脂多糖刺激后腹腔巨噬细胞表面Toll样受体表达的变化

目的探讨LPS刺激后小鼠腹腔巨噬细胞表面TLR2、TLR4表达的动态变化。方法常规方法从BALB/C小鼠腹腔中分离出巨噬细胞,调整细胞数为2×106/孔,分为6组,每组设3个复孔,加入LPS使其终浓度为1μg/ml,在终浓度为1μg/mlLPS刺激下,5%CO2,37℃孵育0、1.5、3、6、16、24h。用异硫氢酸荧光素(FITC)标记的大鼠抗小鼠TLR2抗体和藻红蛋白(PE)标记的大鼠抗小鼠TLR4抗体对小鼠腹腔巨噬细胞进行免疫荧光染色,流式细胞仪(FCM)测定FITC、PE阳性细胞数及其平均荧光强度(MFI)。结果1.随着LPS刺激时间的延长,TLR2阳性率逐步上升,6h达到高峰后出现缓慢下降趋势,各刺激组阳性率与对照组组相比,P<0.01。TLR2MFI则随着LPS刺激时间的延长而缓慢下降,各刺激组与对照组相比,P<0.05。2.随着LPS刺激时间的延长,TLR4阳性率逐步上升,刺激达24h时,阳性率为14.02%±1.23%,与对照组(8.98%±1.06%)相比,P<0.01。TLR4MFI也随着刺激时间的延长而上升,各刺激组与对照组相比,P<0.05。结论LPS能够引起巨噬细胞TLR2/4表达和分布发生变化,说明TLR2与TLR4均参与针对LPS的反应。     

LPS刺激后小鼠巨噬细胞Toll样受体(TLR)4及肿瘤坏死因子α表达的变化

革兰阴性菌败血症休克的发生主要是因为免疫系统对细菌LPS应答,产生过量细胞因子和炎性介质从而引起组织和器官损害。研究发现与果蝇Toll蛋白类似的哺乳动物Toll样受体家族在宿主防御中起重要作用,其中TLR4介导针对LPS的免疫应答。它们对病原体的保守结构产生应答并且激活单核细胞和中性粒细胞产生细胞因子和炎性介质。本研究观察LPS刺激后体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞表面TLR4表达及最重要的炎性细胞因子之一的肿瘤坏死因子α分泌水平的变化。方法常规方法从BALB/C小鼠腹腔中分离出巨噬细胞（Mφ）,细胞分为6组,分别加入LPS使其终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10μg/ml,5%CO2,37℃孵育2h。流式细胞术测定Mφ表面TLR4的表达。同时取培养液上清采用ELISA方法检测TNFα。实验重复三次。结果①经0.01μg/mlLPS刺激的MφTLR4-PE阳性率与0μg/mlLPS组相比,P〈0.05。其它浓度刺激组TLR4阳性率则与对照组无差异,P〉0.05。Mφ细胞TLR4MFI随着LPS浓度的升高而增强,除了10μg/mlLPS组,其余各组MFI与对照组相比,P〈0.05。②随着LPS浓度增加,TNFα分泌量逐渐升高,呈剂量依赖关系。但当LPS浓度达10μg/ml时,TNFα分泌量下降。结论LPS能够诱导Mφ胞膜表面TLR4表达和TNFα分泌升高,并且在一定浓度范围内呈量-效关系.     

