过表达miR-130a-3p对心肌细胞肥大的缓解作用研究

本研究旨在探索miR-130a-3p对心肌细胞肥大的作用及其可能机制。通过胸主动脉缩窄法(TAC)构建压力超负荷所致心肌肥厚小鼠模型。使用去甲肾上腺素(NE)刺激SD乳鼠原代心肌细胞(NRCMs)及H9c2大鼠心肌细胞系,诱导这两种心肌细胞发生肥大表型转变。检测miR-130a-3p的表达变化,并进一步探索其对心肌细胞肥大是否有调控作用。结果表明,miR-130a-3p在肥厚心肌组织、肥大NRCMs及H9c2细胞中的表达均明显降低。给予miR-130a-3p mimics使其过表达后,H9c2细胞中肥大标志基因心房利钠肽(ANP)、脑利钠肽(BNP)和肌球蛋白重链β(β-MHC)的表达较对照组(mimics N.C.+NE组)明显下调,且细胞面积明显减小。而给予miR-130a-3p inhibitor抑制其表达后,肥大心肌细胞中ANP、BNP、β-MHC的表达进一步上升,且细胞面积进一步增加。Western blot检测发现,过表达miR-130a-3p后心肌细胞中磷酸化Akt和磷酸化mTOR的表达水平下调。以上结果提示,miR-130a-3p mimics可缓解心肌细胞肥大的程度;其inhibitor则可使心肌细胞肥大进一步加剧。过表达miR-130a-3p可能通过影响Akt通路来缓解H9c2心肌细胞肥大的程度。     

微小RNA-199a-5p通过靶向SIRT1促进心肌纤维化相关基因表达

目的:研究微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)对心肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达的调控作用及其可能作用的靶基因。方法:原代分离并体外培养成体C57BL/6小鼠心肌成纤维细胞;双萤光素酶报告基因实验检测miR-199a-5p与潜在靶基因沉默信息调节因子1(SIRT1)3’端非翻译区(3’-UTR)的结合作用;实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和Western blot法分别检测SIRT1以及纤维化标志物胶原蛋白(Col)1a1、Col3a1和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA和蛋白表达。结果:在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的小鼠心肌成纤维细胞中,Col1a1、Col3a1和α-SMA的表达增强,miR-199a-5p表达上调。在心肌成纤维细胞中过表达miR-199a-5p可以增强Col1a1、Col3a1和α-SMA的表达。双萤光素酶报告基因实验显示miR-199a-5p与SIRT1 3’-UTR有结合作用。RT-q PCR和Western blot结果证实miR-199a-5p可在转录水平抑制SIRT1表达。过表达miR-199a-5p和沉默SIRT1均能一致性促进心肌成纤维细胞中Col1a1、Col3a1和α-SMA的表达。抑制AngⅡ诱导的小鼠心肌成纤维细胞中NF-κB激活,可显著降低miR-199a-5p表达。结论:SIRT1是miR-199a-5p的作用靶基因,并介导miR-199a-5p促进纤维化标志物Col1a1、Col3a1和α-SMA的表达。     

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4在大鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞中的表达

目的 ：探讨超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)在大鼠体内和体外心肌成纤维细胞、心肌细胞中的表达分布及其增龄变化。方法 ：SD大鼠分为新生组（1～3 d），成年组（17个月）和老年组（22个月），每组8只，其中4只用于冰冻切片，另4只用于PCR；取新生SD大鼠心，酶消化法分离培养原代心肌成纤维细胞和原代心肌细胞。用免疫荧光、免疫组织化学检测原代心肌成纤维细胞和原代心肌细胞HCN4的表达；免疫印迹、实时荧光定量PCR检测原代心肌成纤维细胞HCN4的表达，用实时荧光定量PCR检测不同月龄大鼠心肌组织HCN4的表达。结果 ：体外细胞培养显示，成纤维细胞和原代心肌细胞中均表达HCN4。组织切片显示，新生、成年和老年大鼠心肌成纤维细胞和部分心肌细胞表达HCN4。P1～P4代成纤维细胞的免疫印迹和实时荧光定量PCR结果显示HCN4随着成纤维细胞代次增加，表达量逐渐降低；不同月龄大鼠左心室的实时荧光定量PCR结果显示随着大鼠月龄增加，HCN4的表达量逐渐降低，其结果与培养的细胞表达一致。结论 ：HCN4在心肌成纤维细胞和部分心肌细胞中表达。随增龄变化，心肌细胞和成纤维细胞HCN4的表达量逐...     

