The culture of primary cardiac cells

目的:探讨SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离及培养方法,并进行形态学观察.方法:取出生1～3d的SD大鼠的乳鼠,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,差速贴壁法分离心肌细胞,并加入适量BrdU纯化心肌细胞,显微镜下观察心肌细胞形态及纯度,结果:成功分离培养心肌细胞并观察其形态,计算存活率92％,纯度90％,2～3d出现同步搏动.结论:胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化可分离存活率较高的心肌细胞,用差速贴壁法并加入适量BrdU可纯化心肌细胞,使细胞搏动良好.     

新生大鼠心肌细胞的分离与培养

目的:建立一种简单实用的新生大鼠心肌细胞分离与培养的方法。方法:用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶和分散酶消化心室肌组织,用差速贴壁法纯化心肌细胞进行培养。用台盼蓝染色法检测细胞存活率,倒置显微镜下观察细胞形态变化和细胞搏动频率。结果:从第3天开始,大部分心肌细胞出现搏动,存活率均在96%以上。培养3d的心肌细胞搏动频率较小,到第6天搏动频率达到高峰,随后几天趋于稳定。结论:应用此方法培养的心肌细胞纯度高,存活时间长,是一种稳定、可靠的新生大鼠心肌细胞的培养方法。     

小鼠乳鼠心肌细胞的原代培养

目的:观察原代培养的小鼠乳鼠心肌细胞的形态特征。方法:Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶消化心脏组织,差速贴壁分离法。结果:12 h心肌细胞基本贴壁,第2天可长成单层,第3~4天细胞伸出伪足相互接触交织成网,逐渐形成细胞簇或细胞单层,搏动呈同步性,收缩明显有力,搏动频率为30~120次/min。结论:用Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶分离培养小鼠乳鼠心肌细胞可获得形态、活力良好的心肌细胞。     

SD乳鼠原代心肌细胞培养方法的改进

目的:探讨SD乳鼠原代心肌细胞最佳分离、纯化及培养方法,以提供可靠的心肌细胞模型。方法:用含0.1%的胰蛋白酶及0.1%Ⅱ型胶原酶的酶混合液分离乳鼠心脏组织,并用差速贴壁分离法和5-溴脱氧尿核苷抑制法进行纯化,用台盼蓝染色法检测细胞的存活率,倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化,免疫组织化学染色方法检测心肌细胞的纯度。结果:台盼蓝染色观察细胞存活率达(96.9±8.9)%以上。显微镜下心肌细胞由圆形渐变为梭形、多边形,逐渐形成细胞簇,搏动频率约120～150次/min。用抗横纹肌肌动蛋白单克隆抗体鉴定心肌细胞,阳性率为(90.5±1.6)%。结论:本方法所获SD乳鼠的心肌原代细胞纯度高、活力强。     

新生大鼠心肌细胞原代培养方法

目的探讨乳鼠心肌细胞的原代培养方法,更好地获取高存活率、高搏动率及高纯度的心肌细胞,以建立良好的原代心肌细胞研究模型。方法无菌状态下取出生3 d以内Wistar乳鼠心室肌,以混合消化酶（0.06%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶均量混合液）反复进行短时间多次消化,用差速贴壁法纯化心肌细胞,并加入5-溴脱氧尿嘧啶抑制非心肌细胞分裂增殖,2 d后首次换液,以后隔日换液。结果心肌细胞24 h左右已基本贴壁,并可见单个细胞搏动,2～6 d形成单层心肌细胞和其细胞簇的同步搏动,经培养所获细胞搏动良好,存活率高,免疫组化鉴定显示培养的心肌细胞纯度95%以上。结论该方法是一种较为理想的乳鼠原代心肌细胞培养方法,值得进一步推广。     

新生大鼠心肌细胞的原代培养方法的探讨

目的 改进心肌细胞的原代培养方法,提高心肌细胞收获率和存活率。方法 使用Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶分次消化心脏组织,差速贴壁分离法和化学试剂抑制法纯化心肌细胞。结果 8h后少数细胞出现自发性搏动;24h心肌细胞几乎全部贴壁,第1-3天形成细胞簇或细胞单层,心肌细胞收缩明显而有力。结论 胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶配合使用可以分离获得形态、活力良好的心肌细胞。     

新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良

目的:探讨更为简便的新生大鼠心肌细胞原代培养的方法,使分离的心肌细胞达到理想的数量、存活率和纯度.方法:用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶联合消化,分离新生大鼠心肌细胞,进行体外培养,观察心肌细胞形态学变化,并以细胞免疫荧光进行心肌细胞纯度鉴定.结果:心肌细胞分离良好,收获细胞数量及存活率高,可贴壁搏动生长,免疫荧光显示培养的心肌细胞纯度达95%以上.结论:改良的细胞培养技术可获得生长状态良好的心肌细胞.     