机械通气对大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体4表达的影响

目的 探讨机械通气对大鼠肺泡巨噬细胞（AM）表面Toll样受体4（TLR4）表达的影响。方法 清洁级成年雄性SD大鼠18只，随机分为自主呼吸组（R组，n=6）、小潮气量（VT）机械通气组（M组，n=6）和大VT机械通气组（N组，n=6）。腹腔注射质量分数为20％的乌拉坦8mg／kg麻醉大鼠，行气管插管。机械通气呼吸机参数设定：M组：VT为6ml／kg，N组VT为40ml／kg，吸：呼为1：1，呼气末正压（PEEP）为0，吸入氧浓度（FiO2）为0．21。调整呼吸频率和潮气末二氧化碳分压（PETCO2）维持在35～45mmHg（1mmHg=0．133kPa）。实验3h结束，放血处死大鼠。监测实验开始及实验1、2和3h时动脉血气分析；并测定大鼠肺组织病理形态学积分、湿／干重（W／D）比值及支气管肺泡灌洗液（BALF）中自细胞计数（WBC）和肺蛋白通透性系数。用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）测定AM表面的TLR4mRNA表达，用免疫组化法测定AM表面的TLR4蛋白表达。结果 N组实验1h时存在过度通气，pH升高、动脉血二氧化碳分压（PaCO2）降低（P均〈0．05），其他指标都在正常范围内。与R组比较，N组肺组织病理形态学积分、W／D比值，BALF中WBC和肺蛋白透性系数以及TLR4蛋白表达和TLR4mRNA表达均显著升高（P均〈0．01）；M组改变差异均无显著性（P均〉0．05）。结论 大VT机械通气导致大鼠肺损伤，并使AM表面TLR4表达明显上调。小VT机械通气可避免上述改变的发生。     

LPS刺激后小鼠巨噬细胞Toll样受体(TLR)4及肿瘤坏死因子α表达的变化(英文)

革兰阴性菌败血症休克的发生主要是因为免疫系统对细菌LPS应答,产生过量细胞因子和炎性介质从而引起组织和器官损害。研究发现与果蝇Toll蛋白类似的哺乳动物Toll样受体家族在宿主防御中起重要作用,其中TLR4介导针对LPS的免疫应答。它们对病原体的保守结构产生应答并且激活单核细胞和中性粒细胞产生细胞因子和炎性介质。本研究观察LPS刺激后体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞表面TLR4表达及最重要的炎性细胞因子之一的肿瘤坏死因子α分泌水平的变化。方法常规方法从BALB/C小鼠腹腔中分离出巨噬细胞(Mφ),细胞分为6组,分别加入LPS使其终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10μg/ml,5%CO2,37℃孵育2h。流式细胞术测定Mφ表面TLR4的表达。同时取培养液上清采用ELISA方法检测TNFα。实验重复三次。结果①经0.01μg/mlLPS刺激的MφTLR4-PE阳性率与0μg/mlLPS组相比,P<0.05。其它浓度刺激组TLR4阳性率则与对照组无差异,P>0.05。Mφ细胞TLR4MFI随着LPS浓度的升高而增强,除了10μg/mlLPS组,其余各组MFI与对照组相比,P<0.05。②随着LPS浓度增加,...     

内毒素血症小鼠骨骼Toll样受体4基因的变化

目的 通过检测内毒素血症模型动物骨骼相关基因表达变化,进一步明确内毒素对机体的损害机制,为下一步研究骨骼变化对脏器产生何种影响奠定基础.方法 腹腔注射内毒素脂多糖(LPS)制作内毒素血症小鼠模型.将48只小鼠随机分为正常组和LPS处理4、6、8、12、24、48和72 h组,每组6只.采尾血计数全血白细胞;取眼眶血检测肝、肾功能;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测骨骼中TLR4 mRNA表达;苏木素-伊红(HE)染色,镜下观察骨骼病理学变化.结果 与正常组比较,LPS 4 h组白细胞计数显著下降(P＜0.01),之后逐渐升高,于72 h时显著高于正常组(P＜0.05);LPS 4 h和6 h组丙氨酸转氨酶(ALT)水平显著升高(P均＜0.05),于8 h降至正常水平(P＞0.05);LPS 6 h组血尿素氮(BUN)水平逐渐升高(P＜0.05),于8 h达峰值(P＜0.05),然后下降,12 h趋于正常(P＞0.05);LPS 6 h组TLR4 mRNA表达增加(P＜0.01),24 h达峰值(P＜0.01),然后逐渐下降,72 h仍处在较高水平(P＜0.05).LPS作用于骨骼后,HE染色显示骨骼无明显改变.结论 内毒素血症中骨骼TLR4 mRNA表达量显著增加.     