核内miR-199b-5p通过上调CDK9表达促进心肌细胞肥大

目的:研究核内微小RNA-199b-5p(miR-199b-5p)对心肌细胞肥大的调控作用及其机制.方法:利用RT-qPCR检测健康人与心衰患者心肌组织中miR-199b-5p的表达水平.通过核质分离及RT-qPCR技术确定miR-199b-5p在人心肌AC16细胞中的核质分布.原代分离培养C57BL/6乳小鼠心室肌细...     

大鼠心肌细胞缺氧后miR-133a-3p的表达及其下游靶基因预测

目的检测大鼠心肌细胞缺氧后微小RNA(miRNA,miR)-133a-3p的表达,并预测其潜在靶基因和进行初步验证。方法分离培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,给予缺氧(37℃,5%CO_2,1%O_2)0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h,采用qRT-PCR检测其在上述不同时间点的miRNA-133a-3p的表达水平,运用miRanda、pic Tar和terget Scan等靶基因预测分析软件及其他生物信息学方法,筛选miR-133a-3p潜在调控的靶基因,并对关键候选基因采用qRT-PCR和Western blot进行初步验证。结果大鼠心肌细胞中miRNA-133a-3p的表达在缺氧4 h出现高表达,与其他缺氧时间比较差异有统计学意义(P=0.000);4 h后,其表达逐渐下降,12 h后趋于稳定;生物信息学预测发现miRNA-133a-3p的靶基因可能为TGF-β1;荧光定量检测发现在4 h时TGF-β1的表达较0 h、24 h的差异都有统计学意义(P0.05);且4 h时心肌细胞TGF-β1蛋白的表达较0 h组和24 h组都明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 miRNA-133a-3p可能参与大鼠心肌细胞的缺氧坏死过程,并且可能通过调控TGF-β1而发挥作用。     

大鼠肝脏发育成熟及癌变时miR-100的表达

目的：探讨microRNA-100(miR-100)在大鼠肝脏发育成熟和癌变时的表达。方法取新生SD乳鼠、成年SD大鼠肝组织以及经连续喂饲2-乙酰氨基芴加部分肝切除术(2-AAF/PH)诱导的SD大鼠肝癌组织,分别采用实时荧光定量PCR及FISH技术检测miR-100的表达。结果同新生SD乳鼠相比,miR-100在成年SD大鼠肝组织中表达明显升高( P<0．05)。大鼠肝脏癌变组织的miR-100表达较成年大鼠肝组织明显下降( P<0．05),接近于新生SD乳鼠miR-100的表达水平。结论 miR-100可作为SD大鼠肝脏发育成熟的标志,其表达降低可能与肿瘤形成有关。     

CircSERPINE2靶向miR-23a-3p调控类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制北大核心CSCD

目的：探讨CircSERPINE2对类风湿关节炎（RA）滑膜成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的影响及分子机制。方法：选取于武汉市第四医院就诊的44例RA患者和健康体检者的外周血，培养滑膜成纤维细胞（FLSs）和RA滑膜成纤维细胞（RA-FLSs），采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测CircSERPINE2和miR-23a-3p表达水平；将RA-FLSs随机分为NC组、pcDNACircSERPINE2组、pcDNA组、anti-miR-23a-3p组、anti-miR-NC组、miR-23a-3p+pcDNA-CircSERPINE2组、miR-NC+pcDNA-CircSERPINE2组；CCK-8检测细胞活性；Transwell检测细胞迁移数和侵袭数；双荧光素酶报告实验检测CircSERPINE2和miR-23a-3p的靶向关系。结果：RA患者外周血中CircSERPINE2表达水平低于健康体检者，而miR-23a-3p表达水平高于健康体检者（P<0.05）。与FLSs比较，RA-FLSs中CircSERPINE2表达水平降低，而miR-23a-3p表达水平升高（P<0.05）。过表达CircSERPINE2或抑制miR-23a-3p表达，细胞活性降低，迁移和侵袭细胞数减少（P<0.05）。CircSERPINE2靶向调控miR-23a-3p。miR-23a-3p过表达可逆转CircSERPINE2过表达对RA-FLSs的影响。结论：CircSERPINE2过表达可通过靶向调控miR-23a-3p抑制RA滑膜成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭。     

