人外周血内皮祖细胞的分离培养及鉴定

目的:从人外周血中分离培养内皮祖细胞(EPCs),并探讨其体外诱导培养的条件。方法:密度梯度离心法分离正常人外周血单个核细胞,置于鼠尾胶原包被的培养瓶中进行体外培养,流式细胞术和免疫荧光法检测分化细胞表面特异性抗原标记物的表达。结果:人外周血单个核细胞在鼠尾胶原包被的培养瓶中培养后呈梭形,并表达内皮细胞的特异性抗原CD34和KDR,和干/祖细胞抗原CD133。提示这些培养细胞既具有内皮细胞的表面标志和功能,又具有祖细胞特性。结论:成功从外周血中培养出EPCs。鼠尾胶原可取代EPCs培养中常用的纤维连接蛋白,是体外分离培养外周血EPCs的更节省的一种方法。     

脐血、外周血内皮祖细胞分化成内皮细胞的实验研究

目的探讨人的脐血、外周血内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的可行性,并检测其表型和功能。方法新鲜脐血和健康成年人的外周血,使用Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,在M199培养基中体外培养,3d后去除悬浮细胞,继续培养,诱导EPCs增殖和分化。流式细胞仪检测EPCs标志CD34和内皮细胞特异性标志CD31表型,RTPCR检测ecNOS,flk1/KDR基因水平表达,免疫组化验证蛋白水平表达,并进一步通过NO活性的变化检测内皮细胞的功能。结果流式细胞仪检测,外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）刚分离时,CD34阳性表达率为（1.1±0.8）%,培养3d后为（16.9±6.2）%。细胞形态观察发现,刚分离的单个核细胞呈圆形,形态小,3d后有明显集落形成,7d后梭形细胞线样排列,随培养时间增加,细胞形态逐渐变大,呈现出典型铺路石样改变。脐血单个核细胞（umbilicalcordbloodmononuclearcells,CBMC）和PBMC培养10d后,CD31阳性表达率分别为（76±17）%和（82±9）%。RTPCR检测有内皮细胞特异性成分ecNOS,flk1/KDR的表达。免疫组化染色,细胞膜和细胞浆中有弥漫性棕色出现,呈阳性反应,证实了蛋白水平的表达。培养10d的贴壁细胞随着VEGF浓度增加,NO生成增加,具有内皮细胞的功能。结论脐血,外周血EPCs体外分离,纯化,诱导培养后的贴壁细胞表型检测,大部分细胞具有内皮系标志物,并具有产生NO功能。     

人脐血内皮祖细胞的体外分离和培养

目的建立一种稳定的体外分离和培养人脐血来源内皮祖细胞的方法。方法采用密度梯度离心法从人脐带血中分离单个核细胞,将其接种至人纤维连接蛋白包被的六孔板中,用EGM-2培养基诱导培养。通过形态学观察、细胞表面特异性抗原、摄取功能和体外血管形成能力对内皮祖细胞进行鉴定。结果细胞形态学观察发现,刚分离的单个核细胞较小,呈圆形,4 d后可见少量的圆形和梭形贴壁细胞,8 d后有明显集落形成,14 d后相邻集落相互融合,呈现出典型铺路石样改变。内皮祖细胞能摄取乙酰化低密度脂蛋白,结合荆豆凝集素1,表达CD34、CD133和血管内皮细胞生长因子受体2,并且具有体外血管生成能力。结论采用密度梯度离心法可从人脐带血中成功分离和培养出内皮祖细胞,以用于相关实验研究。     

内皮祖细胞及造血祖细胞在心血管疾病中的意义及研究进展

1 关于内皮祖细胞在心血管疾病中的研究 1.1 内皮祖细胞定义、表型特征及来源 内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一类具有特异性归巢于损伤区域并能分化增殖为成熟内皮细胞的一群干细胞.研究表明,EPCs可能来源于骨髓,在脐带血和外周血中也有存在.EPCs的表面标志尚未明确,一般认为CD34+KDR+细胞代表EPCs,而CD34(-)CD133(+)KDR(+)细胞代表更早期循环EPCs,具有更强的参与血管新生能力.1997年,Asahara等[1]首次在中分离出CD34+及ilk-l-的单个核细胞,研究证明这些细胞在体外能够参与成年动物血管的形成,具有EPCs的功能.此后,Shi等[2]也在人的骨髓、脐带血、10 ～ 15 w胎肝及外周血中分离了较高纯度的CD34(+)细胞.随后的一些研究中研究者又从异基因骨髓移植手术后的受者外周血中分离出单个核细胞,处理后观察发现具有内皮细胞特征的梭形细胞.种种实验研究表明,EPCs来源于骨髓、脐带血及外周血液等.     