SD大鼠乳鼠咀嚼肌成肌细胞的原代培养

目的 建立SD大鼠乳鼠咀嚼肌成肌细胞体外培养方法。方法 分离SD大鼠乳鼠咀嚼肌，采用胰蛋白酶和胶原酶多次消化法分离细胞，再用差速贴壁法对细胞进行纯化，所得的细胞进行Desmin免疫组化鉴定。结果 95％的培养的细胞Desmin胞浆呈阳性反应，台盼蓝检查细胞成活率超过94％。结论 多次消化和差速贴壁法可获得高产量高纯度的成肌细胞。     

乳小鼠心肌细胞体外培养方法的优化

目的探讨乳小鼠心肌细胞分离和体外培养的方法,并结合实际情况建立一种优化的体外培养乳小鼠心肌细胞的方法。方法胰酶-Ⅱ型胶原酶混合液分次消化乳小鼠心肌组织后行差速贴壁法达到心肌细胞纯化目的,并利用心肌细胞特意表达a-肌动蛋白的特性运用细胞免疫组织化学方法鉴定心肌细胞。结果差速贴壁48h后心肌细胞贴壁完全,并见大部分贴壁细胞出现搏动,但未观察到同簇搏动,经a-肌动蛋白细胞免疫组织化学鉴定,心肌细胞纯度达96.7%。结论本研究优化了原代乳小鼠心肌细胞分离和体外培养方法,为后续细胞实验打下了基础。     

新生大鼠心肌细胞体外培养及其与心肌成纤维细胞形态比较

目的探索一种快速分离和培养新生大鼠心肌细胞的方法,比较心肌细胞和成纤维细胞的形态差异。方法胰蛋白酶消化法分离新生大鼠心肌细胞进行体外培养,差速贴壁法纯化心肌细胞,倒置显微镜跟踪观察心肌细胞的生长及搏动情况,台盼兰负染法检测心肌细胞活力,通过HE染色观察心肌细胞和成纤维细胞的形态学差异。结果接种24 h后细胞全部贴壁,部分细胞开始自发性搏动,48 h后,细胞体积增大,并伸出伪足,形状以三角形和梭形为主,3 d后细胞聚集成片并同步搏动且细胞活力均在90%以上。心肌细胞为梭形或三角形,胞质致密,多为单核细胞;心肌成纤维细胞呈泡状,双核和三核细胞较多,培养过程中不发生搏动。结论胰蛋白酶消化法培养新生大鼠心肌细胞快速有效,差速贴壁法纯化的心肌细胞可用于实验研究。     

一种高成活率培养大鼠原代心肌细胞的方法

【目的】探讨原代心肌细胞培养的条件和方法。【方法】取新生1～3d的SD大鼠心室肌,O．25％胰蛋自酶-0．02％EDTA消化后,培养于DMEM—F12培养液中,用差速贴壁法和化学抑制法相结合去除非心肌细胞。倒置显微镜下观察形态学变化,透射电镜观察细胞超微结构。【结果】培养的心肌细胞平均存活率（96．33±6．73）％,培养第4天细胞搏动率达（95．3±9.2）％,并出现单层同步搏动,具有典型的心肌细胞形态特征。【结论】本研究的心肌细胞培养方法操作简便,成活率高,是一种较为理想的原代心肌细胞培养方法。     

酶消化法分离老龄SD大鼠血管平滑肌细胞

目的采用酶消化法培养老龄SD大鼠血管平滑肌细胞,为血管疾病的研究提供大量的原代平滑肌细胞。方法无菌取老龄SD大鼠主动脉,采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化分离血管平滑肌细胞,自然纯化及差速贴壁纯化血管平滑肌细胞,免疫组化鉴定平滑肌细胞α肌动蛋白。结果免疫组化染色显示细胞纯度在95%以上。结论酶消化法用于血管平滑肌细胞的培养有利于获得大量的高纯度细胞供实验研究。     

一种改良小胶质细胞的培养方法

目的建立一种简便高效的小胶质细胞的原代培养及纯化方法。方法无菌环境下采取雄性新生SD大鼠（24h内）全脑,清洗、剪碎,以0.25%胰蛋白酶消化,200目滤网过滤,混合培养。9d后,利用盐酸利多卡因注射液代替传统机械振摇纯化分离小胶质细胞;采用免疫细胞化学方法检测CD11b/c的表达情况,观察小胶质细胞形态。结果改良方法可获得高产量和高纯度的小胶质细胞。显微镜下可见刚贴壁的小胶质细胞多为圆形,边缘不规则;培养4～5d后小胶质细胞形态多呈阿米巴样,折光不均。结论该方法步骤简便,可有效地提高小胶质细胞的产量和纯度,具有较高的实用价值,为研究与小胶质细胞相关的疾病提供了基础。     