微小RNA-199a-5p调控大鼠心肌细胞肥大的研究*

 目的：探讨微小RNA-199a-5p（miR-199a-5p）在心肌肥大模型中的表达及对大鼠心肌细胞肥大的调控作用。方法：用腹主动脉缩窄术（TAAC）构建心肌肥大大鼠模型,体外培养新生Sprague-Dawley大鼠心肌细胞,用血管紧张素II(Ang II)诱导心肌细胞肥大,荧光定量PCR (qRT-PCR)检测动物血浆和心肌细胞miR-199a-5p含量;合成大鼠miR-199a-5p的拟似物（mimic）和抑制剂（inhibitor）,用脂质体转染mimic和inhibitor进入心肌细胞,用qRT-PCR检测肥大基因心房钠尿因子和β-肌球蛋白重链mRNA的表达变化;用氚标亮氨酸掺入量检测细胞蛋白合成速率变化;用细胞荧光染色法检测细胞表面积变化。结果：TAAC 术后28 d,大鼠血浆miR-199a-5p的含量较对照组显著增加 (P<0.05),在Ang II诱导肥大的心肌细胞中,miR-199a-5p的表达量也较对照组显著增加。在心肌细胞中过表达miR-199a-5p,能使细胞肥大基因表达增加,蛋白合成速率加快,细胞表面积增大,而使用inhibitor阻遏miR-199a-5p的作用后,能抑制Ang II诱导的肥大基因表达、细胞蛋白合成速率和细胞表面积的变化。结论:心肌肥大动物和细胞模型中miR-199a-5p的表达发生上调。过表达miR-199a-5p能促进体外培养的心肌细胞肥大,而阻遏miR-199a-5p的作用能抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大。     

心脏成纤维细胞释放的IL-6在阿霉素致SD乳鼠心肌细胞损伤中的作用研究

目的:探讨阿霉素/多柔比星(doxorubicin,DOX)刺激后,SD乳鼠心脏组织中白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)的细胞来源,并初步探讨IL-6在DOX引起SD乳鼠心肌损伤中发挥的作用及机制。方法:原代培养SD乳鼠的心脏成纤维细胞和心肌细胞,CCK-8法检测DOX对心脏成纤维细胞和心肌细胞的毒性;ELISA检测心脏成纤维细胞和心肌细胞上清中炎症因子IL-6含量;鬼笔环肽染色观察心肌细胞骨架F-肌动蛋白的改变;Transwell小室共培养SD乳鼠成纤维细胞和心肌细胞,进行如下分组:心肌细胞对照组、DOX处理心肌细胞组、共培养细胞对照组和DOX处理共培养细胞组,Western blot检测各组心肌细胞心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、脑钠尿肽(brain natriuretic peptide,BNP)和肌球蛋白重链7(myosin heavy chain 7,MYH7)的蛋白水平;使用IL-6抗体后,进行如下分组:共培养细胞对照组、DOX处理共培养细胞组、IL-6处理共培养细胞对照组和DOX+IL-6处理共培养细胞组,Western blot检测共培养组中心肌细胞ANP和MYH7的蛋白水平。结果:(1)与对照组比较,DOX显著抑制乳鼠心脏成纤维细胞增殖,亦可导致心肌细胞损伤(P0.01);(2)DOX刺激48 h后,心脏成纤维细胞释放IL-6显著增加(P0.01),而心肌细胞释放IL-6与对照组相比,无显著差异(P0.05);(3)DOX刺激的心脏成纤维细胞条件培养液作用于心肌细胞后,心肌细胞骨架蛋白肌丝排列出现紊乱、断裂;(4)DOX刺激后,共培养组心肌细胞ANP、BNP和MYH7的蛋白水平增加,与单独心肌细胞组相比,具有统计学意义(P0.01);(5)共培养组加入IL-6抗体后,再给予DOX刺激,其ANP和MYH7的表达均显著下降(P0.05)。结论:DOX刺激原代细胞培养的SD乳鼠心脏成纤维细胞分泌产生大量的IL-6,而后通过旁分泌引起心肌细胞骨架蛋白改变、促进心肌细胞肥大,进而导致心肌损伤。     