人外周血单个核细胞不同克隆成分向内皮祖细胞分化的实验研究

目的:探讨从成人外周血单个核细胞中分离、培养内皮祖细胞(EPCs)的方法以及EPCs的生物学特征。方法:密度梯度离心法获得单个核细胞,用含生长因子的内皮培养基接种于纤连蛋白包被的培养板中。细胞在接种后每2 h去除1次未黏附细胞共2次,然后隔日换液1次,7 d后计数早期克隆。每例血样均分为2等份,1份在获得早期克隆后进行下列实验;另1份持续培养直到晚期克隆出现进行相同实验。流式细胞技术检测细胞表面抗原表达,直接荧光染色法测定细胞结合荆豆凝集素及摄取乙酰化LDL,胶原凝胶细胞种植实验测定体外血管生成功能。结果:早期克隆中心为圆形细胞,周边是放射状排列的纺锤形细胞,再种植不能形成第2代克隆且无体外血管形成功能,细胞表面主要表达CD14和CD45。晚期克隆形态不同于早期克隆,在培养21～28 d间出现,再种植可形成第2代内皮细胞克隆,并能在胶原凝胶中形成管腔样结构。其构成细胞与早期克隆相比CD45、CD14表达显著减少(P<0.01)而CD146表达明显增加(P<0.01),2种克隆的构成细胞在结合植物凝集素和摄取乙酰化LDL方面未存在显著差异。结论:人外周血单个核细胞在内皮培养条件下可形成早期克隆和晚期克隆,早期克隆属于单核细胞系列,晚期克隆细胞具有EPCs的形态和生物学特征。     

从外周血单个核细胞中获得内皮祖细胞的方法学研究

目的 探讨从成人外周血单个核细胞中分离、培养内皮祖细胞(EPCs)的方法以及EPCs的生物学特征.方法 密度梯度离心法获得单个核细胞(MNCs),用含生长因子的内皮培养基接种于纤连蛋白包被的培养板中.分别采用常规方法(A组)和序列黏附法(B组)培养,A组细胞于接种第4天洗去未黏附细胞然后隔日换液1次;B组细胞接种后每2 h去除1次未黏附细胞,共2次.两组细胞均在7 d后计数早期克隆,持续培养直到晚期克隆出现.流式细胞技术检测细胞表面抗原表达,直接荧光染色法测定细胞结合荆豆凝集素及摄取乙酰化低密度脂蛋白,胶原凝胶细胞种植实验测定体外血管生成功能.结果 早期克隆数目的 获得在2组间差异有统计学意义,但序列黏附法获得晚期克隆数目显著增加(P＜0.05),且B组的早期克隆细胞表达CD3显著减少(P＜0.05).晚期克隆形态不同于早期克隆,在培养21～28 d出现,其组成细胞与早期克隆相比CD45、CD14表达显著减少(P＜0.001)而CD146表达明显增加(P＜0.01),只有晚期克隆再种植可形成第二代内皮细胞克隆,并具有体外血管生成功能.两种克隆的构成细胞在结合植物凝集素和摄取乙酰化低密度脂蛋白方面差异无统计学意义.结论 人外周血单个核细胞在内皮培养条件下可形成早期克隆和晚期克隆,早期克隆属于单核细胞系列,无内皮分化功能;晚期克隆细胞具有EPCs的形态和生物学特征,应用序列黏附法可显著提高晚期克隆获得率.     

