四甲基偶氮唑盐法观察三水白虎汤血清对体外培养关节炎滑膜细胞增殖的影响

目的采用四甲基偶氮唑盐比色法观察三水白虎汤含药血清对体外培养热痹证型关节炎滑膜细胞增殖的影响.方法实验于2006-06/09在南方医科大学动物实验中心、中医药学院实验中心及组织工程研究中心完成.实验材料滑膜组织取自南方医院脊柱外科收治的膝骨关节炎患者(女,68岁)行膝关节镜手术中切除的滑膜组织,患者知情同意.SPF级45 d龄Wistar雌性大鼠15只,体质量(120±10)g.三水白虎汤中草药制剂(由南方医院中药房提供,主要成分水牛角、寒水石、白芥子、虎杖、鸡血藤等),来氟米特片(由美国欣凯公司提供).实验分组大鼠随机分为三水自虎汤组、来氟米特组以及生理盐水组,分别给予相应药液灌胃7 d,制取含药血清.细胞培养实验共分4组,包括正常对照组以及三水白虎汤组、来氟米特组、生理盐水组3组含药血清组.实验干预滑膜采自膝骨关节滑膜炎滑膜组织,采用体外细胞组织块培养技术,含药血清法接种培养.将第4代的滑膜细胞浓度为5×106L-1接种于板孔,在3组含药血清终浓度分别为10%,20%,30%,40%,50%下培养,正常对照组为完全培养液组.实验评估①用四甲基偶氮唑盐检测法观察滑膜细胞的增殖.②锥虫蓝染色计数活细胞数,并进行B型细胞鉴定.结果①滑膜细胞活性鉴定、计数及B型细胞鉴定滑膜组织块培养后锥虫蓝拒染细胞计数为2×107,测得活性率达97%.免疫组织化学示Vimentin阳性,为B型滑膜细胞特征染色.②各组含药血清对滑膜细胞增殖的影响生理盐水组和正常对照组的活细胞均明显增加;与生理盐水组和正常对照组比较,三水白虎汤组及来氟米特组的细胞增殖显著受抑致,活细胞数剧减(P＜0.001).在培养前5 d,同一含药血清浓度下,三水白虎汤组随着培养天数增加,对细胞增殖的抑制作用增强,5 d后抑制作用不再明显增加.同条件下比较活细胞数,三水白虎汤组和来氟米特组之间差异不明显(P＞0.05),生理盐水组和正常对照组的活细胞数之间差异不明显(P＞0.05).结论三水白虎汤含药血清对体外培养关节炎滑膜细胞增殖有显著抑制作用,抑制滑膜增生的途径可能为三水白虎汤治疗类风湿关节炎(热痹证型)的作用机制之一.     

雷公藤甲素含药血清对大鼠成纤维样滑膜细胞增殖及其巨噬细胞移动抑制因子表达的影响

目的:雷公藤甲素是雷公藤抗炎、抗肿瘤、免疫调节和抑制细胞增殖的主要有效成分。观察雷公藤甲素、雷公藤及其与来氟米特配伍的含药血清对大鼠成纤维样滑膜细胞的增殖及巨噬细胞移动抑制因子表达的影响。方法:实验于2006-12/2007-03在解放军白求恩国际和平医院中心实验室完成。①实验分组:雄性Wistar大鼠12只,体质量150～180g,随机数字表法分为6组,分别为雷公藤组、雷公藤甲素组、来氟米特组、雷公藤 来氟米特组、雷公藤甲素 来氟米特组和空白对照组,每组2只。②实验方法:雷公藤组、雷公藤甲素组、来氟米特组、雷公藤 来氟米特组、雷公藤甲素 来氟米特组,分别将雷公藤、雷公藤甲素、雷公藤 来氟米特、雷公藤甲素 来氟米特的含药血清以0.1、0.2、0.3的体积分数干预成纤维样滑膜细胞,空白对照组加入正常鼠血清。③实验评估:四甲基偶氮唑盐比色法观察细胞增殖情况;免疫组织化学染色及细胞ELISA法检测滑膜细胞和细胞上清液巨噬细胞移动抑制因子的表达。结果:纳入大鼠12只,均进入结果分析。①四甲基偶氮唑盐比色法结果显示,含药血清对体外滑膜细胞增殖具有显著抑制作用,单药最佳作用体积分数为0.2。②雷公藤甲素组、雷公藤组、雷公藤甲素 来氟米特组、雷公藤 来氟米特组的含药血清对成纤维样滑膜细胞均具有显著抗增殖效应,以体积分数为0.1雷公藤甲素联合体积分数为0.3来氟米特的含药血清抑制作用最强,与空白对照组相比,差异具有显著性意义(P<0.05)。③对巨噬细胞移动抑制因子蛋白表达的抑制作用则以雷公藤甲素 来氟米特的含药血清最佳,与其他各组相比,差异均有显著性(P<0.05)。结论:雷公藤甲素是雷公藤抑制成纤维样滑膜细胞增殖和抗炎作用的主要有效成分,而雷公藤甲素 来氟米特组的含药血清在抑制成纤维样滑膜细胞增殖及其表达巨噬细胞移动抑制因子等方面显示出明显的协同/增效作用。     

