普氏立克次体重组表面蛋白制备和免疫印迹抗原特异性分析

目的克隆与表达普氏立克次体（Rickettesia prowazekii）主要蛋白抗原基因,分析所表达重组蛋白的抗原特异性。方法采用PCR法从普氏立克次体全基因组中扩增其主要抗原基因,将扩得的基因片段插入原核表达质粒;将基因重组表达质粒转化大肠杆菌,用IPTG诱导转化菌表达重组蛋白。将普氏立克次体、莫氏立克次体、立氏立克次体、恙虫病东方体、黑龙江立克次体、贝氏柯克斯体等实验感染小鼠血清与重组蛋白做免疫印迹。结果经过PCR扩增后获得9个目的基因片段,用其构建出9个原核表达质粒;9个原核表达质粒转化菌均高效表达出相应的重组蛋白;结果显示FtsZ、GroEI。Rp828、EF—Ts等4个蛋白特异性最好,仅与普氏立克次体感染小鼠血清反应;其次是Omp,它除与普氏立克次体感染小鼠血清反应外,仅与莫氏立克次体感染血清反应。结论FtsZ等4个重组蛋白为普氏立克次体的特异性抗原,可以作为研制流行性斑疹伤寒血清学诊断试剂的候选抗原。     

立氏立克次体外膜蛋白B基因片段的克隆与表达

目的立氏立克次体(Rickettsiarickettsii)外膜蛋白B(OmpB)基因(ompB)片段的克隆与表达。方法采用PCR方法,从立氏立克次体基因组中扩增其ompB基因片段,将该基因片段与原核表达载体pQE30连接,构建重组原核表达质粒pQE30/ompB;将pQE30/ompB转入大肠杆菌细胞内,用IPTG诱导转化大肠杆菌表达目的基因。结果获得长为1188bp的ompB基因片段,SDS-PAGE分析发现pQE30/ompB转化菌表达了一44kDa蛋白,该蛋白与立氏立克次体免疫兔血清在免疫印迹分析中呈阳性反应,与其它立克次体免疫血清反应呈阴性,用该重组蛋白免疫血清做间接免疫荧光,检测立氏立克次体结果为阳性,而检测贝氏柯克斯体、恙虫病立克次体和普氏立克次体的结果为阴性。结论pQE30/ompB转化的大肠杆菌表达了ompB基因片段,所产生的重组蛋白具有立氏立克次体抗原特异性和良好的免疫反应性。     

登革热病毒外膜蛋白基因的克隆、表达

目的　在大肠杆菌中表达登革热病毒外膜抗原基因 ,获得能作为检测抗原的重组蛋白。方法　登革热 2型病毒NGC株感染C6/ 36细胞后 ,抽提病毒RNA ,经逆转录和套式PCR扩增出E基因片断 ,扩增片段经酶切、连接、克隆 ,构建重组表达质粒。并转化大肠杆菌DH5α。结果　重组质粒经诱导后表达外膜抗原的部分肽链。经过免疫印迹证实其具有免疫反应性。结论　截断的部分E蛋白基因在大肠杆菌中表达成功 ,重组的蛋白可作为血清学检测抗原使用     

普氏立克次体120kDa表面抗原N段基因的克隆与表达

目的　克隆和表达普氏立克次体 (Rickettsiaprowazekii) 12 0kDa外膜蛋白N段基因。 方法　采用PCR方法 ,从普氏立克次体基因组中扩增其 12 0kDa表面抗原N段基因片段 ,将其与原核表达载体 pQE30连接 ,构建重组质粒 pQE30 /2 6kDa,将重组质粒转入大肠杆菌 ,用IPTG诱导大肠杆菌内的目的基因表达。结果　获得长为 717bp的PCR片段 ,序列分析结果与已知普氏立克次体 12 0kDa表面抗原基因一致 ;SDS -PAGE检测表达产物 ,在相对分子量 2 6 .3kDa处有一表达带 ;免疫印迹分析证明它能与普氏立克次体免疫兔血清反应 ;经双波长薄层扫描分析 ,目的蛋白占全菌体蛋白的 2 0 % ;提取表达菌体包涵体检查 ,证明目的蛋白主要存在于包涵体中。结论　普氏立克次体 12 0kDa表面抗原N段基因在大肠杆菌中获得了高效表达 ,该重组蛋白具有良好的免疫反应性。     

