hIFN-β基因重组腺病毒载体的构建

目的构建hIFN—β基因的腺病毒载体，为探索hIFN—β在肿瘤基因治疗中的作用作准备。方法从健康人外周血中提取出基因组DNA，pyrobest Taq酶PCR法扩增出hIFN—β基因片段。将目的基因克隆入中间载体pMD-18T载体，经蓝白筛选和PCR筛选后测序证实序列无误。酶切目的基因并将之克隆入穿梭载体pAdTrack—CMV中，将新形成的pAdTrack—CMV—hIFN—β用限制性内切酶Pme Ⅰ线性化，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌株BJ5183细胞中。卡那霉素及酶切筛选出重组子pAd—hIFN-β，内切酶pacⅠ再次将重组子线性化，脂质体转染细胞株HEK293。借助GFP的表达可以在转染的2—3天观察到包装病毒Ad—hIFN—β产生，7—10天出现病毒斑。结果经PCR法及酶切证实各中间过程载体，且最终的包装病毒中携带有目的基因hIFN—β。结论大肠杆菌内同源重组法能有效和较为方便的构建出含有目的基因的腺病毒载体Ad—hIFN—β，重组子能够在HEK293细胞中扩增，病毒包装的成功为进一步研究hIFN—β基因治疗肿瘤提供了一个良好的转导载体。     

丙型肝炎病毒NS3基因酵母表达载体构建及表达

目的　为探讨丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3的功能 ,在真核生物酵母细胞中表达HCVNS3基因。方法　用聚合酶链反应 (PCR)的方法以HCV全长质粒pBRTM/HCV 1为模板扩增HCVNS3基因 ,克隆到 pGEM T载体中 ,双酶切后回收连接到酵母表达质粒 pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质 ,进行十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和Western免疫印迹分析。结果　成功构建HCVNS3基因酵母表达载体 ,Western免疫印迹显示了HCVNS3在酵母细胞中表达。表达产物在胞内存在 ,相对分子质量为 70 0 0 0。结论　HCVNS3蛋白在酵母中表达成功。     

人Rob04基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建人Rob04（hRob04）基因的重组腺病毒表达载体,为研究Rob04的功能和作用机制以及Rob04的基因治疗奠定基础。方法采用DNA重组与细菌内同源重组技术,通过PCR方法以hRob04的表达质粒为模板扩增得到hRob04的编码序列,克隆到穿梭质粒pDC316-hRob04中,经测序验证后,将骨架质粒（pBHGlox_E1）和穿梭质粒共转染到HEK293细胞中,同源重组产生重组腺病毒;包装收获病毒颗粒;PCR鉴定该重组腺病毒是否携带目的基因。结果PCR及限制性内切酶酶切鉴定表明成功构建携带人Rob04基因的腺病毒载体。结论运用同源重组技术能够构建携带人Rob04基因的重组腺病毒载体。     

人腺病毒3型六邻体基因的克隆与鉴定

目的 克隆人腺病毒3型(Ad3)六邻体-L1(Hexon-L1)、六邻体-L2(Hexon-L2)区基因，构建含有该基因的重组质粒，并进行测序鉴定，为进一步构建表达载体，制备基因工程疫苗打下基础。方法 从Ad3感染的HeLa细胞中提取Ad3DNA，用PCR方法扩增Hexon—L1、Hexon-L2基因，将得到的片段定向克隆到克隆载体pUC19质粒中，对克隆片段进行DNA测序鉴定。结果 构建了重组质粒pUC19Hexon，测序结果与Genebank中该序列进行同源性比较证明克隆的片段为。Ad3六邻体序列。结论 成功克隆了Ad3的Hexon-L1、Hexon-L2区基因。     

人QKI6基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞中的表达鉴定

目的:构建人RNA结合蛋白（QKI6）基因的重组腺病毒载体,并在心肌细胞中表达。方法:利用PCR技术,从原始质粒中扩增出QKI6目的基因片段,酶切后连接到pShuttle-GFP-CMV重组穿梭质粒上。再将pShuttle-GFP-QKI6 转移到pAdxsi载体上,得到带有QKI6目的基因及GFP荧光指针的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6。酶切、PCR鉴定重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6,并完成扩增与纯化。经Pacl线性化后,转染HEK 293细胞进行腺病毒包装,并测定病毒的滴度及目的基因的表达。以包装好的重组腺病毒感染大鼠新生心肌细胞,通过GFP表达观察病毒感染效率。用PCR检测目的基因QKI6在感染的心肌细胞中的表达。结果:含QKI6基因及GFP荧光指针的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6构建成功,酶切、PCR鉴定及DNA测序证实了其正确性。重组腺病毒可重复感染HEK 293细胞,荧光显微镜下可见GFP表达,且QKI6基因的表达明显升高。包装的重组腺病毒可有效感染新生心肌细胞,并表达目的基因QKI6。结论:成功地构建QKI6基因重组腺病毒载体,以其感染293细胞及新生心肌细胞后,可有效地表达QKI6基因,为进一步研究QKI6基因在糖尿病心肌细胞凋亡的机制以及在糖尿病性心肌病治疗中的应用奠定实验基础。     

