嗜肺军团菌flaA基因的克隆及原核融合表达

目的 构建嗜肺军团菌鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)的融合表达载体,并在原核系统表达,为进一步研究鞭毛亚单位蛋白的致病作用和免疫保护性提供前提条件.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌flaA基因,与带有硫氧还蛋白基因(Trx)的高效原核表达质粒pET32a( )定向重组,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-flaA融合蛋白, 用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定.结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了嗜肺军团菌1435 bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-flaA,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-flaA在大肠杆菌中得到了高效融合表达.结论 成功构建嗜肺军团菌flaA基因重组质粒,并在原核系统中得到了高效表达.     

嗜肺军团菌flaA部分基因的克隆及其原核表达

目的克隆表达嗜肺军团菌的鞭毛亚单位蛋白flaA部分基因,并纯化重组蛋白。方法以嗜肺军团菌I型DNA为模板,聚合酶链反应（PCR）扩增鞭毛亚单位蛋白flaA部分基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET32a（＋）,构建原核表达重组质粒pET-flaA。经PCR和限制性核酸内切酶鉴定及测序分析后,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳分析,用亲和层析法纯化其表达蛋白。结果扩增出嗜肺军团菌606bp的flaA部分基因,构建的重组质粒pET-flaA表达并纯化出42 kDa融合蛋白质。结论成功构建嗜肺军团菌flaA部分基因的原核表达载体,在原核系统中得到了高效表达。     

嗜肺军团菌flaA部分基因的克隆及其原核表达

目的克隆表达嗜肺军团菌的鞭毛亚单位蛋白flaA部分基因,并纯化重组蛋白。方法以嗜肺军团菌I型DNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增鞭毛亚单位蛋白flaA部分基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET32a(+),构建原核表达重组质粒pET-flaA。经PCR和限制性核酸内切酶鉴定及测序分析后,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳分析,用亲和层析法纯化其表达蛋白。结果扩增出嗜肺军团菌606bp的flaA部分基因,构建的重组质粒pET-flaA表达并纯化出42 kDa融合蛋白质。结论成功构建嗜肺军团菌flaA部分基因的原核表达载体,在原核系统中得到了高效表达。     

嗜肺军团菌pip基因原核质粒的构建及其表达

目的扩增嗜肺军团菌基因pip,构建重组质粒pET-pip并在原核系统中表达。方法采用PCR,从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增出pip基因,将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-pip,经限制性内切酶、PCR鉴定及测序分析后,转化BL21,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE进行鉴定。使用His-tag纯化重组蛋白PIP。结果扩增出了嗜肺军团菌726bp的pip基因,构建的原核表达重组质粒pET-pip表达并纯化出了约46kD Trx-PIP的融合蛋白。结论成功构建了嗜肺军团菌pip基因的原核重组质粒,并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

嗜肺军团菌ip基因的克隆及其原核表达

目的克隆嗜肺军团菌主要免疫原蛋白ip基因,构建重组质粒pET-ip,并在原核系统中表达。方法采用聚合酶链反应(PCR),从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增军团菌主要免疫原蛋白ip基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a( ),构建原核表达重组质粒pET-ip,经限制性内切酶鉴定、PCR及测序分析后,转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果扩增出了792 bp完整的ip基因,构建的原核表达重组质粒pET-ip表达出49 kDa Trx-IP的融合蛋白质,Western-blot证实获得蛋白为所需要的目的蛋白。结论成功构建了军团菌ip基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

嗜肺军团菌momp原核重组质粒的构建和表达

目的构建嗜肺军团菌momp原核重组质粒,并纯化重组蛋白。方法以嗜肺军团菌LP1型DNA为模板,PCR扩增得到momp基因,定向克隆至原核载体PET32a（＋）中,经酶切及测序鉴定正确后,转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导并用SDS-PAGE电泳进行分析,其产物用亲和层析法进行纯化。结果扩增出831bp的momp基因,构建重组质粒pET-momp,诱导表达及纯化出50KD的蛋白。结论成功构建momp基因的原核表达载体并得到高效表达。     

猪干扰素-γ基因的合成及其在大肠杆菌中的表达

目的:构建猪干扰素-γ基因(PoIFN-γ)的融合表达质粒,并在原核系统表达,为猪γ干扰素生物药剂或疫苗佐剂的开发奠定基础.方法:选择大肠杆菌偏爱密码子,分成20个长约48 bp且相互配对的寡核苷酸片段,采用重叠PCR方法人工合成了猪干扰素-γ成熟蛋白编码基因,并经测序证实后克隆至原核表达载体pQE30中.经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,不同温度下以IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析.结果:限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了PoIFN-γ基因,成功构建了重组质粒pQE30/PoIFN-γ,SDS-PAGE分析显示目的蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中获得高表达,表达量占总菌体蛋白的84.5%.结论:应用重叠PCR合成PoIFN-γ基因并在大肠杆菌中得到了高效表达.     

