突变DJ-1转基因小鼠模型的建立

目的 探讨DJ-1~(L166P)突变基因在帕金森病发生中的作用.方法 构建pcDNA3.1-myc-his-DJ-1~(L166P)真核表达载体,利用显微注射方法将DJ-1~(L166P)基因片段(约3.9 kb)导入BDF1小鼠受精卵雄原核并移植到同期受孕的ICR假孕母鼠输卵管中,对产出仔鼠的鼠尾组织DNA进行聚合酶链反应和Southern blot检测,对Southern blot鉴定阳性的转基因小鼠进行逆转录聚合酶链反应和Western blot检测.结果 共产生20只子代小鼠,1号和7号为DJ-1~(L166P)转基因阳性小鼠.1号转基因小鼠大脑、小脑、肝、肺、肾、睾丸有不同程度的DJ-1 mRNA表达,均高于正常对照小鼠,但只有大脑中DJ-1 mRNA的表达水平显著高于正常对照小鼠(P<0.05);7号转基因小鼠只有肝、肺组织中有DJ-1 mRNA表达,也高于正常对照小鼠,但差异无统计学意义.只有1号小鼠大脑有His标签蛋白的表达.结论 成功获得1只DJ-1~(L166P)基因突变转基因小鼠模型,为课题的下一步实验研究打下良好的基础.     

基于pMTR1质粒的转基因小鼠突变研究模型的建立

建立在基因组中整合有ｐＭＴＲ１质粒的Ｃ５７ＢＬ／６转基因小鼠家系,为体内基因突变研究提供有效的动物模型。方法：利用分子克隆技术构建ｐＭＴＲ１质粒。将其线性性化后,用显微注射注射入５７２只Ｃ５７ＢＬ／６小鼠受精卵,再将它们分别移入４５只受体母鼠的输卵管中,共产仔４４只,存活３５只,采用ＰＣＲ,ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交三级筛选法鉴定子代小鼠。以４只经基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂     

Dicer 1转基因小鼠模型的建立

目的 建立Dicer1转基因小鼠模型.方法 构建pcDNA3.I-Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导人BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR受体母鼠输卵管内.出生后仔鼠用PCR和Southern方法检测鼠尾DNA鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer1基冈表达.结果 显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR检测获得6只阳性鼠,Southern榆测6只均为阳性.对Southern检测阳性转基因小鼠子代进行RT-PCR检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达.对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常.结论 成功建立Dicer1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER1基因功能及miRNA的表达及功能等奠定基础.     

转基因小鼠模型在特应性皮炎中的应用研究进展

特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一种慢性、复发性皮肤炎症性疾病,易反复发作,伴剧烈瘙痒,严重影响了患者的生活质量,近年来发病率呈逐年升高的趋势。该病确切发病机制尚不清楚,可能涉及遗传、免疫、感染等众多因素。     

EB病毒早期基因BHRF1转基因模型鼠的建立

目的构建稳定表达EB病毒早期基因BHRF1蛋白的重组载体,通过显微注射法建立BHRF1转基因鼠模型。方法自EBV阳性细胞系B95-8提取总RNA,应用RT-PCR扩增BHRF1基因,然后与pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1-BHRF1重组载体。重组载体用NruⅠ和DraⅢ双酶切,电泳后纯化回收长约2000 bp的目的片段溶于显微注射缓冲液。从超排小鼠取健康受精卵,通过显微注射技术,将纯化的CMV+BHRF1+polyA DNA片段注射入小鼠受精卵,短暂培养后选择健康受精卵移入假孕母鼠输卵管内。采用PCR检测子鼠鼠尾组织DNA,鉴定筛选BHRF1阳性首建鼠。结果经PCR、限制性内切酶鉴定及测序证实pcDNA3.1-BHRF1重组载体构建成功,DraⅢ和NruⅠ双酶切获得长约2 000 bp的CMV+BHRF1+polyA DNA片段。自18只见栓超排小鼠获取健康受精卵480枚,分别注入纯化的目的片段,经短暂培养后390枚受精卵仍健康,移入14只假孕母鼠输卵管内,11只受孕,产下74只子鼠。PCR检测子鼠鼠尾DNA获得16只阳性首建鼠,阳性率为21.6%(16/74)。结论本实验首次建立了BHRF1转基因鼠模型,为深入研究BHRF1的生物学特性及其在EBV相关肿瘤发生发展中的作用提供了理想的动物模型。     

人乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立

目的 建立人乙型肝炎病毒ｘ（ＨＢｘ）基因转基因小鼠模型。方法 用显微注射法制备转基因小鼠,用分子杂交法鉴定转基因小鼠ＨＢｘ的整合与表达。结果 建立了人ＨＢｘ的基因转基因小鼠模型。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定得到１７只转基因首建鼠。逢肝脏提取总ＲＮＡ进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交,结果显示１７只首建鼠肝脏中均有ＨＢｘ表达。结论 为从整体水平研究慢性乙肝炎患者诱发肝癌的作用机制及ＨＢｘ的反式激活作用机制提供了     

人子宫内膜异位症NOD-SCID鼠模型的建立

目的　探讨采用人在位子宫内膜及异位子宫内膜建立子宫内膜异位症动物模型的可行性。方法　获取人分泌晚期在位子宫内膜及人异位子宫内膜种植于NOD -SCID鼠腹部皮下 ,随机分成 4组 ,分别在 2、4、6、8周取出其皮下移植物行病理检查。结果　 3 2只小鼠均存活 ,有 15只小鼠皮下在位内膜移植物经HE染色可见明显的子宫内膜腺体和间质 ,成功率为 93 .75 %。而异位内膜移植物仅见到纤维结缔组织。结论　用人在位内膜建立NOD -SCID小鼠子宫内膜异位症模型成功率高 ,模型性状显著且稳定。     

四环素调控SV40Tag转基因小鼠模型的建立

目的构建四环素调控的SV40T转基因小鼠模型。方法同时显微注射外源基因p205-rtTA-C3和pTRE-Tag至FVB小鼠原核,注射受精卵移植到同期发情的假孕受体出生个体,经PCR和Southern检测获得阳性转基因小鼠。结果经PCR结合Southern检测得到rtTA和Tag双阳性转基因小鼠一只,rtTA单阳性两只和Tag单阳性一只。结论通过饮水给与四环素的双阳性小鼠可在卵巢中检测到Tag mRNA的表达。     

激肽释放酶转基因大鼠模型的建立

目的建立KLK1转基因大鼠模型。方法腹腔注射PMSG-HCG（150-150IU/kg）超排不同周龄（4-8周）SD大鼠比较超排效果的差异，以可用于注射胚胎数作为评判标准确定最佳超排周龄。构建pBC-klk1转基因构件，经酶切、纯化后通过显微注射方法导入SD大鼠受精卵原核并移植到同期受孕的SD受体母鼠输卵管内。出生后仔鼠用PCR和Southern方法检测鼠尾DNA鉴定基因型，通过RT-PCR和免疫组化方法检测klk1基因表达。结果4-8周SD大鼠超排后分别获得受精卵14±14.8、30±15.2、13.3±13.7、13±14.7、8±5.7，5周龄大鼠超排效果最好，与其他周龄大鼠相比有显差异，P〈0.05；显微注射1538枚卵，移植685（44.53%）枚卵于31只受体输卵管中，12（12/31，38.7%）只怀孕，共产仔62只，经PCR检测获得6只阳性鼠，Southern检测3只阳性。对Southern检测阳性转基因大鼠子代进行RT-PCR检测和免疫组化分析证明klk1基因在肾脏、胰腺和乳腺内表达。结论成功建立klk1基因表达的转基因大鼠模型，该模型是高血压病研究的理想动物模型。     

