SDF-1 cDNA转染人骨髓间充质干细胞的实验研究

本研究旨在探讨基质细胞衍生因子-1（SDF-1）cDNA瞬时转染人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）前后hBMSCs中SDF-1mRNA表达的情况。在分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）和构建SDF-1-pIRES2-EGFP真核表达载体的基础上,通过脂质体介导法将SDF-1真核表达质粒转染至hBMSCs,观测绿色荧光蛋白的表达并用RT-PCR方法检测瞬时转染效率。结果发现：SDF-1-pIRES2-EGFP瞬时转染后hBMSCs的SDF-1mRNA表达增高约20%左右。结论：阳离子脂质体可以将SDF-1cDNA真核表达质粒瞬时转染入hBMSCs,但转染效率低下,不能获得足够数量的稳定转染细胞供后续实验,因此需对转染方法作进一步的探讨。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染免骨髓间充质干细胞

背景:碱性成纤维细胞生长因子对于创伤修复具有明显的促进作用,但局部应用难以持久地发挥作用.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞后的表达情况.设计、时间及地点:细胞基因学体外观察,于2009-03/08在云南大学生命科学院完成.材料:日本大耳白兔1只,购于昆明医学院动物科.pCDNA3.1质粒为美国Invitrogen产品.方法:抽取兔髂前上棘骨髓,采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,待细胞融合至培养瓶底80%时消化传代.参考GeneBank碱性成纤维细胞生长因子cDNA序列设计合成基因,电泳纯化后xhol I、BamH I双酶切回收凝胶,以限制性核酸内切酶对PcDNA Vector质粒进行酶切、电泳和凝胶回收,连接碱性成纤维细胞生长因子DNA与PcDNA Vector质粒,构建pCDNA-碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体,运用脂质体转染法将重组体转染至兔骨髓间充质干细胞中,并筛选稳定转染株.主要观察指标:骨髓间充质干细胞表面抗原的表达,Western blot法检测目的蛋白的表达.结果:流式细胞仪检测结果示所培养细胞表面抗原呈CD90,CD44阳性,CD45呈阴性;免疫组化检测结果示骨髓间充质干细胞血管源性细胞表面抗原CD34呈阴性,而相对特异性标记物CD44呈阳性.转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞提取的细胞裂解液中,在M_r 23 000处有一条明显阳性杂交带;而转染pCDNA3.1(-)空载体的骨髓间充质干细胞提取蛋白未见阳性条带.结论:实验成功地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞,该目的基因可稳定表达.     

基因转染骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞

骨髓间充质干细胞在体外一定条件下分化成为胰岛细胞,既可以解决胰岛移植中供体紧缺的问题,又能够通过自体移植避免免疫排斥,还将避开胚胎干细胞研究所涉及的伦理道德问题,是治疗糖尿病的理想干细胞来源.研究发现可以将胰岛素基因及其他必需的基因直接导入来自糖尿病患者的原代细胞或其他成体干细胞如肝细胞、肠道上皮K细胞、成纤维细胞及肝脏肿瘤细胞等,使其转变为胰岛素分泌细胞即转基因的胰岛素分泌细胞.目前国际上主要的研究方向是如何将胰岛素基因有效地导入靶细胞,并使之呈生理模式表达.     

脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞

背景:自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫摹因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷.胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)即可产生强大的旁观者效应.目的:观察脂质体介导真核表达载体CD基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达.设计、时间及地点:细胞学基因水平实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成.材料:SPF级C57BL纯系小鼠6只,由大连医科大学实验动物中心提供.连接产物转化感受态大肠杆菌DH5 α由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供.LipofectamineTM 2000脂质体为Invitrogen产品.方法:取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5 α,提取质粒DNA,对质粒pIRES2-AcGFP1-CD进行Xhol和BamHI双酶切,用于转染.取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞恳液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用Lipofectamine 2000介导法转染第3代骨髓间充质干细胞.主要观察指标:重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记表达,细胞转染后CD基因的表达.结果:质粒pIRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0～1.5 kb处有一条带出现,符合CD基因长度.细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性.pIRES2-AcGFP1-CD基因转染36 h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白的表达,48 h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强.结论:脂质体介导的CD基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48 h后达峰值.     

