类固醇受体辅活化子-3基因敲除小鼠的繁殖与鉴定

目的:繁殖并鉴定类固醇受体辅活化子(steroid receptor coactivator,SRC) - 3基因敲除(SRC - 3-/-)小鼠.方法:通过SRC - 3-/-雄性小鼠与杂合子(SRC - 3+/-)雌鼠杂交,繁殖出SRC - 3+/-及SRC - 3-/-两种基因型,提取每只小鼠尾部基因组DNA,用PCR 法进行鉴定,并进一步提取肝、脾组织总蛋白,采用Western blot进行蛋白表型鉴定.结果:成功繁殖并准确鉴定出更多数目的SRC - 3-/-小鼠.SRC - 3+/+小鼠脾组织SRC - 3蛋白表达水平显著高于肝组织,而SRC - 3-/-小鼠的肝、脾组织均未见SRC - 3蛋白表达. 结论:雄性基因敲除小鼠与雌性杂合子杂交是获取大量SRC - 3-/-小鼠的有效途径,PCR法是其子代简单准确的鉴定方法.     

CRH对大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

目的 研究促肾上腺皮质激素释放激素（eortieotropin-releasing hormone，CRH）对大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响。方法 灌洗提取大鼠腹腔巨噬细胞，加CRH培养1、2、4、8、16小时后加鸡红细胞，根据巨噬细胞吞噬鸡红细胞指数和吞噬率，评定CRH对大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响。结果 实验组各时相组吞噬率及吞噬指数与对照组比较均明显增高（P〈O．05），实验组各时间组之间比较，2小时组有一个吞噬高峰，吞噬率及吞噬指数均为最高数值。结论 CRH能明显提高大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力。     

烧伤后小鼠类固醇受体辅活化子的表达变化

目的 观察小鼠烧伤后早期类固醇受体辅活化子(SRC)蛋白表达的时相变化,初步探讨烧伤早期糖皮质激素抵抗的分子机制.方法 将30只健康C57/129雄性小鼠随机分为正常对照组与烧伤组,烧伤组给予背部TBSA 15%～20% Ⅲ°烧伤.分别于伤后1、6、12、24小时采用Western blot测定肝、脾组织SRC家族(SRC-1、GRIP-1、NCOA-3)蛋白表达水平的变化.结果 烧伤组肝组织SRC-1蛋白表达水平在烧伤后1小时即显著降低,6小时降至最低,以后逐渐恢复,至24小时与正常对照组相比无显著差异;正常脾组织SRC-1蛋白表达水平较低,测定结果无统计学意义.烧伤组肝组织GRIP-1、NCOA-3蛋白表达水平在烧伤后显著升高,12小时达到高峰,24小时仍显著高于正常对照组;烧伤组脾组织GRIP-1、NCOA-3在烧伤后1小时显著升高,GRIP-1在烧伤后6小时达到高峰,24小时与正常对照相比差异不显著;而NCOA-3在烧伤后12小时达到高峰,24小时显著高于正常对照组.结论 小鼠烧伤后早期SRC-1显著降低,GRIP-1、NCOA-3显著升高,烧伤后糖皮质激素抵抗的发生发展可能与SRC家族成员表达变化有关.     

大鼠严重胸部创伤肺泡巨噬细胞TLR4的表达及意义

目的观察大鼠严重胸部创伤后肺泡巨噬细胞TLR4基因及蛋白表达水平的变化,并探讨其意义。方法建立大鼠严重胸部创伤模型,支气管肺泡灌洗分离、培养肺泡巨噬细胞,利用Western、Northern分子生物学技术检测创伤前、创伤后2、4、8、16、24小时肺泡巨噬细胞TLR4的表达水平。结果利用小型多功能生物撞击机,以400kPa驱动压力对大鼠右侧上胸壁进行致伤,可建立稳定可靠并符合临床特点的严重胸部创伤动物模型;严重胸部创伤可上调TLR4在肺泡巨噬细胞内的表达,表达高峰在伤后8小时,伤后24小时恢复正常。结论TLR4的上调参与了创伤后失控性炎症反应的病理生理过程。本研究为创伤性急性肺损伤的发病机制提供了一定的实验及理论依据。     