恙虫病东方体Gilliam株56kDa外膜蛋白基因的克隆与表达

目的　表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi)Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白 ,探索其作为诊断抗原的可能性。方法　采用PCR方法 ,从Ot Gilliam株菌种基因组DNA中扩增出 5 6kDa外膜蛋白基因片段 ,将目的基因片段定向插入原核表达载体pQE30 ,再用重组质粒转化大肠杆菌 ,最后用IPTG诱导转化菌 ,SDS -PAGE和Western -blotting检测重组质粒目的基因的表达。结果　 (1)获得长约 15 0 0bp的Ot Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白基因 ,SDS -PAGE检测表达产物 ,在相对分子量5 6× 10 4处有表达带 ;(2 )DNA测序证明重组质粒 pQE30 / 5 6中插入的基因片段的序列与已报告的Ot Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白基因序列基本一致。 (3)诱导表达菌体经超声破碎后 ,显示目的蛋白主要以包涵体形式存在 ;(4 )免疫印迹显示该重组质粒转化的大肠杆菌有一相对分子量约为 5 6× 10 4的独特蛋白带 ,该蛋白约占细菌蛋白总量的 2 9 4 %。结论　Ot Gilliam株5 6kDa外膜蛋白基因在大肠杆菌中获得了高效表达 ,表达的重组蛋白具有免疫反应性 ,与Ot Gilliam株感染的小鼠血清在免疫印迹中呈阳性反应。     

弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核表达质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒。方法 参照GRA8序列分别设计引物。采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段，克隆至pMD18-T载体；菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析；各组阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl，分别转化大肠杆菌BL21和JM109,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列；将构建的原核表达菌株经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达；将构建的真核重组表达质粒免疫小鼠，观察其诱导的抗体应答。结果 PCR扩增出GRA8基因的特异片段。各组阳性克隆的序列正确，并分别被亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl上，构建了弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒；原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白；真核重组表达质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。结论以pGEX-4T-2和pVAX1为载体，分别成功构建了GRA8的原核和真核重组表达质粒     

贝氏柯克斯体热休克蛋白B基因的克隆与表达

目的克隆贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii)热休克蛋白B(HspB)基因并在大肠杆菌细胞内高效表达。方法采用PCR方法,从贝氏柯克斯体新桥株基因组DNA中扩增出HspB的基因片段,鉴定后将目的片段与原核表达载体pQE30连接,构建重组表达质粒pQE30/hspB,IPTG诱导该重组质粒转化的大肠杆菌产生HspB重组蛋白。结果(1)PCR扩增获得长约1556bp的hspB基因片段。(2)SDS-PAGE证明,HspB重组蛋白的分子量为53.7kDa。(3)经薄层扫描分析,表达蛋白约占全菌体蛋白的71.2%。结论贝氏柯克斯体hspB基因在大肠杆菌中获得了高效表达,为Q热疫苗的研制提供了一易于获得的候选蛋白分子。     

汉赛巴通体重组外膜蛋白Pap31的研制和抗原性分析

目的克隆并表达汉赛巴通体Pap31外膜蛋白基因,并对其抗原性进行初步分析。方法采用PCR从汉赛巴通体基因组DNA扩增外膜蛋白基因pap31,将目的基因片段插入原核表达质粒pQE30,构建重组质粒pQE30/pap31;将构建的重组质粒转化大肠杆菌M15并诱导目的基因表达,以SDS-PAGE电泳以及免疫印迹法分析表达目的蛋白。结果在SDS-PAGE电泳分析发现pQE30/pap31转化菌高效表达一重组蛋白,经免疫印迹分析发现该蛋白与汉赛巴通体免疫血清发生强烈反应;经间接免疫荧光分析发现该重组蛋白免疫血清能特异识别汉赛巴通体。结论汉赛巴通体外膜蛋白基因pap31在大肠杆菌高效表达,表达的重组Pap31外膜蛋白具有良好的抗原性。     