Lipofectamine介导胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞

背景:自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫基因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷.胞嘧啶脱氨酶即可产生强大的旁观者效应.目的:观察脂质体介导真核表达载体胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达.设计、时间及地点:细胞学基因水平体外实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成.材料:SPF级C57BL纯系小鼠6只,体质量18-20 g,用于骨髓间充质干细胞的分离培养.连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供.Lipofectamine~(TM)2000脂质体为Invitrogen产品.方法:取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,提取质粒DNA,对质粒plRES2-cGFP1-CD进行Xhol和BamHI双酶切,用于转染.取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞悬液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用Lipofectamine~(TM)2000介导法转染第3代鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测鼠骨髓间充质干细胞表面标记表达,荧光倒置显微镜观察细胞转染36,48 h后胞嘧啶脱氨酶基因的表达.结果:质粒plRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0～1.5 kb处有1条带出现,符合胞嘧啶脱氨酶基因长度.流式细胞仪检测显示细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性.plRES2-AcGFP1-CD基因转染36 h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白表达,48 h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强.结论:脂质体介导的胞嘧啶脱氨酶基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48 h后达峰值.     

构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率

背景:超极化激活及环化核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)基因由于具有不增加诱发心律失常的风险、能够接受自主神经系统调节等优势,成为目前最受关注的生物起搏备选基因.目的:构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并测定其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率.设计、时间及地点:细胞-基因学体外实验,于2008-02/09在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.材料:SD大鼠10只,由中山大学实验动物中心提供.携带目的基因人HCN4 cDNA的质粒pcDNA3.1-HCN4、人胚肾293细胞、大肠杆菌DH5α由中山大学附属第二医院林百欣实验中心保存.腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdxsi购自北京诺赛基因组研究中心有限公司.方法:质粒pcDNA3.1-HCN4用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ双酶切后回收HCN4片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,得到重组穿梭质粒;1-Ceu Ⅰ+1-Sce Ⅰ双酶切处理pShuttle-CMV-HCN4,回收CMV-HCN4片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi,得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后,应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒AdHCN4;应用AdHCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:重组腺病毒质粒载体的鉴定,重组腺病毒的鉴定及滴度测定,重组腺病毒的感染效率.结果:构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HCN4用Hind Ⅲ+Xho Ⅰ双酶切,得到大小为3 600 bp(HCN4)和5 100 bp(pshutIle-CMV)两个片段,DNA测序结果证实人HCN4基因的全长序列已正确插入到pShuttle-CMV穿梭质粒中;重组腺病毒质粒pAdxsi-CMV-HCN4用Xho Ⅰ酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;重组腺病毒AdHCN4 PCR鉴定可见657 bp的阳性扩增条带;经多次重复感染后,病毒滴度检测达2.5×10~(11) PFU/mL.成功转染AdHCN4的大鼠骨髓间充质干细胞可表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数值为800,转染效率最高,达90%.结论:实验成功构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并可在体外有效转染大鼠骨髓间充质干细胞.     

超极化激活环化核苷酸门控通道基因转染猪骨髓间充质干细胞

背景:研究证实超极化激活环化核苷酸门控通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated,HCN)电流在调控心脏的自发搏动中起着非常重要的作用.目的:观察HCN2基因重组腺病毒转染后猪骨髓间充质干细胞目的基因的表达及电生理特征.设计、时间及地点:细胞一基因学体外观察,于2007-07/2008-03在解放军第二军医大学胸心外科实验室完成.材料:Yorkshire猪由解放军第二军医大学动物所提供,HCN2质粒由意大利Dario DiFrancesco教授惠赠,重组腺病毒Ad.HCN2由本实验室采用Ad5系统构建并保存.方法:Percoll密度梯度离心+贴壁法体外分离纯化猪骨髓间充质干细胞,以感染复数=50进行Ad.HCN2转染,同时设立未转染组和转染Ad.Null组.主要观察指标:通过RT-PCR、免疫荧光染色检测各组细胞HCN2 mRNA和蛋白的表达,用全细胞膜片钳检测各组细胞电生理学变化.结果:未转染组和转染Ad.Null组均未见扩增片段,而Ad.HCN2扩增后在250-500 bp可见扩增片段,与携带HCN2基因的质粒扩增出的片段位置相同.转染后细胞核染色强度明显弱于胞膜和胞浆,与HCN2蛋白的分布相符合,未转染组及转染Ad.Null组无HCN2蛋白阳性表达.全细胞膜片钳可记录到起搏电流,其激活电位约为-60 mV,完全激活电位-140 mV,呈电压依赖性,当给予4 mmol/L CsCI后,内向的起搏电流即被明显抑制:未转染组及转染Ad.Null组细胞均无起搏电流.结论:通过起搏基因HCN2重组腺病毒载体可成功转染猪骨髓间充质干细胞,使其能够表达HCN2通道蛋白,全细胞膜片钳可检测到起搏电流.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养与慢病毒转染方法的建立

本研究建立大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)体外分离培养、表型鉴定和标记的方法,为临床进行细胞移植治疗提供合格的细胞.无菌条件下取大鼠股骨、胫骨,用冲洗法冲出骨髓,贴壁培养法分离纯化BMMSC,体外扩增;流式细胞术进行免疫表型鉴定,并进行成骨,成脂分化鉴定;利用携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒液转染大鼠BMMSC...     

