微波脱钙在骨组织原位杂交中的应用

脱钙是制作骨组织切片的必需步骤 ,目前常用的酸性脱钙液效果不甚理想。笔者利用乙二胺四乙酸二钠(ＥＤＴＡ)作为脱钙液在微波作用下脱钙 ,并将脱好钙的骨组织用于原位杂交实验 ,取得较理想的效果。材料与方法1.材料 :健康大耳白兔 12只 ,体重(2 .75± 0 .2 5 )ｋｇ,雌雄不限。微波炉 ;ＥＤＴＡ ;血管内皮生长因子 (ＶＥＧＦ)ｍＲＮＡ试剂盒 (武汉博士德生物工程公司 )。2 .致伤与取材 :30ｇ Ｌ戊巴比妥钠(30ｍｇ ｋｇ)耳缘静脉注射麻醉 ,右后肢常规脱毛 ,复制兔胫骨骨折模型 ,并安装好自制实验用半环槽式外固定架。术后3ｄ肌肉注射青霉素 ,…     

三种脱钙液对骨组织脱钙后切片染色效果分析

在病理工作中,骨组织的脱钙处理是一大技术难题。骨组织是一种坚硬的结缔组织,由细胞、基质和纤维组成,纤维是和胶原纤维一样的骨胶原纤维,其基质含大量固定的无机盐。骨组织内共有骨母细胞、骨细胞、破骨细胞三种细胞,要顺利制出一张质量较好的组织切片并非易事,基本要求是切片完整,染色后各种骨细胞的细胞核及胞浆清晰,细胞外胶原对比度好。目前使用的脱钙方法有很多种,可以分为酸类脱钙液、螯合剂脱钙液、电解法脱钙液等。     

应用PCR技术检测痰液中结核杆菌DNA

聚合酶链反应（PCR）是一种新的基困诊断技术，我们运用此项技术对痰液中的结核杆菌DNA进行了检测，现报告如下。     

天然珊瑚和同种异体脱钙骨基质作为骨组织工程支架的组织相容性研究

目的：评价天然滨珊瑚(NC)和同种异体脱钙骨(DBM)的组织相容性，探讨其作为骨组织工程支架的可行性。方法：将NC和DBM直接植入动物体内，术后1、2、6周取材，通过大体观察和组织学检查观察生物材料在体内组织反应。结果：两种材料均未引起明显的炎症和排斥反应，对实验动物无不良影响。同时发现DBM组诱导出少量骨组织，NC组未见新生骨。结论：NC和DBM具有良好的组织相容性，DBM还具有鲁诱导性，两种材料可能都是比较理想的骨组织工程支架材料。     

天然珊瑚和同种异体脱钙骨基质作为骨组织工程支架的细胞相容性研究

目的 :评价天然滨珊瑚 (NC)和同种异体脱钙骨 (DBM)的细胞相容性 ,探讨其作为骨髓基质细胞的支架载体构建骨组织工程的可行性。方法 :应用体外复合骨髓基质细胞培养法 ,通过倒置显微镜和MTT比色法 ,并对测量结果进行统计学分析 ,研究生物材料对骨髓基质细胞的形态、增殖的影响。结果 :两种材料对骨髓基质细胞形态均未见不良影响 ;NC在各培养时间对骨髓细胞增殖没有明显影响 (P >0 .0 5) ,DBM对骨髓细胞增殖均起促进作用 (P <0 .0 1)。结论 :两种材料均具有良好的细胞相容性 ,可以作为骨髓基质细胞的载体和骨组织工程支架     

一种细菌DNA提取方法的正交设计优化

目的通过正交实验优化异硫氰酸胍-硅胶提取细菌DNA的方法,以缩短其提取时间,进而缩短细菌特别是炭疽芽孢杆菌等恐怖细菌的核酸分子检测时间。方法以基因芯片的杂交信号值为指标,以异硫氰酸胍-硅胶提取DNA过程中的煮沸时间、室温放置时间、乙醇洗涤次数为考察因素通过正交实验法优化异硫氰酸胍-硅胶提取细菌DNA的条件。结果优化后的因素水平为煮沸10 min,室温放置15 min,乙醇洗涤2次。结论实验证明,优化后的提取时间比原来缩短了25 min,且信号值比原方法更高。     