人BMP2及VEGF双基因共表达腺病毒穿梭质粒的构建及鉴定

目的 构建人骨形态发生蛋白2（BMP2）与血管内皮生长因子（VEGF）双基因腺病毒穿梭质粒。方法 对pCU-CAGGS-hVEGF165的目的基因亚克隆并引入新的酶切位点,定向连入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,将质粒pcDNA3．1-BMP2及pIRES酶切后,将BMP2和IRES片段定向连入pShuttle-CMV-hVEGF165,构建可同时表达两个目的基因重组质粒pShuttle-CMV-hBMP2-IRES-hVEGF165,进行酶切分析及序列测定。结果 酶切分析及核酸序列测定证实重组质粒构建正确。结论 成功构建了BMP2及VEGF双基因腺病毒穿梭质粒;为联合基因治疗骨缺损的研究奠定了基础。     

大鼠微小RNA-22腺病毒载体的构建和鉴定

目的构建并鉴定大鼠miR-22腺病毒载体,制备具有一定滴度含miR-22基因的重组腺病毒,为后期研究miR-22在心肌缺血再灌注损伤中的作用及分子机制奠定基础。方法化学合成目的基因序列(含酶切位点),对目的基因进行PCR扩增、酶切,酶切后的目的基因与酶切后的GV202载体连接产生miR-22腺病毒表达载体,将连接好的产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞获得大量阳性克隆,对阳性克隆进行酶切鉴定及测序鉴定。利用脂质体2000试剂,让成功构建的miR-22重组腺病毒载体和腺病毒包装质粒共转染人胚肾293细胞,得到重组腺病毒,完成重组腺病毒扩增、纯化及滴度测定。结果成功构建了大鼠miR-22腺病毒载体。经重组腺病毒扩增、纯化及滴度测定,最终获得的重组腺病毒滴度为1×109 PFU/ml。结论成功构建制备获得了具有一定滴度含miR-22基因的重组腺病毒,为后期顺利开展有关miR-22在心肌缺血再灌注损伤中的作用及分子机制研究提供了可能。     

Effect of HCV infection on expression of several cancer-associated gene products in HCC

AIM:To study hepatocarcinogenesis of hepatitis C virus (HCV).METHODS: Expression of HCV antigens (CP10, NS3 and NS5) and several cancer-associated gene products (ras p21, c-myc, c-erbB-2, mutated p53 and p16 protein) in the tissues of hepatocellular carcinoma (HCC, n = 46) and its surrounding liver tissue were studied by the ABC(avidin-biotin complex) immunohistochemical method. The effect of HCV infection on expression of those gene products in HCC was analyzed by comparing HCV antigen positive group with HCV antigen negative group.RESULTS:Positive immunostaining with one, two or three HCV antigens was found in 20 (43.5%) cases,with either of two or three HCV antigens in 16 (34.8%) cases, and with three HCV antigens in 9 (19.6%) cases.Deletion rate of p16 protein expression in HCC with positive HCV antigen (80%, 16/20)was significantly higher than that in HCC with negative HCV antigen. Whereas no significant difference of the other gene product expression was observed between the two groups.CONCLUSION:HCV appears related to about one third of cases of HCC in Chongqing, the southwest of China, and it may be involved in hepatocarcinogenesis by inhibi ting the function of p16 gene, which acts as a negative regulator of cell cycle.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因4剪切体Ns5atp4a基因原核表达载体的构建和表达

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因4剪切体（NS5ATP4A）的原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增NS5ATP4A基因,克隆入pET32a（＋）质粒,构建pET32a（＋）-NS5ATP4A表达重组体,转化DH5α和BL21菌,经IPTG诱导。SDS-PAGE分析,Western Blot验证蛋白带。结果成功构建大肠杆菌原核表达载体。经IPTG诱导,得到了目的蛋白分子量为35kD,用Western Blot证实其具有良好的抗原性。结论构建原核表达载体pET32a（＋）-NS5ATP4A,为抗原的制备及临床检测奠定了基础。     