腹腔穿刺引流对重症急性胰腺炎大鼠肠道TLR4表达的影响及意义

目的探讨早期腹腔穿刺引流(APD)对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肠道Toll样受体4(TLR4)表达的影响及意义。方法雄性SD大鼠随机分为假手术(Sham)组、SAP组和APD组,每组15只。采用5%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射法建立SAP大鼠模型,在此基础上于大鼠右下腹置入引流管建立APD模型。建模后24h采集血样、小肠和胰腺组织,HE染色观察小肠组织和胰腺组织的病理学变化,采用全自动生化仪检测血清淀粉酶和脂肪酶活性,鲎试剂法检测血清内毒素水平,紫外比色法检测血清二胺氧化酶(DAO)活性,ELISA法检测小肠组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平以及血清D-乳酸水平,TUNEL法检测肠黏膜上皮细胞凋亡情况,RT-PCR检测小肠组织TLR4 mRNA的表达水平,免疫组化和Western blotting检测TLR4信号通路关键分子和凋亡相关蛋白的表达。结果与SAP组比较,APD组大鼠小肠和胰腺组织病理损伤明显减轻,病理评分明显降低(P<0.05),血清淀粉酶、脂肪酶和DAO活性以及TNF-α、IL-6、D-乳酸和内毒素水平也明显降低(P<0.05)。...     

骨髓间充质干细胞对大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体mRNA和蛋白表达的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对肺泡巨噬细胞Toll 样受体(toll-like receptor,TLR2/4)基因和蛋白的影响,为探讨骨髓MSCs移植对早期炎症介质的影响及炎症级联反应的调控机制做铺垫。 方法 巨噬细胞分为PBS对照组、骨髓MSCs对照组、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对照组和LPS+骨髓MSCs处理组,各组均取1,3,6,12 h时相点。流式细胞仪检测骨髓MSCs表面标记阳性细胞率和巨噬细胞TLR2/4蛋白的表达;RT-PCR方法检测各组不同时相点巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达变化;ELISA法检测各组不同时相点上清液中TNF-α浓度变化。 结果 与PBS对照组、骨髓MSCs对照组比较,LPS对照组巨噬细胞TLR2/4mRNA和蛋白表达明显升高(P＜0.01),1h时开始增高,12h时达到峰值;同时TNF-α浓度也明显增高(P＜0.01),6h时TNF-α浓度达到峰值。与LPS对照组比较,LPS+ MSCs组巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达降低(P＜0.01),TNF-α浓度也降低(P＜0.01)。 结论 LPS刺激后巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达升高,TNF-α浓度也升高,后者峰值时间出现略早,说明TLR2/4表达与TNF-α之间存在一个正反馈环;骨髓MSCs可以明显降低LPS刺激后巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达及TNF-α浓度,说明骨髓MSCs打破了上述正反馈环。     

5-羟色胺对小鼠腹腔巨噬细胞的辐射防护作用

本实验以定量细胞化学的方法对种⁶⁰Coy射线8Gy全身-次照射后第6天小鼠腹腔巨噬细胞的变化和5-羟色胺(5-HT)的辐射防护作用进行了观察.发现照射后第6天巨噬细胞吞噬消化鸡红细胞的能力明显低于对照组(P相似文献   

Tim-3对巨噬细胞功能的调节作用研究

目的探讨Tim-3对巨噬细胞功能的调节作用及其机制。方法通过RNA干扰降低Tim-3在巨噬细胞表面的表达,构建一种稳定低表达Tim-3的RAW264.7巨噬细胞系;以野生型及低表达Tim-3的巨噬细胞为研究对象,探讨Tim-3对巨噬细胞活性及表型的影响。结果将含Tim-3 siRNA及NC对照序列的载体经脂质体分别转染细胞系RAW264.7,以G418加压筛选,获得低表达Tim-3的巨噬细胞稳定株。功能实验显示,激活Tim-3通路促进了巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6。同时发现Tim-3通路可以影响CD80/CD86共刺激分子在巨噬细胞表面的表达,并进而影响巨噬细胞的抗原呈递功能,促进Th1、Th17细胞的极化。结论成功构建了重组载体Tim3 siRNA,建立了稳定低表达Tim-3的巨噬细胞系,初步研究结果提示Tim-3信号通路在促进TNF-α、IL-6分泌及调节巨噬细胞共刺激分子表达,促进Th1、Th17细胞分化中发挥重要作用。     

热暴露环境对实验大鼠腹腔巨噬细胞表面C_3b受体的影响

单核—巨噬细胞表面并存着Fc受体和C_3b受体,它们在巨噬细胞识别、结合、吞噬抗原颗粒和传递信息,保持机体自身稳定及免疫监护等起着十分重要的作用。目前,热暴露对实验大鼠生理、生化等指标变化已有文献报道,但对巨噬细胞表面C_3b受体有何影响文献报道甚少,本文采用朱云凤方法,对91只SD大鼠分组于热暴露前,后不同时间条件处理组的腹腔巨噬细胞表面C_3b受体花环进行了观察,以了解热暴露对机体巨噬细胞免疫功能的影响程度,现报告如下:     