双歧杆菌干预对实验性末端回肠炎肠上皮细胞 Toll 样受体2和Toll 样受体4表达的影响

目的 建立回肠-盲肠侧侧吻合术导致的实验性末端回肠炎动物模型以及双歧杆菌干预模 型,观察Toll 样受体(TLR)2 和TLR4 在双歧杆菌干预下的表达,研究双歧杆菌对实验性末端回肠炎的保护 作用.方法 清洁级SD 雄性大鼠100 只,随机分为五组:正常对照组(A)、模型对照组(B)、双歧杆菌低剂量 干预组(C)、中剂量干预组(D)及高剂量干预组(E),每组20 只.观察这五组大鼠末端回肠的炎症情况,行 镜下肠组织病理学评分(HS),使用免疫组化法检测各组末端回肠黏膜中TLR2、TLR4 的表达.结果 (1)肉 眼观察,模型对照组与双歧杆菌干预组及空白对照组相比,炎症评分有统计学差异(P <0.05).(2)镜下观 察,模型对照组与双歧杆菌干预组及空白对照组相比,炎症评分差异有统计学意义(P <0.05).(3)造模对 照组肠上皮细胞TLR2 和TLR4 的平均吸光度值较其余四组高(P <0.05);在双歧杆菌干预下,干预组TLR2 和TLR4 的平均吸光度值低于B 组(P <0.05).结论 使用双歧杆菌干预可降低实验性末端回肠炎肠组织 TLR2、TLR4 的表达,双歧杆菌对实验性末端回肠炎有保护作用.     

Toll样受体2在分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用

目的建立分枝杆菌感染巨噬细胞的模型,探讨Toll样受体2(TLR2)在分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用。方法使用豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)诱导U937细胞分化使之具有吞噬能力,分别用胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、结核分枝杆菌(MTB)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)感染已分化的U937细胞,于感染后0、4、8、24、48和72h提取细胞,用流式细胞仪检测u937细胞凋亡率及细胞膜TLR2的表达,Western blot检测U937细胞感染后72 h时细胞内总TLR2的含量,并观察阻断TLR2后U937细胞感染分枝杆菌后的凋亡变化。结果 M.intracellulare M.abscessus感染U937细胞后的细胞凋亡率随时间的推移逐渐升高,4h后凋亡率已显著高于正常对照组,而MTB感染后的细胞凋亡率也有升高但与正常对照组差异无统计学意义;3种分枝杆菌感染U937细胞后的细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.05),由高到低的排列依次为M.abscessus、M.intracellulare和MTB。U937细胞的TLR2表达量在分枝杆菌感染后4 h内迅速升高,8 h后TLR2的含量稳定下来,不同分枝杆菌感染U937细胞后TLR2的表达并不相同(P<0.05),由高到低的排列依次为MTB、M.intracellulare和M.abscessus。阻断U937细胞的TLR2可以明显降低感染分枝杆菌后细胞的凋亡率。结论 TLR2并不直接引起巨噬细胞的凋亡,但TLR2在分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中有重要作用。     

Toll样受体4与急腹症

Toll样受体4(TLR4)为研究最广的先天性免疫受体,主要与免疫、感染相关;已证明与多种感染性疾病、急性脏器损伤及某些肿瘤相关。近年来发现TLR4与新生儿坏死性小肠结肠炎、急性胰腺炎、腹膜炎等急腹症密切相关。现对其研究进展加以综述,为急腹症进一步的研究提供向导。     

幽门螺杆菌内毒素分子对肝细胞Toll样受体2表达的影响

目的:探讨幽门螺杆菌(Hp)内毒素分子对肝细胞Toll样受体2表达的影响.方法:Hp培养及提取内毒素,应用体外培养技术培养肝癌细胞株HepG2,将内毒素和HepG2混合孵育,采用免疫组化法检测Toll样受体2在细胞上表达的水平.结果:不同浓度的内毒素作用于HepG2细胞24 h后均有Toll样受体2表达,不同浓度内毒素实验组肝组织上的Toll样受体2表达均比对照组明显增强.结论:脂多糖可能与肝细胞Toll样受体2结合,促使肝细胞Toll样受体2表达上调,参与肝脏疾病的发病机制.     