基因修复关节软骨缺损的可行性研究:外源性Ad-TGF-β_1转染修饰兔骨髓间充质干细胞

目的利用 Ad5/CMV－ TGF－β 1转染体外培养兔骨髓间充质干细胞,测定 TGF－β 1的表达产物为关节软骨缺损的基因治疗提供实验基础。方法采用体外培养法对兔骨髓间充质干细胞进行原代培养,应用已构建好的 Ad5/CMV－ TGF－β 1真核载体对其进行转染,并用免疫组织化学方法对转染细胞进行表达产物测定。结果采用腺病毒转染技术能够成功的实现骨髓间充质干细胞的外源性基因修饰,没有发生明细的细胞毒性反应; Ad5/CMV－ TGF－β 1对骨髓间充质干细胞的转染率为 95％左右;转染 8周后仍能观察到 TGF－β 1的表达。结论采用真核表达载体 Ad5/CMV－ TGF－β 1可以成功转染体外培养的骨髓间充质干细胞并可获得 TGF－β 1的高表达。     

白细胞介素12重组腺病毒质粒转染骨髓间充质干细胞

背景:有研究表明,骨髓间充质干细胞易于外源基因的导入和表达,且具有较弱的免疫抗原性和免疫调节功能,强大的迁移力和趋瘤性,因而逐渐显露其具有作为抗肿瘤基因治疗负载体系的优越性.目的:拟应用白细胞介素12重组腺病毒质粒AdEasy-R细胞介素12转染骨髓间充质干细胞,构建表达外源性白细胞介素12的骨髓间充质干细胞.设计、时间及地点:以细胞为对象的开放性实验,于2008-06在辽宁医学院实验中心及中国医科大学实验中心完成.材料:原代骨髓间充质干细胞由辽宁医学院外科学实验室构建,白细胞介素12重组腺病毒载体AdlL-12由辽宁医学院分子生物学实验室构建.方法:分离培养SD大鼠骨髓间允质干细胞,免疫组织化学及流式细胞技术鉴定细胞表面标志物,应用腺病毒介导白细胞介素12基因转染大鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:以反转录聚合酶链反应及Western Blotting技术检测转染后的骨髓间充质干细胞的白细胞介素12基因mRNA及蛋白表达. 结果:腺病毒介导白细胞介素12基因转染骨髓间充质干细胞后,通过反转录-聚合酶链反应及Westem Blotting技术检测,结果证实白细胞介素12基因在mRNA及蛋白水平均有表达,而未经转染的骨髓间充质干细胞内无白细胞介素12基因及蛋白表达.结论:应用白细胞介素12重组腺病毒质粒成功构建了在mRNA及蛋白水平表达外源性白细胞介素12基因的骨髓间充质干细胞.     

人骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞

骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)是一群存在于骨髓腔内的能向骨、软骨、脂肪、肌肉和基质细胞等分化的细胞。最近的骨髓移植动物模型研究显示 ,在体内骨髓细胞具有形成神经元的能力[1 ,2 ] 。与造血细胞相同 ,骨髓中的间充质干细胞也具有可移植性[3] 。因此 ,骨髓移植后形成神经元的细胞可能来源于间充质干细胞。为验证此推测 ,我们进行了如下实验。材料与方法肝素抗凝骨髓取材于异基因骨髓移植过程中正常献髓者。间充质干细胞分离、纯化和体外培养按我们以前报道的方法进行[4] 。形成致密贴壁层的间充质干细胞用 0 .0 5 %…     

骨髓间充质干细胞的研究前景

除造血干细胞以外,骨髓中还含有另一类干细胞,被称为间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ,ＭＳＣ）在不同的诱导条件下,这类细胞可分化为多种造血以外组织特别是中胚层和神经外胚层来源组织细胞,如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞和星形神经胶质细胞等。骨髓间充质干细胞易于分离和培养扩增,还易于外源基因的导入和表达,有望成为一种新的细胞治疗和基因治疗的靶细胞,在多种造血以外组织的缺     