视黄醇结合蛋白1通过激活TAK1促进大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大

目的：探究视黄醇结合蛋白1(retinol binding protein 1, Rbp1)在大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大中的功能和机制。方法：本研究通过联合分析基因表达数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）中的小鼠心肌肥厚基因芯片数据，寻找在心肌肥厚发生过程中的关键调控因子，构建该基因过表达及敲减腺病毒并感染大鼠乳鼠原代心肌细胞，利用血管紧张素II(angiotensin II, Ang II)诱导大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大模型，研究目的基因对大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大的影响，应用Western blot及RT-qPCR探究目的基因调控大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大的分子机制。结果：在小鼠心肌肥厚心脏组织中Rbp1的表达显著上调（P<0.01），体外细胞实验显示与对照组相比，Rbp1过表达组的大鼠乳鼠原代心肌细胞面积显著增大，心肌肥厚标志基因心钠肽（atrial natriuretic peptide, Anp）和肌球蛋白重链7(myosin heavy chain 7, Myh7)的表达显著升高（P<0.01），证实Rbp1过表达能促进Ang II诱导的大...     

β-肾上腺素受体介导成纤维细胞旁分泌IL-6促进心脏miR-21表达

目的:探讨β-肾上腺素受体(β-adrenergic receptor,β-AR)激动剂异丙基肾上腺素(isoproterenol,ISO)促进心脏微小RNA-21(miR-21)表达的调控机制。方法:采用酶消化法分离原代乳小鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞,分别给予ISO(10μmol/L)处理1、6、12、24和48 h,采用real-time PCR法检测细胞miR-21表达水平,采用Western blot法检测细胞p-STAT3和STAT3的蛋白水平,采用ELISA法检测细胞上清中白细胞介素6 (IL-6)的浓度。给予细胞转染含miR-21启动子区萤光素酶报告基因质粒p GL3-21PPR,采用萤光素酶报告基因实验检测条件培养液对miR-21的转录活性的影响。结果:以ISO作用于心脏成纤维细胞产生的培养液上清作为条件培养液,其可使心肌细胞miR-21的表达量随ISO作用于成纤维细胞时间的延长而逐渐增高(P 0.05);该条件培养液可引起心肌细胞miR-21的转录活性显著增加,其中ISO作用24 h和48 h的培养液分别使其转录活性增加94.9%和77.1%(P 0.01);ISO作用成纤维细胞形成的条件培养液中IL-6浓度显著增加,通过旁分泌作用于心肌细胞,引起转录因子STAT3活性增强,促进了miR-21的转录和表达。结论:激动β-AR可介导成纤维细胞合成和表达IL-6,旁分泌作用于心肌细胞,通过IL-6/STAT3途径,上调心脏miR-21表达水平,参与心脏重构。     