脂多糖刺激前后小鼠肺肝脾组织中Toll样等受体基因表达情况

目的了解脂多糖(LPS)对肺、肝、脾组织中与LPS信号转导有关的受体的基因表达情况的影响。方法LPS刺激前后取小鼠肺、肝、脾组织总RNA，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量测定脂多糖结合蛋白(LBP)、CD14、Toll样受体2(TLR2)、TLR4和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等基因的表达情况。结果正常组织中，肺有TLR2的表达，肝有TLR2、CD14、LBP的表达，脾有TLR2的表达；注射LPS后的5h内，肺组织TLR2、TLR4、CD14和TNF-α，肝组织TLR2、CD14、LPB和TNF-α，脾组织TLR2、TLR4、CD14和TNF-α的基因表达均呈逐渐增加趋势。结论正常情况下TLR2等基因在不同组织中的表达有差异，LPS刺激5h内各基因的表达提高，从而提高机体对LPS等病原体模式识别分子的反应性。     

腹腔巨噬细胞在创伤后胰岛素抵抗中的作用

目的　研究小鼠创伤后腹腔巨噬细胞对胰岛素、胰岛素敏感性以及骨骼肌葡萄糖摄取量的影响 ;腹腔巨噬细胞在创伤后胰岛素抵抗中的作用。方法　将 4 0只健康C5 7BL/6J小鼠随机分为创伤组、培养液对照组、正常细胞对照组、实验组。使用DMEM培养液培养ANA - 1细胞。取部分ANA - 1细胞 ,装入透析袋中密闭 ,并置入创伤组小鼠腹腔内 ,然后行小鼠背部 15 %～ 2 0 %Ⅲ度烧伤。烧伤后 4h收集透析袋内ANA - 1细胞并注入实验组小鼠腹腔内 ;收集正常培养的ANA - 1细胞同样注入正常细胞对照组 ;培养液对照组腹腔注入同量DMEM培养液。 4h后分别采血和分离比目鱼肌。测定血糖和血清胰岛素以及离体骨骼肌葡萄糖摄取量。结果　正常细胞对照组与培养液对照组的血糖、血清胰岛素、胰岛素敏感指数 (ISI)、骨骼肌基础葡萄糖摄取量和胰岛素刺激下葡萄糖摄取量均无明显差异 ;实验组的血糖、血清胰岛素水平及骨骼肌基础葡萄糖摄取量显著高于正常细胞对照组和培养液对照组 ,而ISI水平及胰岛素刺激下的葡萄糖摄取量与正常细胞对照组和培养液对照组相比显著降低。结论　未激活的腹腔巨噬细胞对机体无明显影响 ,而创伤后激活的腹腔巨噬细胞可使正常小鼠产生明显的胰岛素抵抗 ,胰岛素敏感性和反应性显著降低 ,表明创伤后胰岛素抵抗与腹     

Expression of transferrin receptors by monocytes and peritoneal macrophages from renal failure patients treated by continuous ambulatory peritoneal dialysis (CAPD)