雷公藤甲素含药血清对大鼠成纤维样滑膜细胞增殖及其巨噬细胞移动抑制因子表达的影响烛

目的：雷公藤甲素是雷公藤抗炎、抗肿瘤、免疫调节和抑制细胞增殖的主要有效成分。观察雷公藤甲素、雷公藤及其与来氟米特配伍的含药血清对大鼠成纤维样滑膜细胞的增殖及巨噬细胞移动抑制因子表达的影响。方法：实验于2006—12／2007—03在解放军白求恩国际和平医院中心实验室完成。①实验分组：雄性Wistar大鼠12只，体质量150～180g，随机数字表法分为6组，分别为雷公藤组、雷公藤甲素组、来氟米特组、雷公藤＋来氟米特组、雷公藤甲素＋来氟米特组和空白对照组，每组2只。②实验方法：雷公藤组、雷公藤甲素组、来氟米特组、雷公藤＋来氟米特组、雷公藤甲素＋来氟米特组，分别将雷公藤、雷公藤甲素、雷公藤＋来氟米特、雷公藤甲素＋来氟米特的含药血清以0．1、0．2、0．3的体积分数干预成纤维样滑膜细胞，空白对照组加入正常鼠血清。③实验评估：四甲基偶氮唑盐比色法观察细胞增殖情况；免疫组织化学染色及细胞ELISA法检测滑膜细胞和细胞上清液巨噬细胞移动抑制因子的表达。结果：纳入大鼠12只，均进入结果分析。①四甲基偶氮唑盐比色法结果显示，含药血清对体外滑膜细胞增殖具有显著抑制作用，单药最佳作用体积分数为0．2。②雷公藤甲素组、雷公藤组、雷公藤甲素＋来氟米特组、雷公藤＋来氟米特组的含药血清对成纤维样滑膜细胞均具有显著抗增殖效应，以体积分数为0．1雷公藤甲素联合体积分数为0．3来氟米特的含药血清抑制作用最强，与空白对照组相比，差异具有显著性意义（P〈0．05）。③对巨噬细胞移动抑制因子蛋白表达的抑制作用则以雷公藤甲素＋来氟米特的含药血清最佳，与其他各组相比，差异均有显著性（P〈0．05）。结论：雷公藤甲素是雷公藤抑制成纤维样滑膜细胞增殖和抗炎作用的主要有效成分，而雷公藤甲素＋来氟米特组的含药血清在抑制成纤维样滑膜细胞增殖及其表达巨噬细胞移动抑制因子等方面显示出明显的协同／增效作用。     

糖肾汤对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

背景肾小球系膜细胞是糖尿病肾病致病的主要靶细胞,高糖环境下系膜细胞发生一系列功能改变,导致疾病不断发生发展,应用中药进行干预治疗,对延缓糖尿病肾病的发展具有重要意义.目的探讨肾小球系膜细胞在高糖环境下增殖情况以及糖肾汤含药血清对其的影响.设计对照实验.单位浙江中医学院附属第二医院实验室.材料以2003-08取自上海市第一人民医院肾内科SD大鼠系膜细胞株作为实验对象,2003-10浙江中医学院实验动物中心的清洁级SD大鼠45只,雌雄各半,体质量(180±20)g,作为制备含药血清动物.糖肾汤(由大黄、桃仁、虫、黄芪、地骨皮、黄连等组成),按比例称取后,水煎、过滤、浓缩至含生药3 g/mL.方法将SD大鼠随机分为正常组、糖肾汤组、卡托普利组各15只.将糖肾汤和卡托普利含药血清分为不同的剂量组作用于系膜细胞体系,正常组每日灌胃相同容量蒸馏水,用锥虫蓝染色法和四唑盐法分别检测用药后对系膜细胞毒性及增殖的影响.主要观察指标在含药血清刺激后大鼠肾小球系膜细胞活力,及细胞增殖情况.结果实验大鼠均进入结果分析.①系膜细胞在高糖持续作用下,其增殖受到抑制(与空白组比较P＜0.05),糖肾汤及卡托普利干预后均可不同程度地逆转上述高糖的抑增殖作用(与高糖组比较P＜0.05).②各组含药血清干预大鼠肾小球系膜细胞后,无明显毒性作用(细胞活力均达94%以上,与空白组比较P＞0.05).结论高糖可抑制系膜细胞增殖,而糖肾汤可刺激系膜细胞增殖.     