大鼠心肌细胞和心肌细胞系H9C2表达弹性蛋白

目的 检测弹性蛋白在大鼠心肌细胞和H9C2心肌细胞系内的表达。 方法 取新生和成年SD大鼠各5例的新鲜心脏，冷冻切片；取20只新生3 d SD大鼠心脏，通过0.05%胰蛋白酶和0.075%Ⅱ型胶原酶消化法，获取原代心肌细胞；免疫组织化学和免疫荧光技术检测大鼠心肌组织、原代心肌细胞和H9C2心肌细胞系的弹性蛋白表达;ELISA法检测培养的H9C2心肌细胞系上清中的弹性蛋白。 结果 在大鼠心肌细胞、H9C2心肌细胞系和新生、成年大鼠心肌组织上均发现心肌肌钙蛋白T和弹性蛋白的共表达。免疫组织化学结果发现，弹性蛋白在成纤维细胞、平滑肌细胞和细胞间质内均有表达。H9C2心肌细胞培养液的上清中检测到少量的弹性蛋白。 结论 大鼠心肌细胞表达弹性蛋白，可能参与心肌细胞的势能和细胞间质弹性纤维的构建。     

HSF1基因缺失通过上调microRNA-195a-3p加速压力超负荷下心脏重构

目的:探讨热休克转录因子1(HSF1)调控微小RNA-195a-3p (miR-195a-3p)对心肌微血管内皮细胞血管新生功能的影响,旨在阐明HSF1基因缺失加重压力超负荷下心脏重构的病理分子机制。方法:压力超负荷动物模型采用小鼠主动脉弓缩窄(TAC),辅以心脏超声功能评价。在体实验分组为HSF1基因敲除(HSF1~(-/-))小鼠假手术组、C57BL/6野生型(WT)小鼠假手术组、HSF1~(-/-)小鼠TAC模型组和C57BL/6 WT小鼠TAC组;细胞实验分组为对照组、miR-195a-3p模拟物干预组和阴性对照microRNA(miR-NC)干预组。TAC术后4周,通过病理组织切片检测各组小鼠心肌肥厚(HE染色)和血管新生(CD31染色),小鼠心超检查心脏主要功能指标变化;通过生物信息软件TargetScan 6.2结合萤光素酶(luciferase)报告基因检测,以及Western blot验证,测定miR-195a-3p调控血管新生的下游分子靶点;并用miR-195a-3p诱导微血管内皮细胞,观察其对细胞成管能力的影响。结果:HSF1缺失会导致TAC诱导的小鼠左心室重构加重。芯片筛查结果表明HSF1缺失可促进心脏12种microRNAs表达上调,5种microRNAs在心肌微血管内皮细胞中表达显著升高,其中miR-195a-3p的增高具有统计学显著性。miR-195a-3p过表达可以有效抑制微血管内皮细胞CD31和血管内皮生长因子(VEGF)的表达,阻滞细胞形成管腔样结构。TargetScan 6.2预测miR-195a-3p的靶点为AMP活化蛋白激酶α2(AMPKα2),在微血管内皮细胞用miR-195a-3p模拟物干预可以有效抑制AMPKα2的表达,同时miR-195a-3p模拟物也抑制了CD31和VEGF的表达。结论:HSF1基因缺失导致的miR-195a-3p表达上调是加速压力超负荷下心脏重构的重要诱因,其机制可能是通过抑制AMPKα2介导的血管新生信号通路的激活。     

miR-139-3p在低氧诱导凋亡的心肌细胞中的表达及其作用研究

目的:探讨微小RNA-139-3p(miR-139-3p)在低氧诱导的原代心肌细胞凋亡模型中的表达及其意义。方法:在正常和低氧条件下,采用RT-qPCR检测乳大鼠原代心肌细胞miR-139-3p的表达水平;进一步将miR-139-3p抑制剂和miR-139-3p抑制剂阴性对照转染到心肌细胞后,将细胞置于37℃密闭的缺氧盒中(95%N_2和5%CO_2)培养12 h,采用流式细胞术和Western blot法检测细胞凋亡情况。结果:低氧培养12 h后,与正常培养组(n=3)比较,低氧组(n=3)心肌细胞中的miR-139-3p相对表达量显著上调(P0.05)。低氧组心肌细胞凋亡率也显著升高(P0.05)。与miR-139-3p抑制剂阴性对照组(n=3)比较,miR-139-3p抑制剂组(n=3)的心肌细胞凋亡率显著降低(P0.05)。结论:miR-139-3p在低氧诱导的原代心肌细胞凋亡模型中表达上调。抑制miR-139-3p的表达能降低低氧诱导的心肌细胞凋亡。     

