弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白基因的序列分析及其在大肠埃希菌中的表达

目的?摇分析弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白7（dense granule protein,GRA7)基因的异同及在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白。 方法 从弓形虫不同分离株（RH株、ZS2株和GT株）的基因组中特异地扩增出GRA7基因，将目的基因定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，转化大肠埃希菌JM109并测序。利用互联网上的在线工具CLUSTALW进行序列分析。异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（IPTG）体外诱导pGEX-4T-1/GRA7重组质粒菌的表达，对表达的目的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），分别以抗抗谷胱甘肽巯基转移酶（GST）抗体、人抗弓形虫阳性血清为一抗进行Western blotting分析。以纯化的重组蛋白作为包被抗原，ELISA 法检测抗弓形虫阴性、阳性血清。 结果 弓形虫不同分离株GRA7的基因序列相同；pGEX-4T-1/GRA7重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白，Western blotting分析表明该蛋白为GST融合蛋白，且能被人抗弓形虫阳性血清所识别；ELISA结果表明该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清特异结合，而与抗弓形虫阴性血清无反应。 结论 弓形虫不同分离株GRA7基因具有高度保守性；GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达，且该重组蛋白具有一定免疫反应性。     

弓形虫SAG1可溶性融合蛋白在大肠埃希菌中的表达及纯化

目的在大肠埃希菌中高效表达及纯化弓形虫SAG1抗原,为研制新型弓形虫病基因工程诊断试剂盒奠定基础. 方法将重组pGEX-SAG1表达载体转化大肠埃希菌BL21-Codon Plus（DE3）-RP菌株,在异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导下表达融合蛋白,并通过SDS-PAGE凝胶电泳分析表达产物的表达形式.通过降低培养温度和升高LB培养基的pH,诱导融合蛋白在上清中表达,表达产物以硫酸铵沉淀、GST亲和层析和Sephadex G-150凝胶过滤层析进行纯化.Western blot检测纯化融合蛋白的免疫反应性. 结果 37 ℃条件下,SAG1以融合蛋白（SAG1-GST）的形式在大肠埃希菌中高效表达,表达蛋白以包涵体形式存在.在27 ℃和升高LB培养基pH条件下,融合蛋白在上清中得到表达,经纯化后其SAG1可溶性蛋白纯度可达90%以上.Western blot分析纯化蛋白能被弓形虫感染者血清所识别.结论 SAG1可溶性蛋白在大肠埃希菌中得到了表达,经纯化后能被弓形虫感染者血清所识别,可用于制备弓形虫感染诊断试剂盒.     

刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA7基因的重组、表达及鉴定

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)基因重组质粒并在大肠埃希菌中进行表达。方法根据GRA7基因序列设计合成引物,用PCR方法从弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因片段,再克隆到pGEX-4T载体中,重组质粒经酶切、PCR鉴定并测序;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析并纯化,Western blot分析其反应原性。结果 GRA7基因PCR产物大小约为714bp,与预期相符;重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合;重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的GRA7融合蛋白分子质量单位约为53ku,该蛋白可被His标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫GRA7基因,表达蛋白具有反应原性,为弓形虫诊断抗原试剂盒的制备奠定了基础。     

弓形虫SAG1可溶性融合蛋白在大肠埃希菌中的表达及纯化

目的在大肠埃希菌中高效表达及纯化弓形虫SAG1抗原,为研制新型弓形虫病基因工程诊断试剂盒奠定基础。方法将重组pGEX-SAG1表达载体转化大肠埃希菌BL21-Codon Plus(DE3)-RP菌株,在异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导下表达融合蛋白,并通过SDS-PAGE凝胶电泳分析表达产物的表达形式。通过降低培养温度和升高LB培养基的pH,诱导融合蛋白在上清中表达,表达产物以硫酸铵沉淀、GST亲和层析和Sephadex G-150凝胶过滤层析进行纯化。Western blot检测纯化融合蛋白的免疫反应性。结果37℃条件下,SAG1以融合蛋白(SAG1-GST)的形式在大肠埃希菌中高效表达,表达蛋白以包涵体形式存在。在27℃和升高LB培养基pH条件下,融合蛋白在上清中得到表达,经纯化后其SAG1可溶性蛋白纯度可达90%以上。Western blot分析纯化蛋白能被弓形虫感染者血清所识别。结论SAG1可溶性蛋白在大肠埃希菌中得到了表达,经纯化后能被弓形虫感染者血清所识别,可用于制备弓形虫感染诊断试剂盒。     

弓形虫致密颗粒蛋白4的原核细胞表达与纯化

目的 构建弓形虫致密颗粒蛋白4（GRA4）的pET原核细胞表达系统，并对其表达产物进行纯化及其免疫学活性测定。 方法 利用PCR扩增弓形虫GRA4基因片段，定向亚克隆入原核细胞表达载体pET-23a（+），转化大肠埃希菌（E.coli BL21 DE3），以组氨酸结合柱亲和层析法纯化表达产物，并对其进行抗原活性分析。将纯化的重组蛋白免疫小鼠，用ELISA检测其特异性抗体滴度。 结果 成功构建了弓形虫pET-GRA4原核细胞表达系统，其表达产物相对分子质量（Mr）约为 40 000，主要以包涵体形式存在，纯化后的重组蛋白能被人工感染弓形虫RH株速殖子的兔血清识别。免疫小鼠后可诱导产生高滴度的特异性IgG抗体。 结论 利用pET原核细胞表达系统成功表达和纯化了弓形虫GRA4重组蛋白，该蛋白具有一定的免疫学活性。     