来氟米特治疗类风湿关节炎IL-12、IL-18水平的变化

目的 :分析来氟米特临床治疗类风湿关节炎对 IL- 12、IL- 18水平的影响。方法 :采用酶联免疫吸附法( EL ISA)检测用药前后血清及关节滑膜中 IL- 12、IL- 18含量。结果 :研究进行 1周后 ,可反映类风湿关节炎免疫活动状况的 IL- 12、IL- 18在来氟米特治疗组显著低于对照组 ( P<0 .0 5 ) ;治疗组治疗后血清及滑膜水平低于治疗前 ( P<0 .0 5 ) ,而对照组观察前后变化无差异 ( P>0 .0 5 )。结论 :应用来氟米特治疗 ,缓解类风湿关节炎患者症状 ,可能与降低血清及滑膜的 IL- 12、IL- 18水平有关     

胶原诱导性关节炎大鼠灌服痹肿消汤后滑膜组织膜联蛋白Ⅰ的表达

目的:观察胶原诱导性关节炎大鼠灌服痹肿消汤后滑膜组织膜联蛋白Ⅰ的表达变化。方法:实验于2005-02/06在蛋白质组国家重点实验室完成,选用78只健康SD大鼠,按随机数字表法分为3组:①正常对照组(n=10)。②模型组(n=35)。③痹肿消汤组(n=33)。模型组和痹肿消汤组大鼠采用牛Ⅱ型胶原10mg与完全福氏佐剂5mL混合注射诱导大鼠关节炎模型;正常对照组注射等量生理盐水。痹肿消汤组于初次免疫7d后开始灌服痹肿消汤(由白花蛇舌草15g,肿节风30g,丹参15g,苡米30g等15味中药组成),按10mL/kg标准给药,2次/d;模型组与正常对照组每天灌服相同体积的生理盐水。观察大鼠一般情况,并定期对其进行关节炎指数评分(0分:无关节炎;4分:关节严重肿胀且不能负重。关节炎指数=四肢关节评分之和,平均关节炎指数=总关节炎指数/每组大鼠的总数)。各组大鼠分别于造模后25d,35d,45d麻醉断头处死。取踝跖关节作病理检查,采用免疫印迹法检测大鼠在不同时间点滑膜组织膜联蛋白Ⅰ的表达,运用ImageTool3.0灰度扫描软件对结果进行半定量分析。结果:对未出现红斑、肿胀等关节炎体征或体征不明显的大鼠予以舍弃,进入结果分析的大鼠共70只,正常对照组、模型组及痹肿消汤组分别为10,30,30只。①各组大鼠的关节炎指数比较:模型组大鼠在造模14d后关节炎症状进行性加重,平均关节炎指数增加;痹肿消汤组平均关节炎指数于造模25d和30d达高峰,但仍较模型组低。②各组大鼠滑膜病理学改变:模型组大鼠滑膜组织中炎性细胞浸润,血管增生,滑膜增厚等特征改变持续加重,而痹肿消汤组显示炎症减轻,新生血管减少,滑膜增厚不明显。③各组大鼠滑膜组织膜联蛋白Ⅰ的表达:模型组造模后45d膜联蛋白Ⅰ表达明显低于正常对照组(P<0.01),在造模后25d,35d,45d膜联蛋白Ⅰ的表达水平呈递减趋势。痹肿消汤组大鼠膜联蛋白Ⅰ表达水平明显高于模型组与正常对照组(P<0.05～0.01),且在造模后25d,35d,45d呈递增趋势。结论:痹肿消汤具有上调胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织膜联蛋白Ⅰ表达的作用,这可能是该药控制类风湿关节炎病程发展的途径之一。     