IRM-2小鼠移植性肿瘤模型的生物学特性

目的 观察IRM-2小鼠和C57BL/6小鼠接种Lewis肺癌生物学特性的对比研究.方法 取肿瘤组织研磨,用生理盐水稀释成2×106/mL,取细胞悬液接种于IRM-2小鼠和C57BL/6小鼠腋下,0.2 mL/只.观察两品系肿瘤生长、荷瘤鼠生存时间,外周血细胞及病理指标变化.结果 两品系小鼠成瘤率均是100%,荷瘤鼠存活时间无明显差异,IRM-2小鼠荷瘤鼠体重净增长明显高于C57BL/6荷瘤小鼠(P＜0.05).白细胞分类及病理指标变化无明显差别.结论 IRM-2小鼠与C57BL/6小鼠Lewis肺癌模型生物学特性基本一致,IRM-2小鼠可以建立稳定的Lewis肺癌肿瘤模型应用于实验研究.     

利用雌激素构建小鼠淋病奈瑟菌感染模型

目的探讨用雌激素构建淋病奈瑟菌感染小鼠模型的方法。方法淋病奈瑟菌WHO-A接种经皮下注射苯甲酸雌二醇和真皮下埋植尼尔雌醇片（雌三醇）预处理的雌性ICR小鼠，小鼠阴道拭子接种T-M选择培养基培养分离淋病奈瑟菌，取小鼠阴道分泌物涂片染色观察淋病奈瑟菌感染情况，比较两种雌激素对小鼠淋病奈瑟菌感染的差异。结果与对照组相比，苯甲酸雌二醇小鼠体内淋病奈瑟菌有短时间的定植，而尼尔雌醇组与对照组无差异。结论雌激素（尤其是雌二醇）有利于淋病奈瑟菌在小鼠阴道内的定植。     

江西省实验动物科技工作现状及发展对策思考

遵照省科技厅赣科发财字[2003]263号文件的精神，我们组成了3个调查组分别于2004年2月对全省实验动物科技工作进行了一次较全面的现场调查。现就调查了解到的基本情况并根据调查反馈的资料所反映的我省实验动物科技工作现状，提出今后的发展对策报告如下。     

血管性痴呆大鼠模型的制备与评价

目的探讨制备理想的血管性痴呆动物模型方法。方法采用反复大鼠双侧颈总动脉缺血再灌注加剪尾放血法制备血管性痴呆大鼠模型，并对其进行行为学和生化学评价。结果行为学检测结果表明，血管性痴呆大鼠有明显的学习、记忆障碍，且该组大鼠海马组织乙酰胆碱含量持续降低。结论本方法可制备理想的血管性痴呆动物模型，用于血管性痴呆的基础研究及药物筛选或疗效评价。     

人急性早幼粒细胞白血病SCID小鼠模型的建立

目的探讨建立人急性早幼粒细胞白血病小鼠模型的有效方法。方法将4～6周SCID鼠随机分成A、B两组,A组为非照射组、B组为照射组,两组均为每只尾静脉注射2×106HL-60细胞株,每周检测小鼠外周血白细胞计数、外周血涂片人白血病细胞阳性率、病理组织学检测小鼠瘤细胞弥散生长浸润肝、脾等器官情况。结果注射3周后两组外周血白细胞计数两组差异无显著性。但外周血涂片人白血病早幼粒细胞细胞阳性率分别为8.3%、5.4%,B组高于A组(P<0.05)。而病理组织学证实两组小鼠注射瘤细胞28d后均有器官浸润如肝、脾、肾肺等,且B组远较A组广泛而严重。结论照射组和非照射组Scid小鼠静脉2×106HL-60细胞株均能建成人类粒细胞白血病小鼠模型。照射组更能模拟临床白血病累及骨髓和弥漫生长特点,是一个体内研究人类白血病发病机理及实验治疗良好的模型。     

大鼠慢性萎缩性胃炎模型的建立

目的建立大鼠慢性萎缩性胃炎（CAG）模型。方法饮用及灌胃给予20 mmol/L去氧胆酸钠和30%、60%乙醇13周。检测大鼠胃粘膜组织病理变化及生化指标。结果模型组大鼠胃窦粘膜的炎症指数明显增加,胃窦固有腺厚度和面积明显缩小;游离酸和总酸浓度明显降低,游离粘液量和胃蛋白酶活性明显升高,血清胃泌素及丙二醛含量明显升高,白细胞介素-2及超氧化物歧化酶活性明显降低。结论成功建立了CAG动物模型,为慢性萎缩胃炎疾病的研究提供了一种理想的动物模型。     