弓形虫致密颗粒蛋白基因的表达及其重组蛋白免疫反应性的评价

目的 将克隆入pGEX-4T-1的致密颗粒蛋白基因进行表达并对表达产物的免疫反应性进行评价。方法 将重组表达质粒pGEX-4T-1／GRA7转入大肠埃希菌BL21，经IPTG诱导进行SDS变性蛋白质电泳，分别以Anti-GSTAn-tibody、免抗弓形虫阳性血清和人抗弓形虫阳性血清为一抗进行Western Blot分析。用GSTrap FF HiTrap affinity columns纯化重组蛋白，以此蛋白作为包被抗原，BLISA法检测抗弓形虫阴性、阳性血清。结果 SDS变性蛋白质电泳显示在43KDa～66KDa蛋白条带之间有特异蛋白的表达，蛋白分子量大小与理论值相符。Western Blot分析表明该重组蛋白为GST融合蛋白，且该蛋白能被人抗弓形虫阳性血清、免抗弓形虫阳性血清所识别。ELISA结果表明该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、免抗弓形虫阳性血清特异结合，而与抗弓形虫阴性血清无反应。结论 弓形虫致密颗粒蛋白基因在大肠埃希菌中得到表达；该重组蛋白具有良好的免疫反应性。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA8截短型片段在原核中的表达

目的 构建弓形虫GRA8原核重组表达质粒，分析其表达状况。 方法 采用PCR技术扩增GRA8及其截短型片段的基因序列，经克隆后，亚克隆至原核表达载体中，构建GRA8及其截短型片段的重组表达质粒，分析GRA8的表达；将各重组菌进行诱导，将裂解上清用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯化目的蛋白，免疫印迹法(Western blotting)分析纯化蛋白的活性。 结果 GRA8基因被正确插入原核表达质粒中，原核重组表达质粒在大肠埃希菌JM109中表达GRA8的水平低，几乎无完整GRA8的表达，截短型GRA8经谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-PAGE获得纯化。纯化的截短型GRA8能被弓形虫感染兔血清识别。 结论 GRA8的原核重组表达质粒表达GRA8的水平低，纯化的截短型GRA8具一定的抗原反应性。     

刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA2全基因的原核重组表达

目的克隆弓形虫RH株致密颗粒蛋白2（GRA2）的全长基因,在大肠埃希菌工程菌中重组表达GST—His—GRA2融合蛋白。方法提取弓形虫总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增GRA2基因全长,与pET-41Ek／LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠埃希菌Rosetta^TM（DE3）pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白,然后采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白产物。结果PCR鉴定弓形虫GRA2全基因重组表达质粒构建正确;诱导表达的GST—His—GRA2融合重组蛋白分子质量单位为52ku,与预测值相符。结论本研究成功构建了弓形虫GRA2全基因重组蛋白质粒,该质粒能表达GRA2蛋白,为研究GRA2与宿主细胞的相互作用奠定了基础。     

弓形虫GRA4基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增弓形虫RH株致密颗粒蛋白4（GRA4）基因，构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-GRA4，重组耻垢分枝杆菌，鉴定重组蛋白的抗原性。方法用聚合酶链式反应（PCR）方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因，克隆入pGEM-T载体，然后亚克隆法构建ps3000-GRA4大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒，经电转化方法，将GRA4基因片断的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis mc^2155）中，用重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠，Western blot方法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体。结果成功扩增了弓形虫的GRA4基因并构建克隆质粒pGEMT-GRA4、穿梭质粒ps3000-GRA4，Western blot分析显示，GRA4重组蛋白能被重组质粒免疫小鼠血清识别，分子质量单位约为40．0ku。结论重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内表达出了重组蛋白GRA4，具有抗原性，刺激小鼠机体产生了抗弓形虫的抗体，为弓形虫重组BCG（Bacillus Calmette-Guerin）疫苗的研究奠定了基础。     

弓形虫昆山分离株P30蛋白的纯化、复性和鉴定

目的表达并纯化弓形虫昆山分离株膜蛋白P30。方法将构建的pET28b-P30重组质粒转入大肠埃希菌BL21,挑重组菌于LB培养基中增菌,IPTG诱导其表达,然后纯化包涵体,用尿素溶解包涵体,Ni2 螯合柱纯化产物,以透析法复性蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果大肠埃希菌表达的P30蛋白以包涵体的形式存在,P30蛋白经Ni2 螯合柱纯化后纯度大于95%。经Western blot鉴定,复性蛋白能被弓形虫感染的鼠血清识别。结论得到了纯度高的膜蛋白P30。     