糖肾汤对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

背景：肾小球系膜细胞是糖尿病肾病致病的主要靶细胞,高糖环境下系膜细胞发生一系列功能改变,导致疾病不断发生发展,应用中药进行干预治疗,对延缓糖尿病肾病的发展具有重要意义.目的：探讨肾小球系膜细胞在高糖环境下增殖情况以及糖肾汤含药血清对其的影响.设计：对照实验.单位：浙江中医学院附属第二医院实验室.材料：以2003-08取自上海市第一人民医院肾内科SD大鼠系膜细胞株作为实验对象,2003-10浙江中医学院实验动物中心的清洁级SD大鼠45只,雌雄各半,体质量（180&;#177;20）g,作为制备含药血清动物.糖肾汤（由大黄、桃仁、虫、黄芪、地骨皮、黄连等组成）,按比例称取后,水煎、过滤、浓缩至含生药3 g/mL.方法：将SD大鼠随机分为正常组、糖肾汤组、卡托普利组各15只.将糖肾汤和卡托普利含药血清分为不同的剂量组作用于系膜细胞体系,正常组每日灌胃相同容量蒸馏水,用锥虫蓝染色法和四唑盐法分别检测用药后对系膜细胞毒性及增殖的影响.主要观察指标：在含药血清刺激后大鼠肾小球系膜细胞活力,及细胞增殖情况.结果：实验大鼠均进入结果分析.①系膜细胞在高糖持续作用下,其增殖受到抑制（与空白组比较P＜0.05）,糖肾汤及卡托普利干预后均可不同程度地逆转上述高糖的抑增殖作用（与高糖组比较P＜0.05）.②各组含药血清干预大鼠肾小球系膜细胞后,无明显毒性作用（细胞活力均达94%以上,与空白组比较P＞0.05）.结论：高糖可抑制系膜细胞增殖,而糖肾汤可刺激系膜细胞增殖.     

补肾活血中药促进体外培养软骨细胞增殖和蛋白质合成的作用

目的:利用体外软骨细胞培养体系,观察中药补肾活血方含药血清对软骨细胞增殖及蛋白质合成的影响,以探讨补肾活血中药防治骨性关节炎的作用。方法:实验于2003-05/2004-08在广州中医药大学实验动物中心完成。①4周龄新西兰兔,用于分离培养软骨细胞。②雄性SD大鼠10只,体质量250～300g,随机分为正常组和中药补肾活血方组,每组5只,用于制备含药血清。③将传一代的软骨细胞接种于96孔培养板和24孔培养板中,培养24h后细胞贴壁进行分组试验,培养孔随机分为6组,每组4孔:空白对照组(加体积分数为0.05血清DMEM)5%中药含药血清组,10%中药含药血清组,20%中药含药血清组,5%丹参注射液组,5%葛根素注射液组;用噻唑蓝法检测细胞活性和增殖,考马斯亮蓝法检测细胞总蛋白。结果:①5%,10%,20%中药含药血清组软骨细胞增殖与空白对照组相比有显著差异眼(1.10±0.04),(1.14±0.04),(1.14±0.06),(0.66±0.07),P<0.05演。②5%,10%,20%中药含药血清组细胞总蛋白合成与空白对照组相比有显著差异眼(137.60±5.98),(135.20±9.37),(130.80±2.50),(99.15±5.08),P<0.05演。③5%丹参及葛根素注射液组对软骨细胞增殖和蛋白合成无明显影响。结论:补肾活血中药含药血清可促进软骨细胞的增殖和蛋白合成,这可能是补肾活血中药防治骨性关节炎的重要作用机制之一。     