Prokaryotical expression of structural and non-structural proteins of hepatitis G virus

AIM To study the epitope distribution of hepatitis G virus(HGV) and to seek for the potential recombinant antigensfor the development of HGV diagnositic reagents.METHODS Fourteen clones encompassing HGV genefragments from core to NS3 and NS5 were constructedusing prokaryotic expression vector pRSET and (or)pGEX,and expressed in E.coli.Western blotting andELISA were used to detect the immunoreactivity of theserecombinant proteins.RESULTS One clone with HGV fragment from core to E1(G1),one from E2 (G31),three from NS3 (G6,G61,G7),one from NS5B (G821) and one chimeric fragment fromNS3and NS5B (G61-821) could be expressed well andshowed obvious immunoreactivity by Western blotting.One clone with HGV framment from NSSB (G82) was alsowell expressed,but could not show immunoreactivity byWestern blotting.No obvious expression was found in theother six clones.All the expressed recombinant proteinswere in inclusion body form,except the protein G61 whichcould be expressed in soluble form.Further purifiedrecombinant proteins G1,G31,G61,G821 and G61-821were detected in indirected ELISA as coating antigenrespectively.Only recombinant G1 could still showimmunoreactivity,and the other four recombinantproteins failed to react to the HGV antibody positive sera.Western blotting results indicated that the immunoactivityof these four recombinant proteins were lost duringpurification.CONCLUSION Core to E1,E2,NS3 and NS5 fragment ofHGV contain antigenic epitopes,which could be producedin prokaryotically expressed recombinant proteins.Ahigh-yield recombinant protein (G1) located in HGV coreto E1 could remain its epitope after purification,whichshowed the potential that G1 could be used as a coatingantigen to develop an ELISA kit for HGV specific antibodydiagnosis.     

抗污染RT-PCR检测HCV RNA的研究

目的研究与解决ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ过程中常见的产物污染问题．方法以稀释的含ｄＵＴＰ的ＰＣＲ产物加入ＲＴＰＣＲ反应的不同阶段以模拟ＰＣＲ产物污染，再采用尿苷酶以清除污染的ＰＣＲ产物分子．结果在检测ＨＣＶＲＮＡ的套式ＰＣＲ反应中，假阳性结果主要是由于ＰＣＲ终产物在实验过程中的任何阶段污染所引起，但污染的模板分子仅在第２次ＰＣＲ反应时扩增．将ＨＣＶＲＮＡ套式ＰＣＲ检测试剂盒中的第２次ＰＣＲ反应液中加入一定量的ｄＵＴＰ，可使反应终产物核酸分子上含有ｄＵＴＰ．此后，在每进行第２次ＰＣＲ反应前，均在每３０μｌ反应体系中加入尿苷酶１Ｕ，３７℃消化１ｈ，然后９４℃１０ｍｉｎ灭活尿苷酶，即可降解其中含ｄＵＴＰ的污染核酸分子．结论此法能消除同一实验室内套式ＰＣＲ终产物的污染，防止假阳性结果的出现．     

HBV微环DNA重组质粒的构建及初步药效学实验

目的 构建HBV的治疗性微环质粒并进行体内外实验研究. 方法 采用聚合酶链式反应扩增HBV包膜蛋白preS2.S抗原基因和hIL-2-IFNγ融合基因,将2个基因分别克隆于ZY781载体,得到亲本质粒preS2.S/ZY781和hIL-2-IFNγ/ZY781,测序正确后,用阿拉伯糖诱导生成微环质粒pMCS2.S和pMCIIF. 转染微环质粒于COS-7细胞株,用酶联免疫吸附法定量法检测24、48、72 h时目的蛋白的表达情况.双质粒联合在体电脉冲注射BALB/c小鼠,4周后处死小鼠,检测特异性的体液和细胞免疫应答. 结果 微环质粒pMCS2.S和pMCIIF转染COS-7细胞后,目的蛋白HBsAg、白细胞介素-2、干扰素 γ在不同时间均有表达,在48 h达峰值,分别为(60.3±7.8)、(17.7±1.9)、(10.3±0.9) ng/ml. 微环质粒pMCS2.S能诱导小鼠产生HBsAb的抗体保护,佐剂pMCIIF可显著增强其免疫效果,在低剂量5μg/只就能诱导较强特异性细胞和体液免疫. 结论 成功构建了HBV微环质粒pMCS2.S及其佐剂微环质粒pMCIIF,其有较好的体内外活性.