荧光定量PCR测定支气管肺泡灌洗液中Tb DNA诊断肺结核的临床价值

目的探讨荧光定量PCR（FQ-PCR）技术测定支气管肺泡灌洗液中Tb DNA在肺结核诊断中的价值。方法对43例肺结核患者、63例非肺结核患者支气管肺泡灌洗液（BAFL）用FQ-PCR检测Tb DNA。结果荧光定量PCR检测BALF诊断肺结核的度=65．1％；特异度=98．4％；准确度=84．9％。结论荧光定量PCR方法检测BALF中Tb DNA诊断肺结核具有很好的敏感性、特异性，对肺结核的诊断有价值。     

脱钙骨基质与左旋聚乳酸/聚磷酸钙纤维对骨髓间充质干细胞黏附作用的比较

目的探讨左旋聚乳酸／聚磷酸钙纤维（PLLA／CPPf）与同种异体的脱钙骨基质（DBM）对BMSCs黏附作用的差异，为构建组织工程骨提供理想的支架材料。方法用扫描电镜观察两种支架材料的孔径；通过测吸水率比较其亲水性。将普通培养瓶培养的第3代BMSCs分别成骨诱导培养1周后，在体外分别与PLLA／CPPf和同种异体的DBM复合构建组织工程骨，于构建后10h计算细胞黏附率，并用扫描电镜观察比较两种支架材料对BMSCs黏附作用的差异。构建后每天在相差显微镜下观察BMSCs在两种支架材料上的生长情况，构建后第10天再行扫描电镜观察BMSCs在两种支架材料上的生长情况。结果DBM的孔径明显较PLLA／CPPf的大，孔隙率高，体外构建后10hDBM组的细胞黏附率为（91．3±8．2）％，PLLA/CPPf组为（82．2±7．7）％，两者之间差异具有统计学意义（P〈0．05）。DBM组于术后第3天网孔间出现细胞外基质，且随着时间的推移，基质变得稠密，而PLLA／CPPf的细胞外基质鲜见；第10天的扫描电镜也证实DBM组的细胞在支架材料上数量多，且细胞外的基质分泌较多。结论DBM较PLLA／CPPf更适于BMSCs的黏附生长，是理想的组织工程支架材料。     

10%中性缓冲福尔马林固定石蜡包埋DNA质量分析

目的 探讨经10%中性缓冲福尔马林固定的石蜡包埋淋巴结组织中DNA质量。方法 选择储存10年以内经10%中性缓冲福尔马林固定、固定时间6-24 h内的淋巴结活检标本,每年4例,提取DNA后检测DNA浓度及A260/A280比值,采用内参分子量标准对提取的DNA进行PCR扩增后行毛细管电泳DNA片段化分析。结果 10年间样本DNA浓度及A260/A280值无明显差异,而DNA片段长度有明显差异。结论 10%中性缓冲福尔马林固定石蜡包埋淋巴结组织储存5年之内的标本提取的DNA可用于目前大多数的基因检测平台,而储存5年以上的标本DNA片段化明显,不能满足检测要求。     

脂血和溶血对HBV DNA实时荧光定量PCR检测的影响

目的 探讨溶血和脂血两种因素对HBV DNA实时荧光定量PCR方法 的影响.方法 (1) 收集临床HBV DNA标本,按HBV DNA浓度分为Ⅰ水平、Ⅱ水平;收集HBV DNA阴性的重度乳糜状脂血标本和正常人标本.将以上标本按不同比例混合,制作成极高TG浓度不同HBV DNA水平:AⅠ、AⅡ组;高TG浓度不同HBV DNA水平:BⅠ、BⅡ组;正常TG浓度不同HBV DNA水平:CⅠ、CⅡ组.实时荧光定量PCR扩增.(2)收集临床HBV DNA标本,每人采集3份血标本,其中2份标本进行-20 ℃冷冻不同时间,制成重度溶血DⅠ、DⅡ组;中度溶血EⅠ、EⅡ组;无溶血对照组FⅠ、FⅡ组.实时荧光定量PCR扩增.(3)利用方差分析各检测结果 之间是否有统计学差异.结果 不同浓度脂血和溶血,对两种水平HBV DNA荧光定量PCR检测结果 均无统计学差异.结论 溶血和脂血对实时荧光定量PCR检测HBV DNA结果 无影响.     