类风湿关节炎滑膜CD68阳性细胞筛选的意义

目的:探讨用CD68作为细胞标志筛选类风湿关节炎和正常滑膜组织中的滑膜巨噬细胞CD68+细胞,并观察筛选后细胞的活性及特性。方法:滑膜组织来源于2003-02/2004-03南方大学南方医院脊柱骨病科收治的12例住院患者。类风湿关节炎组6例源自全膝关节置换术或经关节镜滑膜切除术的类风湿关节炎患者,正常滑膜组6例来自无关节炎病史的半月板损伤患者,均经病理诊断证实。从滑膜组织中分离滑膜细胞,免疫磁珠法筛选滑膜CD68+和CD68-细胞,用流式细胞仪检测筛选效能;用免疫组化染色观察类风湿关节炎组和正常滑膜组筛选前后滑膜CD68+细胞所占比例;以四甲基偶氮唑盐比色法观察筛选后细胞体外培养增殖活性。结果:所获12例滑膜组织全部进入结果分析。①滑膜细胞分离后观察:滑膜细胞24h后贴壁生长,滑膜巨噬样细胞在类风湿关节组的比例较正常滑膜组高。②筛选后滑膜细胞的观察结果:免疫磁珠法筛选的CD68+和CD68-细胞均在2h内开始贴壁,24h后CD68-细胞呈极向排列生长,贴壁能力强于CD68+细胞。筛选后的滑膜CD68+细胞与磁珠结合在一起,具有巨噬样细胞形态,胞周可有突起,分裂增殖较慢,但在体外能传数代;CD68-细胞未与磁珠结合,表现为长梭形成纤维细胞样形态,细胞分裂增殖迅速。③CD68+细胞的纯度分析:经流式细胞仪分析细胞纯度为93.6%,主峰右移,细胞平均体积增大。滑膜CD68-细胞不能被FITC标记。④滑膜细胞CD68的表达观察:筛选后CD68+细胞均为棕黄色。细胞核大、较疏松,细周有突起。CD68-细胞基本为成纤维样细胞,胞浆未被黄染,细胞核位于细胞中央,呈卵圆形,核仁明显。⑤两组滑膜细胞体外增殖速度:在体外均有不同程度增殖活性。类风湿关节炎和正常滑膜CD68-细胞增殖速度快于同一组织来源滑膜CD68+细胞的增殖速度[(0.680±0.047),(0.236±0.014);(0.605±0.031),(0.195±0.019);t=21.989,P<0.05]。类风湿关节炎滑膜CD68+细胞增殖速度快于正常滑膜CD68+细胞的增殖速度[(0.236±0.014),(0.195±0.019);t=4.149,P<0.05]。结论:CD68可作为一种标志来筛得滑膜细胞中的巨噬细胞和其他滑膜细胞,筛选后滑膜细胞均具有良好增殖活性。CD68+细胞具有典型巨嗜样细胞形态,CD68-细胞主要为成纤维样细胞,两种细胞区分程度好有助于临床对疾病活动期和严重程度判断。     

人类风湿性关节炎滑膜-软骨-NOD．scid小鼠嵌合体模型的建立

目的:建立能反应自身免疫特点的类风湿性关节炎动物模型,为进一步研究该病发病机制奠定基础。方法:实验于2006-03/12在南方医科大学实验动物中心完成。①实验材料:SPF级2～4个月龄NOD.scid小鼠20只,体质量17～22g,雌雄各半;人类风湿性关节炎滑膜组织(佛山市第一人民医院风湿科提供,患者知情同意);骨关节炎滑膜及正常软骨(南方医院创伤骨科提供,患者及供者知情同意)。②实验分组:将小鼠随机分为2组,类风湿性关节炎滑膜组和骨关节炎滑膜组,雌雄不限,每组10只。③实验过程:每组小鼠背部皮下植入的正常软骨组织,随后将类风湿性关节炎滑膜和骨关节炎滑膜植入软骨之上。④造模10周后麻醉下处死小鼠,用放射免疫法检测血清中肿瘤坏死因子α含量,移植物进行组织病理学观察,并进行组织学积分。结果:①模型鼠一般情况:实验期间NOD.scid小鼠无手摸皮骨感、活动度差、毛稀疏等典型移植物抗宿主疾病表现,模型鼠在SPF环境下10周存活率100%。②肿瘤坏死因子α含量:类风湿性关节炎滑膜组鼠血清中肿瘤坏死因子α放射含量类风湿性关节炎组明显高于骨关节炎组[(0.80±0.06),(0.70±0.03)μg/L,t=4.466,P<0.001]。③组织病理学观察:苏木精-伊红染色,骨关节炎滑膜组只见少量的滑膜细胞增生和炎症细胞,移植的滑膜组织主要被纤维组织形成的条索状物代替,无明显地软骨被侵蚀破坏发生;类风湿性关节炎滑膜组可明显见到大量的滑膜细胞增生和生化中心形成,病变部位的组织结构间质变为疏松,变为境界不清晰的颗粒状或块状无结构强嗜酸性红染物质;软骨边缘被滑膜组织侵蚀破坏明显;类风湿性关节炎滑膜组滑膜增生、软骨侵蚀和软骨降解积分均高于骨关节炎滑膜组(P<0.04)。结论:在NOD.scid体内可成功建立类风湿性关节炎动物模型。     