小鼠恶性黑色素移植瘤模型的建立及其淋巴管内皮细胞透明质酸受体1的表达

目的:建立小鼠皮肤恶性黑色素移植瘤模型,探讨小鼠皮肤恶性黑色素移植瘤组织内淋巴管的生成情况。方法:体外培养B16瘤细胞,接种B16瘤细胞于C57BL/6小鼠右侧背部皮内,构建C57BL/6小鼠皮肤恶性黑色素移植瘤模型;应用H-E染色、淋巴管内皮细胞透明质酸受体1(1ymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1, LYVE-1)免疫组化染色确认模型和观察肿瘤组织内淋巴管的生成情况。结果:建立了恶性黑色素移植瘤模型;LY- VE-1主要着色于正常组织和移植瘤组织中淋巴管内皮细胞的细胞膜上;恶性黑色素瘤组织中淋巴管密度明显高于正常皮肤组织。结论:构建C57BL/6小鼠皮肤恶性黑色素移植瘤模型是获得恶性黑色素瘤组织和进一步研究的有效手段;LYVE-1是特异性较高的淋巴管内皮标记物;小鼠皮肤恶性黑色素移植瘤组织中可能存在淋巴管的新生。     

人微小RNA-16（miR-16）重组腺病毒的制备和鉴定

目的制备人微小RNA-16（miR-16）重组腺病毒,研究其在人骨髓间充质干细胞（hMSCs）中的表达及对细胞周期素依赖蛋白激酶6（CDK6）表达的影响。方法从人基因组DNA中扩增miR-16前体的DNA,定向插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV。将经PmeⅠ线性化的重组穿梭载体pAdTrack-CMV-miR-16与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化感受态大肠杆菌BJ5183,在细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒rAdTrack-miR-16。将经PacⅠ线性化的rAdTrack-miR-16在人胚肾293细胞（HEK293）中包装并扩增出miR-16的重组腺病毒rAd-miR-16。将重组腺病毒感染hMSCs,分别检测miR-16前体和miR-16靶基因CDK6的表达。结果 pAdTrack-CMV-miR-16构建正确,在HEK293细胞中成功包装并扩增出重组腺病毒rAd-miR-16。rAd-miR-16感染的hMSCs中miR-16前体水平显著升高（P〈0.05）,CDK6mRNA的表达降低不明显,CDK6蛋白表达水平显著降低（P〈0.01）。结论成功制备了表达人miR-16的重组腺病毒,并能有效介导miR-16在hMSCs中的表达,为进行miR-16的功能研究创造了条件。     

Long-term expression of a retrovirally introduced β-galactosidase gene in rodent cells implanted in vivo using biodegradable polymer meshes

Grafts of various types of cells have been performed using bioresorbable polymer matrices. These synthetic fibers are degraded by hydrolysis into normal metabolic intermediates and induce a number of events that are conducive to healing and/or repair, the most important of which may be angiogenesis. The use of biodegradable meshes to deliver genetically altered cells was studied. A -galactosidase gene was inserted into Long-Evans rat bone marrow stromal (BMS) cells or fibroblasts derived from C57BL/6J mouse embryos using the retroviral vector LNL-SLXgal. Expression was monitored using X-gal staining. X-gal⁺ cells from monolayer cultures were seeded onto either polyglycolic acid (PGA) or polyglactin (PGL) biodegradable meshes and grown to confluence. Two types of grafts were performed: (1) embryonic C57BL/6J mouse fibroblasts (EMF) into either nude mice or adult C57BL/6J mice, and (2) Long-Evans rat BMS into Long-Evans rats. -Galactosidase activity was found for up to 152 days for EMF in nude mice, 123 days for EMF in adult C57BL/6J mice, and 90 days for grafts of syngeneic BMS cells into Long-Evans rats. Noninfected cells grafted using the same methods did not stain with X-gal.