牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因在大肠杆菌的融合表达

目的：克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因,并使其在大肠杆菌中融合表达。方法：利用PCR方法克隆fimA,并用基因重组融合表达技术获得在大肠杆菌中的表达。结果：克隆基因测序结果与GenBank数据库中的序列呈现99．9％同源性;经诱导表达后可观察到Mr38kDa的融合蛋白。结论：成功克隆了fimA基因,并在大肠杆菌中表达了FimA蛋白,为后续研究奠定了基础。     

牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因的克隆及表达纯化

目的克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因并使其在大肠杆菌中正确表达。方法利用PCR方法克隆牙龈卟啉单胞菌fimA基因,构建其原核表达质粒pT-BAD/fimA,获得其在大肠杆菌中的表达,基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定重组蛋白。以不同质量浓度咪唑缓冲液（250、200、150、100、50 μmol·L-1）洗脱结合在His-tag纯化柱的目的蛋白,选择最佳洗脱质量浓度。结果克隆基因测序结果与GeneBank数据库中的序列呈现99.9%同源性;诱导表达后可观察到相对分子量3.8×104的融合蛋白,经MALDI-TOF-MS检测进一步证实为FimA蛋白。100 μmol·L-1咪唑缓冲液洗脱得到的蛋白质纯度最高,其纯度为95%。结论本实验成功克隆了fimA基因,并获得在大肠杆菌中的正确表达,同时得到纯度较高的FimA蛋白,为后续研制增强免疫应答的高效牙周炎真核表达质粒奠定了基础。     

牙龈卟啉单胞菌精氨酸牙龈素催化结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆牙龈卟啉单胞菌精氨酸牙龈素催化结构域（RgpAcd）基因,并将其置于大肠杆菌中作融合表
达。方法 利用PCR技术和基因重组技术,克隆牙龈卟啉单胞菌RgpAcd,然后插入中介载体pMD18-T中并测序鉴定。将目的基因片段插入原核表达载体pET-15b来构建表达质粒pET-15b/RgpAcd。重组原核表达质粒经酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白。结果 核酸序列测定与分析的结果表明,克隆的1 476 bp基因序列与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性;IPTG诱导后的菌体经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后有一个相对分子质量为5×104的融合表达蛋白产生。结论 本实验成功克隆了牙龈卟啉单胞菌RgpAcd基因,并在大肠杆菌中表达了RgpAcd蛋白,为进一步研制重组活载体疫苗奠定了基础。     

牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建原核表达载体,诱导其在大肠杆菌中融合表达,并鉴定、纯化其表达产物。方法克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建表达载体pET15b-FimA,转化大肠杆菌BL21（DE3）pLyS感受态细胞;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白,以抗6×His Tag单克隆抗体为一抗,Western blot鉴定、Co2+柱亲和层析纯化融合蛋白。结果克隆的FimA基因序列及插入表达载体中的FimA序列均与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性;IPTG诱导后Western blot鉴定4.1×104处有目的蛋白表达;Co2+柱亲和层析法获得纯化的高浓度FimA蛋白。结论本实验成功构建了牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因的原核表达载体pET15b-FimA,并在大肠杆菌中获得成功表达和纯化,为进一步制备牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白单克隆抗体和研制开发预防牙周炎的亚单位蛋白疫苗奠定了实验基础。     

变形链球菌葡糖基转移酶催化活性区的分子克隆及表达

目的:克隆变形链球菌葡糖基转移酶中催化活性区(CAT)的基因片段,并在大肠杆菌中表达.方法:通过PCR技术克隆CAT的基因片段并通过蛋白重组融合表达技术使其在大肠杆菌中表达.结果:成功克隆了CAT的基因片段,并在大肠杆菌中得到其融合蛋白的表达.结论:成功克隆葡糖基转移酶CAT基因并获得其融合蛋白的表达,为后续研究奠定了基础.     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白B功能区片段的分子克隆及表达

目的 :克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白B(GbpB)功能区的基因片段 ,并在大肠杆菌中表达。方法 :通过PCR技术克隆GbpB功能区的基因片段并通过蛋白重组融合表达技术使其在大肠杆菌中表达。 结果 :成功克隆了GbpB功能区的基因片段 ,并在大肠杆菌中得到其融合蛋白的表达。 结论 :利用分子生物学技术能够成功克隆GbpB功能区基因并获得其融合蛋白的表达 ,为后续研究奠定了基础     

牙龈卟啉单胞菌基因疫苗pcDNA3.1(+)/kgpcd免疫原性研究

目的:研究重组质粒pcDNA3. 1( ) /kgpcd免疫原性,并观察目的基因编码的蛋白在小鼠肌肉及颌下腺组织中的原位表达情况。方法:重组质粒pcDNA3. 1 ( ) /kgpcd经肌肉注射和颌下腺区注射免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA方法检测免疫后BALB/c小鼠血清中IgG和唾液中sIgA抗体水平;用免疫组织化学染色观察目的基因编码的蛋白在小鼠组织中的表达。结果:重组质粒经肌肉注射免疫可产生高水平的特异性血清IgG抗体,颌下腺区注射可同时诱导高水平的唾液中sIgA和血清中IgG抗体;骨骼肌、颌下腺导管内、腺泡腔内可见阳性着色。结论:重组质粒pcDNA3. 1( ) /kgpcd经颌下腺注射可同时诱导黏膜免疫和全身免疫应答,可作为有效免疫原,这为免疫牙周炎模型定菌鼠实验提供了依据。     