Comparison of DNA extraction and amplification from ancient human bone and mummified soft tissue

South american precolumbian male mummies were employed as source material for a comparative investigation of bone and soft tissues by DNA analysis. The suitability of the DNA extracts from both sources was tested and evaluated by their effectiveness as target DNA in PCR amplifications. The results suggest that skeletal material should be given preference over soft tissues for PCR analysis if the material is severely degraded. This seems to be independent of the specific anatomical origin of the samples.     

T细胞斑点实验与结核杆菌DNA检测对肠结核的诊断价值

目的 探讨结核杆菌T细胞斑点实验（T-spot-TB）与结核杆菌DNA检测在肠结核诊断中的应用价值.方法 对2009年6月～2013年4月我科行T-spot-TB与结核杆菌DNA检测的可疑肠结核患者128例进行回顾性分析,其中确诊肠结核72例,非肠结核56例.对比分析两种方法诊断肠结核的灵敏度及特异度.结果 T-spot-TB诊断肠结核灵敏度为90.3％,特异性为91.1％;结核杆菌DNA检测灵敏度为73.6％,特异性为100.0％.T-spot-TB诊断肠结核灵敏度高于DNA检测,但其特异性低于DNA检测;两种方法检测阳性率在不同病理表现的肠结核患者中无显著差异.两种方法同时检测的阳性预测值及阴性预测值均为100％.结论 T-spot-TB与结核杆菌DNA联合检测有助于提高肠结核诊断的灵敏度和特异度.     

Comparison of DNA extraction methods for identification of human remains

After mass disasters, where the bodies of victims have been degraded, soft tissues are often completely lost, with the result that bones and teeth are all that remain for identification. The aim of this study was to investigate three DNA extraction methods that are currently used with degraded bones in forensic contexts: a silica-based extraction protocol used by the International Commission for Missing Persons (ICMP), a total demineralisation method used by the US Armed Forces DNA Identification Laboratory (AFDIL) and a standard organic DNA extraction method used by the Australian Federal Police (AFP). The methods were compared by real-time PCR quantitation and STR profiling. The silica and organic methods were not significantly different for either of these measures for bone but were both significantly more successful than the demineralisation method. Bovine serum albumin (BSA) was found to significantly improve the DNA yields from real-time PCR and the number of reportable alleles from STR typing, especially when using bone samples.     

优化配方的CPC/DBM/rhBMP-2复合材料在体内的超微结构和组织学特征

目的探讨磷酸钙骨水泥(CPC)/脱钙骨基质颗粒(DBM)/重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)复合材料在骨内的超微结构和组织学特征,评价该材料的成骨性能。方法预制兔DBM,按0.2的DBM质量比制作CPC/DBM/rhBMP-2复合材料。将复合材料(A组,n=12)、CPC(B组,n=10)、医用骨水泥(C组,n=7)分别植入兔股骨髁部骨缺损,在植入后第6、12、24周取材进行组织学和扫描电镜观察。结果术后第6周,A组中复合材料-骨界面模糊,宿骨发出纤维连续通过界面,编织骨样结构开始向材料内部长入。第12周,A组中血管和成骨细胞在复合材料内部生长,产生新骨。第24周,A组中骨缺损已修复,形成骨性连接,材料大部分被新骨替代。B组术后第6周CPC-骨界限清晰,未见新骨向材料内部长入,第24周骨缺损部位仍为CPC填充,材料内部未见新骨出现。C组材料直至第24周尚未与宿骨形成任何连接。A组材料在成骨细胞活性、血管化程度和新骨生长速度方面均优于B组。结论将DBM质量比为0.2的复合材料植入骨缺损内可以促进细胞、血管、新骨的长入,且易降解及被自体骨替代。     

