用前景.     

人结肠癌HCTv2000细胞系耐药机制的初步研究

ＨＣＣＴｖ２０００是人结肠癌ＨＣＴ－８细胞系经长春新碱选择而建立的耐药系。该系细胞对抗Ｐ－糖蛋白单抗呈阳性反应。编码Ｐ－糖蛋白的多向耐药基因ｍｄｒｌ未见扩增或重排，但ｍｄｒｌ ｍＲＮＡ过度表达。异博定使细胞内Ｈ－长春新碱蓄积增多，可部分逆转耐药。据此认为，ｍｄｒｌａｄｌｄｒ ｌｆｎｙｖｉｕ ｎｔｇ ｉｒｙｔｉｔｄｇｊ ＨＣＴｖ２０００细胞耐药的重要原因，但有其他机制参与。     

ＨＭＧＢ１表达载体转染结肠癌细胞对ＶＥＧＦ-Ｄ表达的影响

目的：构建ＨＭＧＢ１表达载体,转染结肠癌细胞,研究其对结肠癌细胞中血管内皮生长因子Ｄ（ＶＥＧＦ-Ｄ）表达的影响。方法：将分离得到的淋巴细胞总ＲＮＡ反转录合成ｃＤＮＡ,以此为模板进行ＰＣＲ扩增得到ＨＭＧＢ１基因;随后酶切转入载体ｐＭＤ１８Ｔ,通过亚克隆转入载体ｐＬｘｓｎ,得到重组质粒。重组体质粒经酶切鉴定后,并对插入的ＨＭＧＢ１基因片段进行测序,将已鉴定的阳性重组质粒用脂质体介导转染ＨＣＴ１１６细胞。通过ＲＴ-ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测ＨＭＧＢ１和ＶＥＧＦ-Ｄ的表达情况。结果：成功构建含ＨＭＧＢ１的表达载体。ＲＴ-ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测发现转染表达ＨＭＧＢ１载体的ＨＣＴ１１６细胞中ＨＭＧＢ１和ＶＥＧＦ-Ｄ的表达均增高。结论：ＨＭＧＢ１可以通过促进结肠癌细胞中ＶＥＧＦ-Ｄ的表达,诱导淋巴管生成,从而促进其淋巴结转移。     

增殖细胞核抗原基因反义RNA表达质粒的构建及对人胃癌细胞的抑？…

观察增殖细胞核抗原基因反义ＲＮＡ表达质粒对人胃癌细胞生长特性的影响,探讨其抗肿瘤作用。方法 用ＤＮＡ重组方法将人ＰＣＮＡ基因反向克隆到真核表达质粒ｐＤＯＲｎｅｏ中,构建成人ＰＣＮＡ基因真核表达质粒ｐＤＲ－ＰＣＮＡ,用指脂质体介导转梁人胃癌细胞系ＳＧＣ－７９０１。     

腺病毒介导的p21基因联合顺铂对胃癌细胞的影响

目的：探讨腺病毒介导的p21基因^WAF1/CIP1基因（p21基因）在人胃癌细胞系SGC0－7901中的表达及其联合顺铂化疗对胃癌细胞生长和荷瘤小鼠的作用。方法：采用腺病毒载体携带p21基因感染人胃癌细胞系，用流式细胞仪测定p21基因对SGC－7901细胞周期的影响，并与DDP联合应用，观察p21基因和（或）DDP对SGC－7901细胞系和荷瘤小鼠的作用。结果：腺病毒介导的p21基因可在胃癌细胞系SGC－7901中过度表达，使胃癌细胞系S期含量下降，抑制其生长，并可诱导胃癌细胞的凋亡；p21基因联合DDP作用使SGC－7901细胞G2／M含量明显下降，并可抑制荷瘤小鼠肿瘤细胞的生长，且联合作用比单一用药作用更明显。结论：腺病毒介导的p21基因可抑制人胃癌细胞系的生长，抑制瘤体的生长，结合化疗药物其作用更强，为临床应用提供了依据。     