贝氏柯克斯体感染小鼠血清与其毒力相关蛋白的免疫印迹反应

目的筛选与贝氏柯克斯体感染血清反应的贝氏柯克斯体毒力相关蛋白。方法以贝氏柯克斯体标准株九里株为模板,采用PCR扩增包括IV型分泌系统、分泌性蛋白和膜蛋白在内的毒力及毒力相关的基因,将扩得目的基因片段与原核表达质粒pET32a重组,将重组质粒转化大肠杆菌,用贝氏柯克斯体实验感染小鼠血清与转化大肠杆菌作免疫印迹。结果设计173对引物共扩增出170个目的基因,经PCR及酶切鉴定,有155个基因与pET32a质粒重组成功,SDS-PAGE电泳分析发现,共有104个转化菌表达目的蛋白,在104个重组蛋白中,筛选到32个与贝氏柯克斯体感染小鼠血清反应的重组蛋白。结论这些与贝氏柯克斯体感染血清反应的毒力相关蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。     

查菲埃立克体重组120kDa抗原的初步应用研究

目的　克隆查菲埃立克体 12 0kDa膜表面抗原蛋白基因 ,获得纯化的重组蛋白。方法　根据查菲埃立克体(91HE17) 12 0kDa抗原蛋白基因序列设计特异性引物 ,PCR扩增查菲埃立克体 12 0kDa抗原蛋白的基因片段 ;用限制性内切酶酶切PCR扩增产物后与 pUC18载体相连接 ,经酶切和序列分析证实后 ,将目标片段定向插入原核表达载体pProEXHTB中构建pProEXHTB/ p12 0重组质粒 ;将重组质粒转化E coliDH5α ,并使转化子在IPTG的诱导下进行蛋白质表达 ;运用亲和层析和电洗脱法对重组蛋白进行纯化。结果　克隆到一大小为 10 80bp的查菲埃立克体 12 0kDa抗原蛋白的基因片段 ,用该基因与表达质粒连接 ,成功构建了重组表达质粒 ;SDS -PAGE分析显示 :在IPTG诱导下 ,重组表达质粒转化的大肠杆菌产生一分子量为 4 7kDa的目标蛋白 ,免疫印迹证明该重组蛋白能与查菲埃立克体免疫血清发生反应。用纯化的重组蛋白作免疫斑点分析 ,76份被检血清中有 2份为可疑阳性 ,但经IFA复核为阴性。结论　查菲埃立克体 12 0kDa重组抗原蛋白具有免疫反应活性 ,为以重组蛋白为基础的人单核细胞埃立克体病的血清学诊断试剂盒制备和疫苗的研制奠定了基础。     

Spotted fever: isolation of Rickettsia from a skin biopsy sample]

A 2 years old child living in an area of the State of S?o Paulo, known in the past as endemic for rickettsiosis developed clinical evidences of spotted fever after a tick bite. Rickettsiae were isolated from guinea pigs inoculated with a skin homogenate. In sera tested by indirect immunofluorescence with Rickettsia rickettsii standard antigen, IgG specific antibody titers raised from 1:512 in the first sample to 1:2048 in the third one; IgM specific antibody titer was 1:128 in the three samples. Also positive were sera obtained from the inoculated guinea pigs. In the last 20 years no other case of rickettsial spotted fever has been confirmed by isolation of the agent in Brasil. To our knowledge, there are no previous reports of isolation of Rickettsiae through inoculation of skin biopsy homogenates.     

Serologic study of the prevalence of rickettsiosis in Yucatán: evidence for a prevalent spotted fever group rickettsiosis.

Because of the discovery of a spotted fever group rickettsiosis with signs and symptoms similar to dengue fever in Yucatan, Mexico, immunofluorescence assay (IFA) serology was performed on sera from 390 persons selected from a representative geographic distribution of rural Yucatan to detect antibodies reactive with Rickettsia rickettsii, R. akari, a Thai strain (TT-118) that is most closely related to a rickettsia identified in Amblyomma cajennense ticks in southern Texas, and R. typhi. The IFA antibodies at titers > or = 1:64 against R. akari were detected in 22 (5.6%) of the samples with the expected cross-reactivity against the other antigens of the spotted fever group. Immunoblotting with antigens of R. akari identified antibodies against antigens of spotted fever group lipopolysaccharides and not against rickettsial outer membrane proteins A and B, which contain the species-specific epitopes. A rickettsiosis most likely caused by a relative of R. akari appears to be both prevalent and widely distributed geographically in Yucatan.     