Approximately 20% of monocytes and peritoneal macrophages from renal failure patients undergoing continuous ambulatory peritoneal dialysis (CAPD) were transferrin-receptor (TfR) positive by immunofluorescence, whereas cells from normal controls were generally TfR negative, as were monocytes from rheumatoid arthritis patients and from renal failure patients treated by haemodialysis. There was a significant correlation between the length of time on CAPD and the proportion of TfR-positive blood monocytes. CAPD peritoneal macrophages possessed 6.7-37.1 x 10(3) transferrin binding sites per cell, with a Ka of 3-25 x 10(7) mol l-1. In culture, monocytes from CAPD patients showed a progressive decrease in TfR expression, while in contrast about 20% of monocytes from normal controls which were originally 100% TfR negative expressed TfR after 3 days in culture. These findings indicate that regulation of TfR in monocytes/macrophages is complex, and that frequent removal of peritoneal cells during dialysate exchange may place a strain on the bone marrow, resulting in the release of an increasingly immature population of TfR positive monocytes to the circulation in CAPD patients.     

Dectin-1和TLR2/TLR3/TLR4受体在免疫缺陷小鼠侵袭性肺曲霉菌病的表达

目的本研究利用小鼠动物模型,探讨烟曲霉感染免疫缺陷小鼠TLR2/TLR3/TLR4对树突状细胞植物血凝素-1(Dectin-1)表达的影响。通过检测TLRs和CLRs受体在不同免疫状态下的表达,揭示介导侵袭性肺曲霉菌病(IPA)肺损伤的关键受体。方法小鼠随机分成四组,A组为正常对照组;B组为环磷酰胺免疫抑制+未接种烟曲霉菌;C组正常状态小鼠+烟曲霉菌接种;D组为IPA感染组,免疫抑制+烟曲霉菌接种。采用real-time PCR方法进行小鼠肺组织各个时相点的TLR2、TLR3、TLR4、Dectin-1和β-actin m RNA的表达,检测受体间的相互表达调控。结果正常状态感染组(C组N+AF),TLR4/TLR2、Dectin-1 m RNA比正常对照组表达上调;IPA模型组(D组CP+AF),Dectin-1和TLR4、TLR2 m RNA比正常状态感染组表达下调;但TLR3 m RNA 48 h、72 h表达没有明显不同(P>0.05)。病理切片模型组小鼠72 h可见较严重的出血和充血;96 h时肺内有菌丝,肺泡间隔增宽,支气管壁破坏。正常状态感染烟曲霉小鼠72 h可见充血,肺泡弹性纤维破坏。结论成功建立了小鼠IPA动物模型,Dectin-1受体表达下调可能是环磷酰胺免疫抑制引起IPA的机制之一。Dectin-1的表达可能是建立在TLR2/TLR4对烟曲霉早期识别的基础上,TLR3可能起协同作用。     

The matrix component biglycan is proinflammatory and signals through Toll-like receptors 4 and 2 in macrophages

Biglycan, a small leucine-rich proteoglycan, is a ubiquitous ECM component; however, its biological role has not been elucidated in detail. Here we show that biglycan acts in macrophages as an endogenous ligand of TLR4 and TLR2, which mediate innate immunity, leading to rapid activation of p38, ERK, and NF-kappaB and thereby stimulating the expression of TNF-alpha and macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2). In agreement, the stimulatory effects of biglycan are significantly reduced in TLR4-mutant (TLR4-M), TLR2-/-, and myeloid differentiation factor 88-/- (MyD88-/-) macrophages and completely abolished in TLR2-/-/TLR4-M macrophages. Biglycan-null mice have a considerable survival benefit in LPS- or zymosan-induced sepsis due to lower levels of circulating TNF-alpha and reduced infiltration of mononuclear cells in the lung, which cause less end-organ damage. Importantly, when stimulated by LPS-induced proinflammatory factors, macrophages themselves are able to synthesize biglycan. Thus, biglycan, upon release from the ECM or from macrophages, can boost inflammation by signaling through TLR4 and TLR2, thereby enhancing the synthesis of TNF-alpha and MIP-2. Our results provide evidence for what is, to our knowledge, a novel role of the matrix component biglycan as a signaling molecule and a crucial proinflammatory factor. These findings are potentially relevant for the development of new strategies in the treatment of sepsis.     