腺病毒介导野生型p53基因对人白血病细胞系HL-60、K_(562)生长的抑制作用

目的探索肿瘤抑制基因ｐ５３对人白血病细胞系的生长抑制作用和促凋亡作用。方法选用含野生型ｐ５３基因的重组腺病毒载体,体外感染人白血病细胞系ＨＬ－６０、Ｋ５６２。通过细胞生长曲线,ＤＮＡ检测及流式细胞仪分析检测转染细胞的增殖受抑制和细胞凋亡的发生。结果ＰＣＲ检测转染后ＨＬ－６０和Ｋ５６２细胞ｐ５３ｃＤＮＡ表达。转染后Ａｄ／ｐ５３病毒对ＨＬ－６０细胞和Ｋ５６２细胞的生长有抑制作用。随着Ａｄ／ｐ５３病毒浓度加大,ＨＬ－６０和Ｋ５６２细胞的ＯＤ值越低即生长抑制程度越大。经Ａｄ／ｐ５３病毒转染的ＨＬ－６０和Ｋ５６２细胞均有明显的细胞凋亡峰出现,对照细胞则无。细胞周期分析无明显异常发现。结论重组腺病毒载体介导的野生型ｐ５３基因在体外对人白血病细胞系ＨＬ－６０和Ｋ５６２的生长有抑制作用,能导致细胞凋亡的发生。     

HSP90β蛋白低调肿瘤细胞系的建立 *

目的：通过转染ＨＳＰ９０β反义核酸重组子ｐｃＤＮＡ－ＨＳＰ９０于４株人消化系肿瘤细胞系,以建立ＨＳＰ９０β蛋白低调肿瘤细胞系,并研究ＨＳＰ９０β蛋白低调后细胞的生长情况。方法：用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ介导将ｐｅＤＮＡ－ＨＳＰ９０转染人胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１、人胃癌多药耐药细胞系ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ、人肝癌细胞系ＨＣＣ７４０２及人食道癌细胞系Ｅｃ１０９,用Ｇ４１８进行筛选,用ＲＮＡ酶保护分析法鉴定ＨＳＰ９０β反义核酸的表达,用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法检测ＨＳＰ９０β蛋白的表达。用细胞生长曲线研究基因转染细胞的生长情况。结果：ｐｃＤＮＡ－ＨＳＰ９０转染细胞ＡＨ－ＳＧＣ７９０１,ＡＨ－ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,ＡＨ－ＨＣＣ７４０２及ＡＨ－Ｅｃ１０９有ＨＳＰ９０β反义ＲＮＡ表达,这些细胞ＨＳＰ９０β蛋白表达低调。研究还发现这些细胞的生长受到不同程度的抑制,其中ＡＨ－ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ及ＡＨ－Ｅｃ１０９细胞受抑程度更明显。结论：ｐｃＤＮＡ－ＨＳＰ９０转染细胞ＡＨ－ＳＧＣ７９０１,ＡＨ－ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,ＡＨ－ＨＣＣ７４０２及ＡＨ－Ｅｃ１０９　ＨＳＰ９０β蛋白表达降低,细胞的生长受到不同程度的抑制。     

增殖细胞核抗原基因反义RNA表达质粒的构建及对人胃癌细胞的抑瘤效应

目的观察增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因反义ＲＮＡ表达质粒对人胃癌细胞生长特性的影响，探讨其抗肿瘤作用。方法用ＤＮＡ重组方法将人ＰＣＮＡ基因反向克隆到真核表达质粒ｐＤＯＲｎｅｏ中，构建成人ＰＣＮＡ基因真核表达质粒ｐＤＲＰＣＮＡ，用脂质体介导转染人胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１。结果经Ｇ４１８筛选获得转染细胞ＳＧＣ／ＰＣＮＡ，与亲本细胞相比，其生长速度减慢，ＲＮＡ、蛋白质的生物合成受到抑制，Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期ＤＮＡ含量降低。结论ＰＣＮＡ基因反义ＲＮＡ对胃癌细胞的生长具有明显的抑制作用。     