腺相关病毒2／1型载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

本研究探讨重组腺相关病毒2／1型（recombinantadeno—associatedvirus2／1,rAAV2／1）作为载体在不同转染复数、不同时间点转染大鼠骨髓间充质干细胞（bonemalTOWmesenchymalstemcells,BMMSC）的效率及对其生长的影响。用含有增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）报告基因的rAAV2／1（rAAV2／1-EGFP）,以感染复数（multiplicityofinfection,MOI）分别为1×10^4、1×10^5、1×10^6转染体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞,在3、7、14天时荧光显微镜下观察EGFP的表达,检测子代细胞的活力、增殖倍数、分化情况．以评估rAAV2／1对BMMSC存活、增殖、分化能力的影响。应用流式细胞仪检测rAAV2／1-EGFP对BMMsC的转染效率及荧光指数（fluorescenceindexnumber,FU。结果表明：转染24小时后即可观察到BMMSC发出的绿色荧光,荧光强弱不一,随着时间的延长,荧光的强度逐渐增强,7天后达到稳定的状态;在3、7、14天时不同MOIrAAV2／1-EGFP转染BMMSC的活力、增殖倍数、分化能力无明显变化（P〉0．05）;在同一感染复数时,7天比3天和14天比7天的增殖倍数显著增强（P〈0．01）。流式细胞仪检测显示,rAAV2／1-EGFP转染BMMSC的转染率和荧光指数随着MOI增加（1×10^4、1×10^5、1×10^6）和培养时间（3、7、14天）的延长而有不同程度的增加（P〈0．05）。结论：rAAV2／1-EGFP能有效地转染BMMSC,随转染复数的增加和短期内随转染时间的延长,转染率和荧光指数明显增加。在转染过程中rAAV2／1-EGFP对细胞的活力、生长无影响。对于改造BMMSC,rAAV2／1是一种有效的基因转移载体。     

人骨髓间充质干细胞表达多种造血细胞因子

为了研究培养的人骨髓间充质干细胞在造血中的生物作用，采用RT—PCR方法在mRNA水平上分析体外培养的人骨髓间充质干细胞(BM—MSC)造血因子的表达，以及氢化考的松对BM—MSC表达造血细胞因子的影响。结果显示，体外传代培养的正常人、白血病和淋巴瘤等血液病人BM—MSC均能表达SCF，Flt3-ligand TPO,LIF,IL—6和IL—11等重要的造血细胞因子，但不表达G—CSF，GM—CSF和IL-3。不同代数的BM—MSC细胞，造血细胞因子的表达相同。BM—MSC经氢化考的松作用7—21天后，可谤手G—GSFmRNA表达，但不诱导GM—GSF的表达，细胞在形态学上也未发生明显改变。结论：体外培养的正常人和本组血液病病人BM—MSC具有促造血功能。     

人骨髓间充质干细胞支持体外造血

体内的稳态造血依赖于复杂而完整的骨髓造血微环境系统,其中的细胞成分是该系统的关键。存在于骨髓中的间充质干细胞（ＭＳＣｓ）是成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多种骨髓基质细胞的前体细胞,在造血调控中可能具有一定的作用。本研究首先建立了成人骨髓ＭＳＣｓ的分离及体外培养的方法,并应用长期骨髓细胞培养体系,观察了ＭＳＣｓ滋养层体外维持长期培养启动细胞（ＬＴＣ－ＩＣ）的能力及其促进造血细胞分化的功能     

应用生物发光成像技术示踪植入的骨髓间充质干细胞

以间充质干细胞（MSC）为基础的细胞治疗已进入临床试验阶段,用于多种组织修复,而移植细胞体内存活是影响疗效的重要因素。为了体内示踪MSC,构建了萤火虫荧光素酶基因（fluc）逆转录病毒表达载体pL（fluc）SN,并筛选出稳定表达fluc的GPE＋86细胞克隆。将逆转录病毒上清转染C57小鼠来源的MSC,经G418筛选后得到稳定表达fluc的MSC。将2×10^6个标记好的细胞注射正常骨骼肌,应用生物发光技术检测移植后不同时间细胞的存活情况。结果表明,随着时间的延长,细胞存活数目逐渐减少;移植后1天细胞死亡率高达（43．2±11．7）％,3天后细胞存活（8．6±2．5）％,6天后仅为（5．4±3．1）％,10天时未检测到荧光信号。结论：生物发光成像技术可用于移植的MSC体内示踪,但是即使将MSC植入正常的骨骼肌组织,大部分注入的MSC也将在短期内死亡。     