The causative agent from a patient with spotted fever group rickettsiosis in Japan on Awaji Island, Hyogo

Misaka strain was isolated as the causative agent from a patient with spotted fever group rickettsiosis in Japan by using nude mice on Awaji Island, Hyogo in September 1988. The nude mice infected with the isolate showed weakness and splenomegaly and died in two or three weeks after the infection. The cyclophosphamide-treated mice infected with the isolate died between four and seven days after the infection. The infected normal mice recovered and acquired immunity. The infected adult male guinea pigs were feverish and showed swelling and redness of the scrotum between two and eight days after the infection, and recovered. The Misaka strain was propagated well in Vero cells in tissue culture. The rickettsial particles were seen as diplobacillary and diplococcal forms growing predominantly in the cytoplasm and occasionally in the nucleus of infected cells. The serological characteristics of the Misaka strain were analyzed by the cross-immunofluorescent antibody method. The Misaka strain, the Katayama strain first isolated in Tokushima in 1987, and the representative strains of spotted fever group rickettsiae in the world; R. rickettsii Smith, R. sibirica 246, R. conorii Moroccan, R. akari MK (Kaplan), R. australis Phillips, R. montana Tick and Thai TT-118 strains were used as antigens. And immune mouse serum samples against the Misaka, Katayama, 246, Phillips and TT-118 strains were used as antisera. The result revealed that these strains showed cross-reaction and share a common antigen of spotted fever group rickettsiae. Furthermore, it became obvious that the Misaka strain and the Katayama strain have the same serotype-specific antigen different from the strains of other spotted fever group rickettsiae using Anti-Katayama monoclonal antibodies.     

贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白抗原包被酶联免疫吸附试验的特异性和敏感性分析

目的 使用贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白作为包被抗原的酶联免疫吸附试验用于血清学检测的特异性和敏感性分析。方法 本研究建立由贝氏柯克斯体的Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重组表面蛋白抗原分别包被的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,然后分别检测贝氏柯克斯体实验感染小鼠血清和Q热患者血清中IgG特异性抗体。结果 8份贝氏柯克斯体感染小鼠血清中除1份血清与RplL反应为阴性外其它均为阳性;11份Q热患者血清中除1份血清与RplL、1份血清与OmpH反应为阴性外,其它血清反应均为阳性。将这5种重组蛋白分别与莫氏立克次体、黑龙江立克次体、恙虫病东方体实验感染小鼠血清反应,除1份黑龙江立克次体感染小鼠血清与GroEL反应为阳性外,其它血清反应均为阴性。另外,Com1对斑疹伤寒、斑点热、恙虫病患者血清的阳性反应率平均为22.2%,GroEL为25.0%,Mip为25.0%,OmpH为25.0%,RplL为13.9%。结论 这些结果证明这5种重组蛋白抗原均可被贝氏柯克斯体感染血清所识别。所建立的ELISA方法具有良好特异性和敏感性,可用作Q热血清学诊断。     

Characterization of monoclonal antibodies protecting mice against Rickettsia rickettsii

Hybridomas producing monoclonal antibodies to Rickettsia rickettsii were prepared from mice to investigate the function of rickettsial antigens. Of the 31 reactive hybridoma lines thus far tested for immunoglobulin subclasses, 11 belonged to the IgG2A subclass, 9 to the IgG2B subclass, and 7 to the IgG3 subclass; four did not react with any of the isotyping sera. Five of the antibodies recognized epitopes present on molecules that were presumed to be polysaccharide and heterogeneous in molecular weight. Twenty monoclonal antibodies reacted with a 170,000-dalton antigen, and six precipitated both the 133,000- and 32,000-dalton polypeptides. Only those antibodies to the 170,000- and 133,000-dalton antigens protected mice from challenge with R. rickettsii. Antibodies to these same antigens were detected in sera from patients convalescing from Rocky Mountain spotted fever. All monoclonal antibodies reacted with antigens apparently located on the rickettsial surface. The protective activity of these antibodies was not correlated with their reactivity in complement fixation, enzyme-linked immunosorbent assay, and immunofluorescence tests.     