腺病毒介导的野生型p53基因对肺腺癌细胞株生长的抑制…

为研究野生型Ｐ５３基因对肺腺癌细胞株ＧＬＣ－８２细胞生长的作用，确立腺病毒介导的野生型Ｐ５３基因在肿瘤治疗的意义，应用分子克隆技术首先构建了野生型Ｐ５３复制缺陷型腺病毒重组体，应用生化染色方法确定了重组体的转染效率以免疫组化法及ＰＣＲ技术分别确定了腺病毒载体介导的Ｐ５３基因转染ＧＬＣ－８２细胞后，Ｐ５３蛋白和Ｐ５３ｃＤＮＡ的表达情况；最后应用细胞生物学方法检测了Ｐ５３对ＧＬＣ－８２细胞扩增及细胞周     

p16基因在人卵巢上皮癌细胞系中的缺失分析研究

目的：了解新型抑癌基因ｐ１６在人卵巢上皮癌细胞系中的变异情况,为认识卵巢上皮癌的形成和发展依据。方法：应用ＰＣＲ扩增、ｍＲＮＡ原位杂交和免疫细胞化学方法,对５种人卵巢上皮癌细胞系ＣＡＯＶ３、ＯＶＣＡＲ３、ＡＯ、ＨＯ－８９１０及ＨＯ－８９１０ＰＭ进行分析。结果：５种人卵巢上皮癌细胞系中只有ＣＡＯＶ３（２０％）显示ｐ１６基因纯合性缺失,ＣＡＯＶ３细胞亦无ｐ１６基因ｍＲＮＡ及蛋白表达。ＯＶＣＡＲ３、Ｈ０     

大肠癌组织及结肠癌细胞系中FHIT基因的异常表达

目的：探讨ＦＨＩＴ基因与大肠癌的关系。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ及ＰＣＲ产物直接测序法,对３０例大肠癌组织及其配对正常组织,４个结肠癌细胞系的ＦＨＩＴ基因进行检测。结果：在８例（２６．７％）大肠癌组织和２个（５０％）结肠癌细胞系中检测到异常ＦＨＩＴ转录本,配对正常组织均无异常ＦＨＩＴ转录本;测序证实异常转录本缺失１￣３个ＦＨＩＴ外显子。异常ＦＨＩＴ转录本与大肠癌患者的年龄,性别、血清ＣＥＡ水平、肿瘤部     

重组人白介素2腺病毒对腺水癌的治疗作用

目的：为鉴定已构建的重组ｈＩＬ－２腺病毒（ＡｄｖＩＬ－２）活性,在体外转导人多种癌细胞系,以及观察重组病毒对小鼠腹水癌的治疗作用。方法：通过ＥＬＩＳＡ法测定所表达ｈＩＬ－２的量,ＭＴＴ法测定所表达ＩＬ－２的活性。从注射后２４ｈ后,每日称量试验小鼠的体重,并观察小鼠的存活情况。结果：发现ＡｄｖＩＬ－２在体外能高效转导多种癌细胞,并检测到有１０ｎｇ水平ｈＩＬ－２表达,持续时间为３周左右。腹腔注射治疗小     