三种不同乳鼠原代心肌细胞消化分离方法的对比研究

【摘要】 目的 对比研究三种乳鼠原代心肌细胞消化分离方法,比较不同方法分离获取的心肌细胞在数量、纯度、活力上的差异,为相关实验研究提供选择。方法 按照不同的消化方法进行分组,A组为0.08%胰蛋白酶单纯消化组;B组为0.08%胰蛋白酶+0.08%Ⅱ型胶原酶混合消化组;C组为0.08%胰蛋白酶和0.08%Ⅱ型胶原酶分离消化组。记录差速贴壁后的细胞数和活细胞率,对贴壁24 h后的心肌细胞进行免疫荧光染色,计算心肌细胞纯度,通过激光共聚焦显微镜对JC-1染色的心肌细胞进行线粒体膜电位检测,比较红绿荧光密度的差异,通过能量代谢间接反映细胞活力。结果 三种方法分离获得的心肌细胞数差异无统计学意义（P >0.05）,而活细胞率C组高于A组（P <0.01）;三组分离获得的心肌细胞纯度差异无统计学意义（P >0.05）;线粒体膜电位,A组荧光比值为0.928±0.078,B组荧光比值为0.943±0.099,C组荧光比值为1.160±0.089,三组之间差异有统计学意义（P <0.01）,C组线粒体膜电位高于A组和B组（P <0.01）。结论 三种消化方法在细胞数和细胞纯度上无明显差异,0.08%胰蛋白酶和0.08%Ⅱ型胶原酶分离消化的心肌细胞在活细胞率和细胞活力方面更优,可以作为常规的乳鼠心肌细胞分离方法的选择。     

新生小鼠心肌干细胞培养与分化的研究

目的了解新生小鼠心肌干细胞原代和传代的培养及其分化潜能，为缺血及坏死心肌重建的临床应用提供科学依据。方法在无菌超净台中剪取新生小鼠心脏组织，经胰酶反复消化后，弃去消化液，所得剩余组织块用胶头滴管反复吹打后离心，加入培养液培养，待其长满培养瓶后进行传代，传代培养约1周可见搏动的心肌细胞，也可见成团细胞的同步收缩。结果采用改良后的方法从消化后的心肌组织块中成功培养得到原代细胞，进行免疫荧光染色、流式细胞仪鉴定其表型为c—kit、sea-1阳性的细胞，表面不表达CD34、CD8、肌球蛋白重链（MHCⅡ）。细胞经传代培养1周左右，开始出现搏动，也可见成团细胞的同步收缩。再次经免疫荧光染色、流式细胞仪鉴定其表型为c-kit、sea-1阴性，MHCⅡ阳性的细胞，仍然不表达CD34、CD8。结论在原方法的基础上，通过对其进行改良，从心脏中成功分离得到纯度更高、活性更好的心肌干细胞，其表型为c-kit^＋、sea-1^＋、CD34^-、CD8^-、MHCⅡ^-，经过传代培养之后，分化为搏动的心肌细胞，细胞表面标记变为c-kit^-、sca-1^-、CD34-、CD8^-，并表达心肌结构蛋白MHCⅡ。     

新生大鼠雪旺细胞的体外培养和纯化

目的:探索简单有效获取大量高纯度雪旺细胞的新方法。方法:分离出生3d的新生SD大鼠坐骨神经,使用胰蛋白酶及I型胶原酶混合消化,结合差速贴壁法和G418纯化。四氮唑盐(MTT)比色法测定细胞的生长增殖情况,免疫细胞化学方法计算雪旺细胞的纯度。结果:胰酶和胶原酶混合消化后的活细胞率为94.6±3.4%,纯化后的雪旺细胞纯度为95.6±2.5%。结论:胰酶和胶原酶混合消化结合差速贴壁和G418纯化是获取大量高纯度雪旺细胞的简单有效方法。     

大鼠胃平滑肌细胞的体外分离与三维支架培养方法

目的:探讨复合胶原酶和胰蛋白酶解离大鼠胃平滑肌细胞,建立稳定的胃平滑肌细胞体外培养模型,并探讨其三维复合培养的可行性。方法:0.2%Ⅰ型胶原酶和0.05%胰蛋白酶酶解大鼠胃平滑肌,用相差显微镜观察细胞学形态与生长情况,免疫组化鉴定平滑肌细胞;采用纤维蛋白胶作为细胞外基质建立三维PLGA复合物培养模型,荧光显微镜观察复合物中的细胞活性。结果:平滑肌组织裂解充分均匀,细胞接种成功率高,1～2周细胞可传代,传代后细胞呈典型的"峰-谷"样生长;α-平滑肌肌动蛋白免疫组化染色证实所获得的平滑肌细胞,荧光显微镜下观察到PLGA支架内细胞均匀分布,存活率达90%以上。结论:酶解分离法可获得高纯度大鼠胃平滑肌细胞,三维支架培养在体外成功培养胃平滑肌细胞复合物,为深入研究胃组织工程再生奠定了基础。