急性胰腺炎Toll样受体4 mRNA表达与腹腔细菌感染机制的研究

急性胰腺炎（Acute pancreatisis,AP）是21世纪胰腺外科面临的一大难题,重型急性胰腺炎（Sever acute pancreatisis,SAP）合并感染者的病死率可高达25％。最近的研究表明：胰腺坏死组织的细菌感染是SAP死亡的主要原因。     

高迁移率族蛋白B1对小鼠腹腔巨噬细胞免疫活性的影响

目的 观察高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对离体小鼠腹腔巨噬细胞免疫活性的影响及其意义.方法 分离小鼠腹腔巨噬细胞,经不同浓度(1、10、100、1 000ng/ml)的HMGB1刺激,以未加HMGB1的培养细胞为对照组,于不同时间点(6、12、24、48、72h)观察巨噬细胞摄取中性红能力,噻唑蓝法测定其对L1210细胞的杀伤作用,应用Transwell小室趋化装置观察趋化活性变化,并采用流式细胞术检测细胞表面I-Ak抗原表达的变化.结果 1、10、100ng/ml的HMGB1可使巨噬细胞的吞噬功能、杀伤活性、趋化活性及抗原呈递能力明显提高,其中100ng/ml时的作用最强,与对照组比较差异显著(P＜0.01);100ng/ml的HMGB1刺激48h后,对细胞吞噬功能、杀伤活性及趋化活性的影响达高峰(P＜0.01).结论 一定浓度的HMGB1可增强巨噬细胞的免疫功能.     

低水平X射线照射对巨噬细胞吞噬消化功能的影响

本实验观察了不同剂量（０，５０，７５，１５０ｍＧｙ和２，４Ｇｙ）Ｘ射线单次全身照射昆明系小鼠后腹腔巨噬细胞（ＭΦ）对鸡红细胞（ＣＲＢＣ）吞噬消化功能的影响。其结果表明：５０和７５ｍＧｙ照射后３和５天巨噬细胞对ＣＲＢＣ的吞噬功能有非常明显增加（Ｐ＜０．０１），７５ｍＧｙ照射后巨噬细胞其消化功能也非常显著（Ｐ＜０．０１），而２和４Ｇｙ照射后其吞噬和消化功能降低。提示，低剂量辐射能够刺激机体非特异性免疫功能，大剂量照射使之受抑制。     

转铁蛋白受体1表达在弗朗西斯菌入侵巨噬细胞中的作用

目的 评估土拉弗朗西斯菌LVS感染鼠巨噬细胞期间获取铁的影响因素.方法 用表达绿色荧光蛋白(GFP)的土拉弗朗西斯菌LVS感染鼠巨噬细胞J774A.1.结合单抗的转铁蛋白受体-1用键合了Alexa594的羊抗鼠二抗显色.用实时定量PCR法检测5个铁代谢相关基凶在土拉弗朗西斯菌LVS感染或未感染J774A.1鼠巨噬细胞中的表达.用活的弗朗西斯菌和灭活菌分别感染巨噬细胞,免疫印迹分析比较Tfr1表达水平.用小十扰RNA下调转铁蛋白受体-1的表达,进而用土拉弗朗西斯菌LVS分别感染转铁蛋白受体-1表达下调的细胞和转染无关siRNA的细胞,并进行细菌计数.结果 土拉弗朗西斯菌疫苗株可以诱导转铁蛋白受体-1在宿主巨噬细胞中表达.基因表达分析显示土拉弗朗西斯菌LVS随着时间的增加通过诱导转铁蛋白受体1(Tfr1)~.节蛋白(Irp1和IRP2)主动获取铁.免疫印迹结果表明小干扰RNA对转铁蛋白受体-1的表达下调了大约75%.细菌入侵试验显示,在感染1h时,转铁蛋白受体-1表达下调的细胞内细菌数量等同于对照(F=1.06,P=0.326 5);而在感染24h时,Tfr1下调样本中的细菌数量明显低于对照样本(F=24.12,P=0.000 6).结论 在感染早期Tfr1的上调是由翻译后调节介导的,并随着Irp1和IRP2表达的增加而增加.Tfr1表达的增加通过转铁蛋白介导的铁运输扩充了细胞内动态铁池,使弗朗西斯菌易于获取铁.转铁蛋白受体-1的下调不影响细菌与其他膜蛋白的结合而入侵,但抑制细菌在细胞内的增殖.     