腺病毒介导人p53、B7-1、GM-CSF、IL-2基因在肝癌细胞中的表达

我们以Ｅ1、Ｅ3区缺失的血清 5型腺病毒为载体 ,构建了同时含人ｐ5 3、Ｂ7 1、ＧＭ ＣＳＦ、ＩＬ 2基因的重组腺病毒载体 ,并研究其在肝癌细胞中的表达。一、材料与方法1 细胞培养和构建单、双顺反子重组腺病毒载体 :肝细胞癌细胞系ＨｅｐＧ2、ＢＥＬ740 2、ＳＭＭＣ772 1,含 5型腺病毒Ｅ1片段的人胚肾细胞系 2 93细胞 ,正常人肝细胞系Ｌ0 2和大鼠癌肉瘤Ｗａｌｋｅｒ 2 5 6细胞 ,分别培养于含 10 %胎牛血清的高糖型ＤＭＥＭ或ＲＰＭＩ 16 40中。所有目的基因均被克隆到质粒ｐＸＣＪＬ1[1] 中 ,再与重组质粒ｐＪＭ17通过脂质体ＤＯＴＡＰ介导…     

逆转录病毒介导高效的白血病细胞基因转移

目的建立安全高效的逆转录病毒介导的基因转移系统,为白血病基因治疗提供实验基础。方法分别用脂质体转染和小鼠逆转录病毒转导方法,将含标志基因ＮｅｏＲ的逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ导入双嗜型包装细胞ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２,获得重组逆转录病毒;用含病毒上清感染白血病细胞系（ＮＢ４、Ｕ９３７和ＴＨＰ－１）,并分析对Ｋ５６２细胞的转导效率。结果脂质体ＤＯＳＰＥＲ转染法获得病毒滴度为８．０×１０５ＣＦＵ／ｍｌ,而病毒感染法高达１．６×１０７ＣＦＵ／ｍｌ。经Ｇ４１８选择,ＰＣＲ证实ＮｅｏＲ基因被整合到白血病细胞基因组中,巢式ＰＣＲ与补救分析均未检测到辅助病毒存在。单个集落Ｋ５６２细胞的ＰＣＲ分析证实,基因转移效率可达９３．３％～１００％。结论逆转录病毒介导的基因转移系统是高效、安全的,有助于人类白血病的基因治疗研究。     

腺病毒介导野生型p53基因对人白血病细胞系HL—60,K562生长的抑制作用

目的 探索肿瘤抑制基因Ｐ５２对人白血病细胞系的生长抑制作用和促凋亡作用。方法 选用含野生型ｐ５３基因的重组腺病毒载体，体外感染人白血病细胞系ＨＬ－６０，Ｋ５６２。通过细胞生长曲线，ＤＮＡ检测及流式细胞仪分析检测转染细胞的增殖受抑制和细胞凋亡的发生。结果 ＰＣＲ检测转染后ＨＬ－６０和Ｋ５６２细胞ｐ５３ ｃＤＮＡ表达。     

E1A基因对人肺腺癌细胞化疗敏感性的影响 *

目的：探讨Ｅ１Ａ基因对人肺腺癌细胞的化疗增敏作用。方法：通过脂质体介导将Ｅ１Ａ基因导入人肺腺癌细胞系Ａ－ｎｉｐ９７３,经Ｇ４１８筛选获得稳定表达Ｅ１Ａ的转染细胞（Ａｎｉｐ９７３－Ｅ１Ａ）。用不同浓度顺铂、泰素及ＶＰ１６等化疗药物处理细胞,观察Ｅ１Ａ基因对人肺腺癌细胞的化疗增敏作用。结果：Ａｎｉｐ９７３－Ｅ１Ａ细胞对顺铂、泰素的敏感性显著增加,顺铂的ＩＣ５０值减少了７倍,并且敏感性随时间的延长而增加。但对ＶＰ１６,Ｅ１Ａ基因的稳定表达在该细胞系未显示增敏作用。免疫细胞化学染色显示,Ｅ１Ａ基因抑制了ＨＥＲ－２／ｎｅｕ的表达。结论：Ｅ１Ａ基因能增加人肺腺癌细胞对顺铂、泰素等化疗药物的敏感性。该作用可能与Ｅ１Ａ基因抑制ＨＥＲ－２／ｎｅｕ的表达有关。为在恶性肿瘤治疗上化疗和基因治疗联合应用的可能性提供了实验依据。