第三代双源双能CT虚拟去钙骨髓成像在椎体成骨性骨转移瘤评价中的价值

目的 探讨第三代双源双能CT虚拟去钙骨髓成像（简称骨髓成像）用于评价椎体成骨性骨转移瘤的临床价值。 方法 回顾性分析2017年11月至2018年9月在山西医科大学第一医院就诊的48例骨外恶性肿瘤患者[男性27例、女性21例,年龄（62.4±10.5）岁]的椎体骨转移情况,所有患者同期均行双源双能CT成像与 99Tcm-亚甲基二膦酸盐（MDP）全身骨显像,以临床随访诊断或病理诊断结果为标准,比较 99Tcm-MDP全身骨显像、常规CT及骨髓成像3种方法在椎体成骨性骨转移瘤中的诊断价值。在骨髓成像图像上测量骨髓密度（CT值）,3种方法诊断椎体成骨性骨转移瘤的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确率的比较采用χ2检验,采用t检验比较椎体转移灶的骨髓CT值和正常椎体的骨髓CT值,采用受试者工作特征曲线分析骨髓CT值。 结果 48例患者共计598个椎体,确诊成骨性骨转移瘤的椎体135个。99Tcm-MDP全身骨显像诊断数为127个,常规CT诊断数为119个,骨髓成像诊断数为129个,骨髓成像诊断的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确率分别为95.56%、94.82%、84.31%、98.65%和94.98%。99Tcm-MDP全身骨显像、常规CT、骨髓成像的阴性预测值（98.17%、96.60%、98.65%）和准确率（92.81%、95.82%、94.98%）间的差异均无统计学意义（χ2=4.891、5.591,P=0.087、0.061）;99Tcm-MDP全身骨显像与骨髓成像的灵敏度（94.07% vs. 95.56%）、特异度（92.44% vs. 94.82%）及阳性预测值（78.40% vs. 84.31%）间的差异均无统计学意义（χ2=0.301、2.190、1.811,P=0.583、0.139、0.178）;病变椎体转移灶的骨髓密度较正常椎体的骨髓密度低[（−588.96±332.37） HU vs.（−55.03±75.62） HU],差异有统计学意义（t=31.906,P=0.000）。骨髓密度的曲线下面积为0.99,临界值为−119.6 HU（灵敏度和特异度分别为97.80%和96.50%）。 结论 第三代双源双能CT虚拟去钙骨髓成像可用于检测椎体成骨性骨转移瘤。     

MSP扩增中3种DNA提取法的比较

目的比较标准酚-氯仿、TripureDNA提取法、强碱法3种DNA提取法,研究哪种方法更简单方便,更适合做DNA甲基化特异性PCR（MSP）。方法分别用标准酚-氯仿、TripureDNA提取法、强碱法提取Jurkat细胞株中的DNA,并对3种方法提取的DNA含量、纯度及所需时间进行比较。结果3种方法提取DNA的纯度和完整性都较好,标准酚-氯仿法提取的DNA含量最低,且最费时;强碱法提取的DNA含量最高,并最省时。结论这3种DNA提取法提取的DNA都能够达到做MSP的要求,比较而言,强碱法更具优越性。     

耐多药结核病例不同年龄组耐药性分析

 目的 探讨耐多药结核(Multidrug resistance-TB,MDR-TB)病例不同年龄组的耐药状况,分析相关因素.方法 采用匡氏琼脂培养基法进行结核杆菌分离培养及药敏试验,筛选出107例耐多药性肺结核病例,按年龄分为青年组(20～39岁)、中年组(40～59岁)、老年组(＞60岁),分析其耐药种类及耐药形成原因.结果 原发性耐多药病例中,老年组比例最高(50.0%),其次为青年组(33.3%),中年组最低(16.7%);获得性耐多药病例中以青年组所占比例最大( 67.4%),中年组次之(24.2%),老年组占8.4%,青年组和中年组比例明显高于老年组(P＜0.01);不同年龄组耐多药种类相比差异无统计学意义(P＞0.05),且各个年龄组均以耐HRS和HRSE为主.耐药形成原因中,初治期间不规则用药和不满规定疗程自行停药共占72.6%,是MDR产生的主要原因.经统计学处理各个年龄组化疗情况比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 不同年龄组原发和获得性耐多药情况有所不同,建议重视不同年龄组的耐多药率的检测,合理化疗和贯彻全程督导治疗原则对于减少耐多药现象至关重要.     