人循环内皮祖细胞不同克隆成分的体内外血管生成功能不同

目的探讨成人外周血循环来源的内皮祖细胞不同克隆成分表型特点及体内外血管生成差异。方法密度梯度离心法获得单个核细胞,用含生长因子的内皮培养基接种于纤维连接蛋白包被的培养板中。7d后计数早期克隆并进行下面实验,另1份持续培养直到晚期克隆出现进行相同实验。流式细胞术检测细胞表面抗原,间接荧光染色法鉴定细胞表达假血友病因子。胶原凝胶细胞体外种植及裸鼠体内移植实验分别测定体外及体内血管生成功能。结果早期克隆再种植不能形成第二代克隆且无体内外血管形成功能,细胞表面主要表达CD14和CD45。晚期克隆在培养21~28d间出现,再种植可形成第二代内皮细胞克隆,并能在体外和裸鼠体内胶原凝胶中形成管腔样结构,细胞表达CD45和CD14显著减少(P<0.001)而CD146明显增加(P<0.01)。结论人外周血单个核细胞在内皮培养条件下可形成早期克隆和晚期克隆,只有晚期克隆表现出干/祖细胞和内皮细胞双重表型特征并具有体内外血管生成功能。     

兔外周血与骨髓源性内皮祖细胞培养鉴定及生物学特性的研究

目的:探索并建立兔内皮祖细胞(EPCs)的体外培养、鉴定方法。方法:采用密度梯度分离法分别从兔外周血和骨髓中分离出单个核细胞,接种于预包被明胶的培养瓶,并应用培养基(EBM-2)诱导培养,诱导分化为EPCs;在倒置显微镜下观察两种源性细胞生长过程;台盼蓝法测定细胞传代成活率;通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测比较两种源性获得的EPCs增殖情况;采用免疫荧光染色观察EPCs相关抗原CD34、CD31、CD133及vWF因子的表达。结果:两种源性EPCs均于培养3～4d完全贴壁,呈克隆样生长,7～9d形成类似成熟血管内皮细胞形态,细胞数量逐渐增多,细胞成活率均为95%。两种源性获得的第2代细胞生长曲线近似"s"形、MTT法显示3～5d细胞增殖较明显,外周血源性EPCs G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为96.48%和3.52%,骨髓源性EPCs G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为97.11%和1.84%。第2代EPCs进行免疫荧光鉴定结果显示:两种源性内皮祖细胞均阳性表达CD34、CD133、vWF因子,CD31弱阳性表达。结论:两种源性的EPCs均可高效获得且在体外稳定培养。与传统的骨髓源性EPCs相比较,从外周血源获得的EPCs是一种可靠、简便的培养方法,为组织工程学提供理想的细胞来源。     

大鼠外周血晚期内皮前体细胞体外培养研究

目的体外培养大鼠外周血内皮前体细胞（EPCs）,观察细胞克隆形态并进行鉴定。方法密度梯度离心法分离SD大鼠外周血单个核细胞,EGM-2培养基离体培养。免疫荧光染色鉴定细胞CD34、CD31、CD133、FLk-1、vwF细胞表面标志。Real—TimePCR检测细胞CD34、CD133、FLk-1、eNOSmRNA表达。结果细胞培养10天后可见“铺路石样细胞”和少数“紊乱生长细胞”,传代培养后经免疫荧光及Real—TimePCR鉴定“铺路石样细胞”符合晚期EPCs特点,紊乱生长细胞不表达相应标志。结论通过体外分离长时培养可从大鼠外周血获得晚期内皮前体细胞,具有内皮细胞的特征。     

外周血单个核细胞向血管内皮祖细胞分化的体外研究

目的该实验从简化方法、提高得率的角度出发,试图建立直接培养单个核细胞(MNC)而得到血管内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)的方法。方法抽取人外周抗凝血,用Ficoll密度梯度离心法分离得到MNC,体外对MNC进行诱导分化培养,然后选择免疫荧光、免疫组化、流式细胞记数和RT-PCR方法鉴定培养所得的细胞是否具有EPCs的特征。结果MNC在培养的第2天开始出现成簇现象;第4天细胞由圆形转变为梭形贴壁细胞,呈条索状或管状分布;第7天85%的贴壁细胞摄取Ac-LDL;第14天免疫荧光和免疫组化检测CD31、CD34、vWF、Flk-1均阳性;同时流式细胞记数检测结果显示CD31和CD34均为阳性;另外RT-PCR结果显示培养的细胞表达内皮细胞特异性基因Flt-1,Flk-1、ecNOS、tie-2等。结论用此方法培养的MNC细胞具备了内皮细胞以及干细胞双重特征,故初步认定,人外周血MNC在体外经适当条件的培养,完全可以分化成EPCs。