牙龈卟啉单胞菌肽酰精氨酸脱亚氨酶的克隆与表达

目的:构建牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD)克隆表达重组子,转化于大肠杆菌BL21中,并在最适宜条件下诱导表达。方法:以牙龈卟啉单胞菌ATCC33277全基因组DNA为模板,利用PCR技术获得目的基因PAD,将扩增得到的PAD基因定向插入线性克隆载体PMD18-T Vector中,得到克隆重组子PMD18-T-PAD。经PCR和双酶切鉴定正确的克隆重组子PMD18-T-PAD与表达载体PET-28a经Xhol和Ncol双酶切后,在一定连接体系下,连接构建表达质粒PET-28a-PAD。鉴定正确的原核重组表达质粒PET-28a-PAD,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,在不同浓度异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及时间诱导下表达融合蛋白。以抗His Tag单克隆抗体为一抗,Western免疫印迹鉴定。结果:DNA测序结果表明,PAD与NCBI核酸数据库中收录的PAD序列同源性达100%;37℃,IPTG浓度为0.5mmol/L,250r/min振摇培养6h的诱导条件下,PAD可高效表达。结论:本实验成功构建了PAD的克隆表达重组子,并在大肠杆菌中表达了PAD蛋白,为进一步研究PAD的免疫学性能及相应的抗体制备奠定了基础。     

TRAF-6真核表达载体的构建和转染牙龈上皮细胞

目的:构建TRAF-6与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体,为研究其在口腔疾病发病中的作用奠定基础。方法:应用基因重组技术,将反转录PCR得到的TRAF-6基因,克隆入荧光真核表达载体pEGFP-N3中,用含卡那霉素LB培养基平板筛选转化菌,阳性重组子经HindⅢ和KpnⅠ双酶切分析、PCR鉴定。重组质粒酶切鉴定正确后,以脂质体转染牙龈上皮细胞。分别由间接免疫荧光和免疫组织化学检测目的蛋白的表达。结果:获得的TRAF-6基因重组真核表达质粒,经间接免疫荧光和免疫组化检测,TRAF-6成功转染上皮细胞。结论:成功克隆TRAF-6基因,构建了融合有TRAF-6基因的真核表达质粒,对其在体外进行了表达,并转染牙龈上皮细胞,为进一步的研究奠定了基础。     

变形链球菌gbpA的葡聚糖结合区GBD的分子克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：克隆变形链gbpA的葡聚糖结合区GBD的基因片段，并使其在大肠杆菌中获得表达。方法：PCR技术克隆GBD片段及蛋白重组融合表达技术获得其在大肠杆菌中的表达。结果：成功克隆变形链球菌gbpA的葡聚糖结合区GBD的基因片段，并在大肠杆菌中得到表达。结论：利用分子生物学技术能够成功克隆目的基因并获得融合蛋白的表达。     

牙龈卟啉单胞菌Hgp44基因的克隆表达与纯化

目的 克隆表达牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)牙龈素中黏附素区域的Hgp44基因,并纯化目的蛋白.方法 通过聚合酶链反应(PCR)和基因重组技术,克隆得到PgATCC33277的Hgp4基因,插入到克隆载体pMD18-T中并测序鉴定.经过酶切后将目的基因片段与表达载体pET22b相连,构建出表达质粒pET22b-Hgp44.将重组质粒转化到感受态细胞BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白,通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹法进行分析.用固定化金属亲和层析法对重组蛋白进行分离纯化.结果 目的基因片段约为1100 bp,与预期大小相符,测序结果与GenBank中ATCC33277国际标准菌株的RgpA的等位基因序列U15282一致.IPTG诱导后的菌体经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后形成一个以包涵体形式存在的44 000的融合蛋白.蛋白质印迹法检测证实其具有免疫原性.用镍离子金属螯合层析柱纯化出了目的蛋白,最后得到约3.5 mg/L的目的蛋白.结论 成功克隆表达了PgHgp44基因,并纯化出了目的蛋白.     

牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K催化结构域融合蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备

目的纯化牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K催化结构域（KGPcd）融合蛋白并制备其多克隆抗体，为下一步的实验提供条件。方法KGPcd蛋白与载体pET-16b中的His标签融合表达，用Ni—NTA亲和层析纯化融合蛋白，复性后用Westernblot检测。以重组、纯化的KGPcd蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，用间接ELASA法检测抗体效价，WesternBlot进行抗血清特异性试验。结果经亲和层析、复性得到纯化融合蛋白His．KGPcd，Westernblot进一步证实纯化的蛋白为His．KGPcd融合蛋白。抗血清稀释达1：3200时，ELASA法仍有明显的抗原抗体反应，Westernblot也进一步证实抗血清能够与KGPcd发生特异性反应，抗体仅特异识别目的蛋白。结论成功制备兔抗KGPcd多克隆抗体，为后续研究奠定基础。     

融合防龋DNA疫苗pGLUA-P的构建及其细胞表达研究

目的 将变形链球菌（Streptococcus mutans)表面蛋白PAc编码A区和P区（A－P）的序列克隆到真核载体pGLU中，构建出GTF－PAc融合防龋DNA疫苗，并检测其在原核细胞和真核细胞中的表达。方法 将pCIA-P质粒中A－P片段序列与pGLU质粒连接，构建出GTF－PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA-P。将pGLUA-P转化大肠杆菌BL21（DE3），以SDS－PAGE电泳鉴定目的蛋白GLUA－P的表达。通过脂质体将pGLUA-P转染大鼠原代肌母细胞，以免疫组织化学检测GLUA－P的表达。结果 GTF－PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA-P经酶切分析证实携带GLU和A－P片段。pGLUA-P转化的大肠杆菌BL21（DE3）经IPTG诱导能够表达完整的融合蛋白。pGLUA-P转染的大鼠原代肌母细胞中可检测到融合蛋白的表达。结论 成功地构建了融合防龋DNA疫苗pGLUA-P，所携带的基因序列正确，能够在原核和真核细胞中表达正确的融合蛋白。     

牙龈卟啉菌特异DNA片段的分子克隆

采用ＰＣＲ扩增Ｐｇ特异ＤＮＡ片段作为外源目的ＤＮＡ，将质粒载体ｐＵＣ１９和外源ＤＮＡ用限制性内切酶ＰｓｔＩ和ＢａｍＨＩ消化，经过连接形成重组质粒并转化细菌后，选白色菌落进行鉴定。结果证实我们成功地获得了含Ｐｇ特异基因片段的克隆。通过将细菌增菌后就可得到取之不尽的特异ＤＮＡ片段。为研究Ｐｇ的基因结构，致病机理以及制备特异的核酸探针检测细菌奠定了基础。     

血管内皮生长因子-C表达载体的构建和原核表达

目的　探讨从人舌癌组织中克隆到的血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor,VEGF-C) 片段cDNA表达载体在原核细胞中的功能表达,为进一步研究VEGF-C在口腔鳞癌中表达的意义及与淋巴转移的关系打下基础。方法　以RT-PCR法从舌鳞癌组织中克隆的VEGF-C基因功能片段cDNA与表达载体pBK-CMV构建表达质粒,转化并诱导其在大肠杆菌中的表达,并通过SDS-PAGE及Western-blotting进行检测。结果　从人舌癌组织总RNA中克隆到约1·1 kb大小的VEGF-C基因cDNA,与Genbank公布的人VEGF-C基因cDNA序列有99·6% 同源性,以之构建出的重组质粒pBK-VEGF-C转染大肠杆菌经IPTG诱导后,检测到稳定表达的相对分子质量约 56 000的融合蛋白,该融合蛋白与VEGF-C多抗具有强阳性免疫印迹反应。结论　证实克隆得到VEGF-C基因功能片段cDNA可在原核细胞中成功表达,为进一步研究VEGF-C在口腔癌颈淋巴结转移中的功能效应提供了物质基础。     

大鼠釉原蛋白基因表达的载体构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 观察釉原蛋白（ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ,Ａｍ）基因聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ,ＰＣＲ）产物在大肠杆菌中的表达。方法 利用谷胱苷肽巯基转移酶表达载体４Ｔ－２型（ｐｔａｃ ｇｌｕｔａｈｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ,ＰＧＥＸ－４Ｔ－２）载化大肠杆菌ＤＨ５α,通过异丙基硫代半乳糖苷（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ,ＩＰＴＧ）诱导,收菌。聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果 电泳分析表明,釉原蛋白基因ＰＣＲ产物在大肠杆菌中成功地获得了表达。结论 构建了ＰＧＥＸ－４Ｔ－２／Ａｍ融合表达载体,获得了融合表达的目的蛋白。     

猪牙胚釉原蛋白成熟肽基因原核表达克隆的构建

目的克隆猪釉原蛋白（pAm）成熟肽编码区基因片段，并构建含有该基因的重组原核表达质粒，为制备基因工程化的重组pAm奠定基础。方法从新生小猪牙胚组织中抽提总RNA，逆转录合成牙胚cDNA，通过PCR扩增pAm成熟肽编码序列（约540bp），所得目的基因插入表达载体质粒PGEX4T1，转化大肠杆菌DH5α。重组质粒PGEX4T1-pAm经双酶切和核苷酸序列分析鉴定。结果重组质粒PGEX4T1-pAm经双酶切和测序鉴定证实载体质粒PGEX4T1中插入的基因片段与pAm成熟肽基因序列完全相同。结论从发育期猪牙胚组织中克隆到釉原蛋白成熟肽编码序列可成功构建含有pAm成熟肽基因的重组表达质粒。