弓形虫GRA6抗原基因的克隆与表达

目的在大肠杆菌中高效表达弓形虫抗原GRA6。方法采用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫昆山分离株和RH株总DNA中分别扩增到编码GRA6的基因，经DNA序列分析后导入表达载体。PGEX-5X-3。然后在大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-RP中进行表达，以SDS-PAGE和Westen blotting进行鉴定，用GST亲和层析柱纯化表达产物。结果1．在我们所比较的336个碱基中，弓形虫昆山分离株与RH株之间碱基基本一致。2．得到一分子量为49kDa的融合蛋白。占大肠杆菌总蛋白的25．55％，通过Westen blotting证实，该重组抗原能被弓形虫感染的人特异性IgM和IgG血清所识别。结论1．弓形虫昆山分离株和RH株的GRA6基因片段几乎完全一致；2．在大肠杆菌中得到了高效表达的融合蛋白；3．该重组抗原能被弓形虫感染的人特异性IgM和IgG血清所别．可用于构建具有高度敏感性和特异性的弓形虫病检测试剂盒．     

截短的弓形虫P30基因在E.coli中的高效表达及纯化条件的探索

目的：构建能在E.coli中高效表达的弓形虫主要表面抗原（P30）基因的重组表达质粒,并对纯化条件进行优化。方法：对已知的弓形虫P30基因序列进行部分取舍,用PCR技术从弓形虫ZS1株的基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段,插入载体pET－30(a）中,转化大肠杆蓖DH5α,IPTG诱导表达,包涵体经洗涤、变性、复性及不同程度的浓缩后,进行SDS－PAGE及免疫印迹分析。结果：从弓形虫ZS1株基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段,成功构建重组表达质料粒pET－P30;SDS－PAGE显示蛋白表达带的分子量约为31kD,表达量占菌体总蛋白的31.58％,经1M及2M尿素洗涤后,其纯度分别达63.42％及75.7%;免疫印迹显示,该纯蛋白能被弓形虫病人阳性血清所识别,产而且当浓缩至初始体积的1／3－1／6时,纯化蛋白与DNA免疫鼠血清的反应最强。结论： 成功构建重组质粒pET-P30,并以融合蛋白的形式进行了高效表达,经变 性、复性后,该蛋白具有特异的免疫反应性,为弓形虫诊断试剂盒的研制打下基础。     

弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因。方法 根据GRA4基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,插入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌JM109,经PCR、双酶切、测序验证后,将GRA4基因片段定向亚克隆到载体pGEX-4T-2中构建原核表达重组质粒pGEX-4T-2.GRA4,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE及Westem blot分析。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组GRA4蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pGEX-4T-2-GRA4重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。     

弓形虫缓殖子期特异性抗原1基因的克隆、表达及对重组抗原的免疫反应性分析

目的 克隆与表达弓形虫缓殖子期特异性抗原1(BAG1)的基因,并分析重组抗原的免疫反应性。方法 诱导体外培养的弓形虫RH株速殖子向缓殖子转化,用RT-PCR法从缓殖子期弓形虫扩增BAG1基因片段,进行序列分析;构建表达重组质粒pET32a(+)-BAG1,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达;表达蛋白经次氨基三乙酸镍(Ni-NTA)琼脂糖亲和层析纯化后,蛋白质印迹(Western blotting)分析与ELISA分析其免疫反应性。 结果 从缓殖子期弓形虫克隆的BAG1基因长690 bp,构建的重组质粒pET32a(+)-BAG1经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组BAG1。Western blotting分析显示纯化的重组BAG1(SAG1)能被弓形虫慢性感染血清识别。ELISA结果表明重组BAG1抗原检测350份人血清弓形虫IgG抗体的阳性率为17.4％,显著高于重组SAG1抗原的阳性率12.6％（P＜0.05）。 结论 原核表达的重组BAG1抗原具有特异的免疫反应性。     

细粒棘球蚴铁蛋白基因的克隆重组高效表达及免疫学初步研究

目的构建细粒棘球蚴（Echinococcus granulosusEg）铁蛋白（ferritin）基因的原核表达重组质粒并表达、纯化该重组蛋白，初步研究其免疫反应。方法将细粒棘球蚴铁蛋白基因亚克隆于表达载体pGEX-6p-1，转化重组体到大肠杆菌B121中，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达；用SD争PAGE和Western—blot对表达产物进行初步鉴定，用切胶纯化的融合蛋白免疫BALB／c小鼠，通过Western-blot对该蛋白的免疫学特性进行初步研究。结果重组铁蛋白与GST以融合表达的形式在细菌中高效表达，表达产物为不可溶性的包涵体，蛋白分子量约为42kD。融合蛋白Egferritin／GST能被细粒棘球蚴免疫的家兔血清和特异性小鼠抗血清所识别，同时特异性小鼠抗血清可识别天然抗原囊液、原头蚴可溶性蛋白中约19kD的蛋白条带。结论成功地表达细粒棘球蚴重组铁蛋白，并且该蛋白有一定的免疫原性及抗原性。