大鼠严重创伤后腹腔巨噬细胞Toll样受体2/4基因表达及受体反应性

目的 观察大鼠创伤后腹腔巨噬细胞Toll样受体(TLR)2/4基因表达及受体反应性变化.方法 建立大鼠严重创伤(右侧胸部撞击伤复合双侧股骨闭合性骨折)模型,分别于创伤后2、6、12、24小时取腹腔巨噬细胞,以逆转录-聚合酶联反应(RT-PcR)测定TLR2/4的mRNA表达,以脂多糖(LPS)、Pam3CSK4刺激后取细胞上清液测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平.结果 创伤后2小时腹腔巨噬细胞TLR2、TLR4的mRNA表达较正常对照组降低(P<0.05),直至创伤后24小时.行不同浓度LPS、PandCSK4刺激后细胞上清液TNF-α水平较对照组降低(P<0.01).结论 严重创伤后腹腔巨噬细胞TLR2/4基因表达降低,受体反应性下降.     

人Toll样受体4基因5’远端增强子样区定位及反式作用因子鉴定

目的 对人Toll样受体4(TLR4)基因5′远端增强子样区进行定位,并鉴定参与其转录调控的反式作用因子.方法 采用PCR克隆方法,将TLR4基因5′旁侧-1337～-683序列及其缺失片段与荧光索酶报告基因载体pGL-3-promoter进行重组,构建pGL-3 -1337～- 683-promoter重组质粒及其系列缺失质粒.将构建成功的质粒转染人人白血病K562细胞,检测各质粒的荧光素酶活性,根据缺失序列对荧光素酶活性的影响来确定TLR4基因5′远端增强子样区的位置.采用转录因子数据库检索和电泳迁移率实验(EMSA)两种方法对TLR4基因5′远端增强子样区反式作用因子进行鉴定.结果 TLR4基因5′远端增强子样区位于-923 ～-679的245bp范围内,并再细化为-923 ～ -742和-721 ～-679两个功能单元.EMSA和转录因子数据库检索证实激活蛋白-1(AP1)是与-721 ～-679功能单元结合的转录因子,淋巴增强因子-1(LEF-1)可能是与该功能单元结合的另一个转录因子.结论 TLR4基因5′远端增强子样区中的一个功能单元定位在-721～ -679的43bp片段中,AP1是与该区域结合的反式作用因子,可能与LEF-1共同起到转录增强作用.     

脓毒症大鼠肝脏组织Toll样受体4和髓样分化蛋白-2基因表达的变化规律

目的探讨脓毒疗人鼠肝脏组织内毒素复合受体—Toll样受体4（TLR4）／髓样分化蛋白-2（MD-2）mRNA的表达变化，研究其与肝脏组织肿瘤坏死因子-α（TNF—α）mRNA表达的父系。方法腹腔注射内毒素（LPS）5mg／kg制作大鼠脓毒症模型。动物分为正常对照组（20只）及内毒素注射后1h、2h、6h组（各20只）．检测肝脏组织TLR4／MD-2以及TNF-α mRNA的表达。结果LPS注射后1h，TLR4／MD-2及TNF-α mRNA表达开始升高并达高峰．伤后2～6h逐渐下降，各时间点的表达量均显著高于对照组（P〈0．01）．TLR4与MD-2 mRNA的表达呈明显正相关（P〈0．05）．且分别与TNF—α mRNA的表达呈显著正相关（P〈0．05）。结论LPS可迅速上调肝脏组织TLR4／MD-2的基闪表达并诱导早期炎症细胞因子TNF-α的基因表达。脓毒症时TLR4识别LPS是可能以TLR4／MD-2复合体的形式完成的．且在识别过程中MD-2是TLR4必需的作用分子。     

术后疼痛大鼠切口组织Toll样受体4及其下游细胞因子表达的变化

目的 探讨术后疼痛大鼠切口组织Toll样受体4(TLR4)及其下游细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达的变化. 方法 健康成年雄性SD大鼠74只,体重200～250 g,建立大鼠术后疼痛模型.于术前1d、术后0.5,1,2,6,12h及1,2,3,5,7d测定术侧与非术侧机械缩足反射阈值(PMWT);于术前1d、术后2,8h、1,2,3,5,7d采用荧光定量PCR法检测皮肤切口组织TLR4、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表达. 结果 与术前比较,大鼠术侧术后0.5 h～5 dPMWT降低,术后2h术侧切口组织TLR4mRNA表达下调,之后逐渐升高,IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA于术后2,8h、1,2,3,5d表达上调(P＜0.05),非术侧PMWT差异无统计学意义(P＞0.05);术侧PMWT术后6h最低,之后逐渐升高,术侧切口组织TLR4mRNA术后2d表达水平最高,IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA分别于术后2h、1d、3d表达水平最高(P＜0.05).TLR4、IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达水平与术侧PMWT呈负相关(r=-0.501,-0.743,-0.893,-0.657,P＜0.05),IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA与TLR4 mRNA表达水平呈正相关(r =0.764,0.283,0.667,P＜0.05). 结论 术后疼痛大鼠切口组织TLR4及其下游炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达上调,该变化可能参与了术后疼痛的产生和维持.