血红素加氧酶-1显性负性突变体转基因小鼠模型的建立与鉴定

目的对泰泽病原体nested—PCR检测方法进行优化和应用研究。方法以感染泰泽病原体RJ株的大鼠肝组织作为阳性对照,按国标GB/T 14926．10—2008《实验动物泰泽病原体检测方法》间接免疫荧光检测fIFA）呈阳性的上海地区大鼠肝组织为材料,对本室已建立的泰泽病原体nested—PCR检测方法中的DNA抽提方法和PCR过程进行优化,并应用于22只免疫抑制实验动物的泰泽病原体检测。结果肝脏组织DNA以酚／氯仿抽提法为好;nested—PCR出现196bp的特异性条带,此方法的敏感性达1pg;产物纯化后进行测序比对分析显示,上海地区实验大鼠感染样品以及RJ株感染样品的序列均与Genbank中泰泽病原体16S rRNA（Genbank D14638．1）的同源性为100％。应用研究表明,22个样品中IFA检测阳性样品8个,阳性率为36．4％;Nested-PCR检测阳性样品13个,包含所有的IFA阳性样品,阳性率为59．1％。结论本方法灵敏度高,特异性强,经进一步应用改进后,可用于泰泽病原体的检测。     

实验用猪急性心肌梗死模型的制备

目的：探讨经皮冠状动脉内球囊封堵法建立实验用猪急性心肌梗死模型的可行性及有效性。方法：健康家猪14只，3～5月龄，体重25～40kg（35．5±6．6）。麻醉后穿刺股动脉，行冠脉造影后沿血管送冠脉球囊至冠状动脉左前降支（LAD）近中段，即第二间隔支动脉分出处。动物随机分为2组，A组动物（n=7）行缺血预适应处理，依次扩张球囊阻断前向血流1、2、5min，每次间隔60s，然后扩张60min，扩张压力为2atm。B组动物（n=7）不行缺血预适应处理，直接扩张球囊阻断前向血流扩张60min，扩张压力为2atm。建立模型前、建立模型后1h行心脏MRI及心电图检查，术中行心电监护。结果：成功建立猪心肌梗死模型12例，B组动物死亡2例。术中共有12例动物发生室颤，其中10例经过电复律等抢救成功转复。12例建模成功动物术中心电图出现急性心肌梗死典型图形变化，术后心脏MRI检查出现间隔及前壁首过灌注缺损，延迟强化。结论：经皮腔内冠脉球囊封堵冠状动脉可以建立实验用猪急性心肌梗死模型，缺血预处理可提高建模成功率。     

小鼠代谢性高尿酸血症模型的复制方法初探

目的本实验分别单独使用或联合使用次黄嘌呤、尿酸氧化酶抑制剂复制小鼠代谢性高尿酸血症模型，观察造模后受试动物血清尿酸值的变化，以确定次黄嘌呤、尿酸氧化酶抑制剂造模的最佳方式、给药途径和剂量，并通过阳性药验证该模型的可行性。方法采用次黄嘌呤灌胃或腹腔注射给药，尿酸氧化酶抑制剂腹腔或皮下注射给药，分别测定造模后不同时段小鼠血尿酸值。结果复制小鼠高尿酸血症模型，采用腹腔注射次黄嘌呤500mg／kg，皮下注射尿酸氧化酶抑制剂50mg／kg，1、3、5h后，血尿酸值明显高于正常组（P〈0．01），且阳性药可显著降低升高的尿酸值（P〈0．01）。结论腹腔注射次黄嘌呤500mg／kg和皮下注射尿酸氧化酶抑制剂50mg／kg配合使用，是复制小鼠高尿酸血症模型的适当组合。