全骨髓贴壁法培养人骨髓间充质干细胞的改良研究

本研究旨在利用红细胞自然沉降性原理，以传统的全骨髓贴壁法为基础，探讨一种改良后简便而高效的人骨髓间充质干细胞培养方法。采用6孔板培养细胞，将骨髓标本用MSC完全培养液培养48h，吸取上层无红细胞的上清层，置于新的培养孔以分离获取MSC。用倒置显微镜观察细胞形态及贴壁情况，记录细胞首次贴壁时间、首次传代时间。并以传统全骨髓贴壁法为对照；应用流式细胞术检测细胞周期、细胞表面标记；用油红0及碱性磷酸酶试剂盒分别对MSC成脂、成骨能力进行鉴定；应用计数板计数法描绘第1代，第3代，第5代MSC增殖曲线。结果表明，用改良法培养的MSC高表达CD90、CD105、CD13、CD44，低表达CD14、CD45、CD34；细胞周期中G0／G1期88．76％，G2／M期3．04％，S期8．2％，符合干细胞周期特征；增殖曲线呈典型”S”型；油红O与碱性磷酸酶染色均为阳性。同时与传统方法相比，改良方法的细胞贴壁率显著高于传统方法（P=0．0004），首次贴壁时间短（P〈0．0001）、首次传代时间短（P=0．001）。结论：骨髓标本培养48h后的上清层中含大量贴壁活性的悬浮MSC，改良方法是一种比传统贴壁法更具有便捷、高效等优点的培养方法。     

不同年龄段人骨髓间充质干细胞生物学特性的研究

本研究通过对不同年龄段人骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC)的研究探讨MSC生物学特点与年龄的关系,从而为临床寻找合适供体,迅速获取所需MSC提供实验依据。骨髓供体按年龄分为4组:A组(胚胎)、B组(0-20岁)、C组(20-40岁)和D组(40岁以上)。观察各组骨髓MSC的生长、增殖、分化特点;用流式细胞仪检测细胞表面标志,用ELISA方法检测培养上清造血相关因子的水平;进行核型分析及成瘤试验;评价不同年龄段供体骨髓MSC在临床造血干细胞移植中的应用价值。结果显示:各组骨髓均可培养出MSC,各组MSC表面标志无显著差异;各组MSC均具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的能力;原代培养B组骨髓MSC含量较多,贴壁时间早,传代时间短,P0至P1时间为5.5天,传至P10需33天,8×106MNC培养至P10时MSC数达(5.19±2.15)×1010;A、C、D组P0至P1时间分别为15、7和13天,传至P10分别需50、60和72天,8×106MNC培养传代至P10时MSC数分别为(4.98±2.08)×1010、(1.86±0.47)×1010、(0.64±0.22)×1010。A组MSC较细长,细胞融合后生长无接触抑制,P15增殖速度开始减缓;B、C、D组MSC形态相似,有生长接触抑制B组P10开始增殖减缓,C、D组P8开始增殖减缓;B组MSC培养上清中SCF、FLT3L、IL6及SDF1水平高于其它各组。各组间细胞的增殖指数无显著差异。核型分析均为正常核型,成瘤实验为阴性。结论:MSC增殖生长特性与年龄密切相关;根据临床造血干细胞移植的需要,0-20岁年龄组骨髓是短时间内获取足够细胞数的理想供体,分泌HGFs水平亦占优势;0-20岁组骨髓MSC的生物学特性优于其他各组,可以作为MSC的供源。     

人骨髓间充质干细胞释放膜微囊条件探索

间充质干细胞（MSC）释放膜微囊（MV）是其促血管再生的重要机制。本研究旨在探索人骨髓MSC释放MV的适宜条件。收集5份健康人骨髓标本,分离培养并鉴定MSC。将第5代MSC分别悬浮于含10％胎牛血清或无血清的培养液中,按2×10^6／皿接种于直径为150mm的培养皿中,在低氧（1％氧浓度）或常氧条件下培养72h,每组20皿。将培养上清高速离心收获MV。计数培养后贴壁细胞,并测定MV蛋白质含量。电子显微镜观察MV的形态以鉴定MV。流式细胞术分析MV的表面标志。在脐静脉内皮细胞培养体系中,加入不同来源的MV（10μg/m1）,培养72h后利用MTr实验观察细胞增殖活性。结果表明：多数Msc释放的MV直径〈100nm,在电子显微镜下呈特征性的中空膜样结构。MV表达CD29、CD44、CD73和CD105,不表达CD31和CD45。在常氧含血清、常氧无血清、低氧含血清和低氧无血清条件下,台盼蓝抵抗的贴壁细胞扩增倍数分别为4．1、1．8、5．8和3．7,计算10^8细胞释放的MV蛋白含量分别为463．48±138．74、1604．07±445．28、2389．64±476．75和3141．18±353．01μg。MTT实验表明,低氧条件下获得的MV具有更好的促内皮细胞增殖作用。结论：低氧可促进MSC释放MV,低氧和无血清培养MSC可能是制备MSC—MV的适宜条件。