结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗的免疫原性和治疗作用

目的 研究结核分枝杆菌Ag85A DNA 疫苗的免疫原性和治疗作用.方法 40只BALB/c小鼠随机分为4组,分别用生理盐水、pVAX1载体、微卡菌苗、Ag85A DNA 疫苗免疫,每2周肌内注射1次,共3次.研究 Ag85A DNA 疫苗的免疫原性.用结核分枝杆菌H37Rv通过尾静脉注射40只BALB/c小鼠,分别用生理盐水、pVAX1载体、利福平、Ag 85A DNA 疫苗治疗.治疗结束后2周杀鼠,观察肺和脾病理改变,称取重量、做菌落计数,用ELISPOT方法检测小鼠分泌γ干扰素(IFN-γ)的T淋巴细胞斑点数.结果 与其他组比较,Ag 85A DNA疫苗能诱导产生大量Ag85A特异的分泌IFN-γ 的T淋巴细胞(S=11.832,P=0.0080).肺组织病理显示:生理盐水组肺组织病变严重、广泛;载体组比生理盐水组病变略轻,但病变仍较重、广泛;Ag 85A DNA 疫苗组肺组织病变减轻、局限,3/5区域肺泡结构完整,清晰;利福平组肺组织无病变.与生理盐水组比较,Ag85A DNA 疫苗组和利福平组肺脏菌落数分别减少0.73 log和2.11 log;肝脏菌落数分别减少0.88 log和2.11 log(P<0.01).结论 Ag85A DNA 疫苗对小鼠结核病具有较好的治疗效果.     

应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌

目的 探讨应用多重PCR技术快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的可靠性.方法 根据结核分枝杆菌种的MTP40基因序列(396bp),分枝杆菌属的32kD基因序列(506bp),结核分枝杆菌复合体群的IS6110序列(984bp),采用3对特异性引物(PT1,T2;MT1,T2;IS5,S6)在同一反应体系和条件下对92株结核杆菌临床分离株和5株非结核分枝杆菌临床分离株进行扩增,并与标准菌株进行比较.结果 92株结核分枝杆菌临床分离株中,0株扩增出与结核分枝杆菌H37RV标准株相同的396bp、506bp、984bp 3条DNA片段,敏感性达97.8%,特异性为100%;5株非结核分枝杆菌临床分离株均扩增出506bp DNA片段,敏感性达100%,特异性为100%.结论 应用多重PCR方法,对结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌进行鉴定,结果快速、准确、可靠,为临床结核病与非结核分枝杆菌病的快速诊断提供了有效的手段,具有很好的临床应用价值.     

Comparison of two silica-based extraction methods for DNA isolation from bones

One of the most demanding DNA extractions is from bones and teeth due to the robustness of the material and the relatively low DNA content. The greatest challenge is due to the manifold nature of the material, which is defined by various factors, including age, storage, environmental conditions, and contamination with inhibitors. However, most published protocols do not distinguish between different types or qualities of bone material, but are described as being generally applicable. Our laboratory works with two different extraction methods based on silica membranes or the use of silica beads. We compared the amplification success of the two methods from bone samples with different qualities and in the presence of inhibitors. We found that the DNA extraction using the silica membrane method results an in higher DNA yield but also in a higher risk of co-extracting impurities, which can act as inhibitors. In contrast the silica beads method shows decreased co-extraction of inhibitors but also less DNA yield. Related to our own experiences it has to be considered that each bone material should be reviewed independently regarding the analysis and extraction method. Therefore, the most ambitious task is determining the quality of the bone material, which requires substantial experience.