斑点热疫苗研究进展

斑点热是斑点热群立克次体引起的一类重要传染病,接种疫苗仍是预防斑点热的一种重要措施. 灭活立氏立克次体接种能够刺激实验动物产生特异性体液和细胞免疫,有效对抗该立克次体的致死性攻击,但对人体免疫的保护效果并不理想. 目前已发现的斑点热群立克次体的保护性抗原主要有外膜蛋白A、外膜蛋白B、YbgF和Adr2等表面蛋白,是研发斑点热分子疫苗的潜在候选分子. 单个保护性抗原免疫虽然能够诱导动物产生良好的特异性体液和细胞免疫应答,但是不能提供完全保护. 多个保护性抗原组合或保护性抗原的T和B淋巴细胞表位组合是研发斑点热分子疫苗的有效途径.     

旋毛虫抗原基因Ts88原核表达及重组蛋白鉴定

目的　原核表达旋毛虫抗原基因Ts88,并对重组蛋白的抗原性进行鉴定。　方法　免疫筛选cDNA文库得到旋毛虫抗原新基因Ts88,克隆入原核表达载体pET28c(+),异丙基βD硫代半乳糖苷诱导表达。重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清,ELISA检测抗体滴度。蛋白质印迹法检测重组蛋白的抗原性。免疫荧光试验确定Ts88蛋白在虫体的分布。　结果　经原核表达的Ts88重组蛋白,用其免疫小鼠可得到高滴度的抗体血清。蛋白质印迹法结果表明该重组蛋白能与旋毛虫病患者血清、旋毛虫病猪血清、人工感染及人工免疫兔血清反应,不与其他蠕虫病患者血清发生交叉反应 ,并能识别旋毛虫虫体天然抗原成分。免疫荧光试验显示Ts88蛋白主要分布于虫体体壁。　结论　成功制备Ts88基因的重组蛋白,证明该蛋白具有较好的抗原性     

重组结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6融合蛋白的制备及应用研究

目的 制备重组培养滤液蛋白10和6000早期分泌性抗原靶的融合蛋白(rCFPlO-ESAT-6)，研究其免疫学特性，评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 用基因拼接(Gene SOEing)法扩增lhp-ESAT-6融合基因、并克隆人pQE30质粒，表达、纯化rCFPl0-ESAT-6蛋白，通过Western blot分析其抗原性。建立豚鼠BCG免疫模型和结核分枝杆菌强毒株(H37Rv)感染模型，建立以融合蛋白为抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)法，检测豚鼠血清中的抗结核分枝杆菌抗体，并与以纯化蛋白衍生物(PPD)为抗原的ELISA法比较。结果 重组质粒pQE30-CFPl0-ESAT-6靶基因的测序结果与预计序列(lhp-linker-ESAT-6)完全一致。融合蛋白在DH5α菌中以可溶性非包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的40％，分子质量为26000，纯化后的蛋白纯度为98％，浓度为1.2g／L。Western blot分析表明，融合蛋白与活动性肺结核患血清、兔抗CFP10血清和兔抗ESAT-6血清都能发生特异性免疫反应。以10只生理盐水处理豚鼠血清的平均吸光度(A)值 2s为正常界限值，以融合蛋白为抗原，11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应，11份BCG免疫豚鼠血清仅1份呈阳性反应；以PPD为抗原，11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应，11份BCG免疫豚鼠血清也全部呈阳性反应。结论 pQE30-CFPl0-ESAT-6 DH5α菌能高效表达rCFPl0-ESAT-6融合蛋白，该蛋白兼具CFPl0和ESAT-6两种蛋白的抗原性，能特异性区分豚鼠因H37Rv感染和BCG免疫后产生的抗结核分枝杆菌抗体。本研究为rCFPl0-ESAT-6融合蛋白在结核病血清学诊断中的应用奠定了基础。