霍乱毒素ctxA基因的克隆及原核表达

目的 构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）的融合表达载体。并在原核细胞中表达,为霍乱弧菌肠毒素A亚基（CTA）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法 以霍乱弧菌DNA为模板．PCR扩增获得霍乱弧菌ctxA基因,与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组,构建重组质粒．转化大肠杆菌BL21（DE3）,并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx—CTA融合蛋白,用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了霍乱弧菌787bp的ctxA基因,成功构建了重组质粒pET—ctxA,经SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxA在原核细胞中得到了高效融合表达。结论 霍乱弧菌ctxA基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

嗜肺军团菌mip基因的原核与真核表达重组质粒的构建

目的　扩增嗜肺军团菌 mip基因 ,导入载体 p UC18和 pc DNA3.1( ) ,构建重组质粒 p L pmip和pc DNA3.1- mip。方法　采用 PCR从嗜肺军团菌扩增得到 mip基因 ,导入载体 p UC18和 pc DNA3.1( ) ,构建重组质粒p L pmip和 pc DNA3.1- mip并转化大肠杆菌 ,用限制性酶切分析、PCR、序列分析进行鉴定。结果　扩增出 82 8bp的 mip基因 ;构建重组质粒 p L p Mip和 pc DNA3.1- mip。结论　成功扩增 82 8bp的嗜肺军团菌 Mip基因 ,构建重组质粒 p L p Mip和 pc DNA3.1- mip。     

嗜肺军团菌mip基因重组质粒GFP-mip的构建及表达

目的构建嗜肺军团菌mip基因的真核重组质粒GFP-mip,并观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以嗜肺军团菌DNA为模版,通过PCR扩增获得mip基因,将其定向克隆到绿色荧光质粒pEGFP-C1中,构建真核重组质粒GFP-mip。经限制性核酸内切酶XhoI和BamHI酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,通过脂质体法转染到NIH3T3细胞中,利用荧光显微镜观察重组质粒的稳定表达。结果扩增出了702bpmip基因,在细胞质和细胞膜观察到较强绿色荧光。结论成功构建了真核重组质粒GFP-mip,并在NIH3T3细胞中得到了表达。     

PCR介导嗜肺军团菌疫苗候选基因lvgA和Hsp60的融合及其在大肠杆菌中表达的初步研究

目的采用PCR法进行嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的拼接融合，克隆并检测该融合基因在原核系统中表达情况．为进一步研究其免疫性能作必要的准备。方法采用重组聚合酶链反应，设计引物首先分别从嗜肺军团菌基因组DNA中扩得待融合端互补的军团菌毒力基因（lvgA）和热休克蛋白60基因（Hsp60），经琼脂糖电泳纯化回收，再以适量lvgA和Hsp60为模板变性、退火、重叠延伸，实现二基因的PCR水平融合，随后采用外引物进行新一轮扩增，扩得足量lvgA／Hsp60融合基因的PCR产物，继而将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，构建原核表达重组质粒，转化宿主菌BL21，经PCR、酶切及测序鉴定后，IPTG诱导表达，产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析等鉴定。结果扩增出了约2292bp的lvgA／Hsp60融合基因，构建了原核表达重组质粒pGlvgA／Hsp60，并检测到M约117000的GST-lvgA-Hsp60融合蛋白表达条带。结论采用PCR法实现了嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的融合，构建了其原核表达重组质粒．并使该融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达，为进一步研究该融合基因的免疫学特性奠定了基础．     

结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85B编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVaxl中，转化大肠杆菌DH5a，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌PCR扩增为阳性，经限制性内切酶消化后可见目的条带，所测定序列与报道的Ag85B序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株。     

嗜肺军团菌pilE基因体外表达及其免疫原性研究

目的 构建嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛pilE基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-pilE,研究其真核细胞中的表达及其免疫原性.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌pilE基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1.-pilE.经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-pilE转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western-blot分别鉴定pcDNA3.1-pilE的瞬时和稳定表达产物.将pcDNA3.1-pilE作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ产生水平、CTL杀伤活性等指标,评价疫苗的免疫原性.结果 扩增出了429 bp的PilE基因,在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,在相对分子质量15000处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-pilE在细胞内表达PilE蛋白.pcDNA3.1-pilE免疫组的免疫原性均高于对照组pcDNA3.1( )组(P＜0.01).结论 成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中得到了表达,免疫小鼠后诱导了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答.     

幽门螺杆菌flaA基因在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的：观察幽门螺杆菌(H．pylori)flaA基因在大肠杆菌中的表达。方法：用PCR方法扩增flaA基因,然后插入原核表达载体pMAL-c2x进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果：特异PCR和酶切鉴定证实flaA基因克隆入表达载体,并以融合蛋门形式MBP-FLA高效表达,约占细胞总蛋白的28％。该融合蛋白可与H.pylori阳性病人血清和小鼠H.pylori全菌抗体发生特异反应。结论：成功构建了能高效表达H．pylori FlaA蛋白的重组质粒,为H．pylori多价基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

GST/RIPX融合蛋白表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

目的 构建GST/RIPX融合蛋白基因表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 以质粒pcDNA3.1.RIPX为模板,通过BamH1和Xho1酶切位点将RIPX定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并转化E.coil DH5а,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入化E.eoli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达.鉴定.结果 酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并用SDS-PAGE方法证实了GST/RIPX融合蛋白的表达.结论 成功构建了RIPX原核表达载体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化RIPX蛋白和研究RIPX的生物学功能奠定了基础.