TLR2、TLR4、TLR5和TLR9在小鼠Hp感染模型中的表达

目的:研究BALB/c小鼠在幽门螺杆菌(Hp)感染前后和用抗生素治疗后胃黏膜组织中Toll样受体(TLR)2、TLR4、TLR5、TLR9、IL-1β的表达,探讨Toll样受体家族在Hp感染机制中的作用。方法:60只BALB/c小鼠随机分为3组,第1组不予处理(正常组),第2组予感染Hp(Hp感染组),第3组感染Hp后予抗生素治疗(抗生素治疗组)。RT-PCR和Western blotting法半定量检测小鼠胃内TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、IL-1β的表达,Giemsa染色切片计数Hp定植数量,HE染色切片判断黏膜炎症水平。结果:(1)TLR5、TLR9在各组小鼠胃黏膜组织中均无表达。(2)TLR2在Hp感染组胃黏膜组织中表达(PCR:0.13±0.025;Western:1.32±0.27)高于抗生素治疗组(PCR:0.04±0.011;Western:0.43±0.08),正常组无表达。(3)TLR4在Hp感染组胃黏膜组织中表达(PCR:0.22±0.051;Western:0.72±0.17)高于抗生素治疗组(PCR:0.06±0.009;Western:0.21±0.04),正常组无表达。(4)IL-1β在Hp感染组胃黏膜组织中有表达(PCR:0.27±0.038;Western:0.58±0.14),抗生素治疗组和正常组无表达。结论:TLR2、TLR4可能参与了Hp的致病机制,TLR5、TLR9可能未参与Hp的致病机制。     

5-脂氧合酶在体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞中的表达

目的　探讨 5 脂氧合酶 (5 LO)在体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞中的表达。方法　分离大鼠腹腔巨噬细胞培养一定时间 ,用高效液相色谱、Westernblot和RT PCR分别观察 5 LO催化的代谢产物的生物合成、5 LO和 5 脂氧合酶激活蛋白 (FLAP)表达的变化 ,并用毛细管电泳定量分析RT PCR产物。结果　体外培养 2 4h对 5 LO以及FLAP的表达没有明显影响 ,5 LO酶活性没有明显的变化 ;培养到第 72小时 ,5 LOmRNA和蛋白表达没有明显的影响 ,但FLAP几乎检测不到 ,mRNA的量明显降低 ,检测不到白三烯B4(LTB4)和 5 羟二十碳四烯酸 (5 HETE)。进一步培养到第 12 0小时 ,5 LO的mRNA和蛋白表达明显下降 ,FLAP的mRNA和蛋白检测不到。毛细管电泳定量分析结果显示 ,培养 1、2 4和 72h ,5 LO的相对表达量没有明显变化 ,培养到 12 0h则下降了约 80 %。结论　 5 LO可以在体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞中稳定表达 72h。     

5-脂氧合酶在体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞中的表达

目的 探讨5-脂氧合酶(5-LO)在体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞中的表达。方法 分离大鼠腹腔巨噬细胞培养一定时间，用高效液相色谱、Western blot和RT—PCR分别观察5-LO催化的代谢产物的生物合成、5-LO和5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)表达的变化，并用毛细管电泳定量分析RT—PCR产物。结果 体外培养24h对5-LO以及FLAP的表达没有明显影响，5-LO酶活性没有明显的变化；培养到第72小时，5-LO mRNA和蛋白表达没有明显的影响，但FLAP几乎检测不到，mRNA的量明显降低，检测不到白三烯B4(LTB4)和5-羟二十碳四烯酸(5-HETE)。进一步培养到第120小时，5-LO的mRNA和蛋白表达明显下降，FLAP的mRNA和蛋白检测不到。毛细管电泳定量分析结果显示，培养1、24和72h，5-LO的相对表达量没有明显变化，培养到120h则下降了约80％。结论 5-LO可以在体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞中稳定表达72h。