白藜芦醇调控体外培养人骨关节炎滑膜细胞白细胞介素18的表达

背景:白藜芦醇可在体外抑制软骨细胞的凋亡。目的:观察白藜芦醇对体外培养人骨关节炎滑膜细胞中白细胞介素18、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α表达的影响。方法:对兔以白藜芦醇临床等效剂量灌胃后,制备含10%,20%,40%白藜芦醇含药血清,与人骨关节炎滑膜细胞共培养,以正常兔血清培养细胞为对照。结果与结论:ELISA检测及免疫细胞化学检测结果显示,不同浓度白藜芦醇含药血清组体外培养滑膜细胞白细胞介素18、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α分泌量较正常兔血清组明显降低(P<0.01),并随白藜芦醇浓度的增加,白细胞介素18、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α分泌量逐渐降低(P<0.01或P<0.05)。白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α水平依次与白细胞介素18水平呈正相关。表明白藜芦醇能够显著下调白细胞介素18、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α在骨关节炎滑膜细胞中的表达,减轻滑膜炎症反应。     

胶原诱导性关节炎大鼠灌服痹肿消汤后滑膜组织膜联蛋白Ⅰ的表达

目的：观察胶原诱导性关节炎大鼠灌服痹肿消汤后滑膜组织膜联蛋白Ⅰ的表达变化。 方法：实验于2005-02／06在蛋白质组国家重点实验室完成，选用78只健康SD大鼠，按随机数字表法分为3组：①正常对照组（n=10）。②模型组（n=35）。⑧痹肿消汤组（n=33）。模型组和痹肿消汤组大鼠采用牛Ⅱ型胶原10mg与完全福氏佐剂5mL混合注射诱导大鼠关节炎模型；正常对照组注射等量生理盐水。痹肿消汤组于初次免疫7d后开始灌服痹肿消汤（由白花蛇舌草15g，肿节风30g，丹参15g，苡米30g等15味中药组成），按10mL／kg标准给药，2次／d；模型组与正常对照组每天灌服相同体积的生理盐水。观察大鼠一般情况，并定期对其进行关节炎指数评分（0分：无关节炎；4分：关节严重肿胀且不能负重。关节炎指数=四肢关节评分之和，平均关节炎指数：总关节炎指数／每组大鼠的总数）。各组大鼠分别于造模后25d，35d，45d麻醉断头处死。取踝跖关节作病理检查，采用免疫印迹法检测大鼠在不同时间点滑膜组织膜联蛋白Ⅰ的表达，运用ImageTool3．0灰度扫描软件对结果进行半定量分析。 结果：对未出现红斑、肿胀等关节炎体征或体征不明显的大鼠予以舍弃。进入结果分析的大鼠共70只，正常对照组、模型组及痹肿消汤组分别为10，30，30只。①各组大鼠的关节炎指数比较：模型组大鼠在造模14d后关节炎症状进行性加重，平均关节炎指数增加；痹肿消汤组平均关节炎指数于造模25d和30d达高峰，但仍较模型组低。②各组大鼠滑膜病理学改变：模型组大鼠滑膜组织中炎性细胞浸润，血管增生，滑膜增厚等特征改变持续加重，而痹肿消汤组显示炎症减轻，新生血管减少，滑膜增厚不明显。③各组大鼠滑膜组织膜联蛋白Ⅰ的表达：模型组造模后45d膜联蛋白Ⅰ表达明显低于正常对照组（P〈0．01），在造模后25d，35d，45d膜联蛋白Ⅰ的表达水平呈递减趋势。痹肿消汤组大鼠膜联蛋白Ⅰ表达水平明显高于模型组与正常对照组（P〈0．05-0．01），且在造模后25d，35d,45d呈递增趋势。 结论：痹肿消汤具有上调胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织膜联蛋白Ⅰ表达的作用，这可能是该药控制类风湿关节炎病程发展的途径之一。     

痹肿消汤干预胶原诱导性关节炎大鼠滑膜病变的蛋白质组学研究

目的:观察痹肿消汤干预胶原诱导性关节炎大鼠滑膜病变的蛋白质改变,分析痹肿消汤治疗类风湿关节炎可能的作用机制。方法:实验于2004-05/2005-02在中南大学湘雅医院中西医结合研究所实验室、卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室完成。70只SD大鼠随机分为3组,正常组10只,其余60只大鼠采用牛Ⅱ型胶原与完全福氏佐剂诱导SD大鼠实验性关节炎模型,选取造模成功者再随机分为两组,即痹肿消汤组和模型组。痹肿消汤煎液制备:白花蛇舌草15g,肿节风30g,丹参15g,络石藤20g,骨碎补15g,苡米30g等15味中药,双蒸水煎2次,30min/次,两煎混合,G4滤器过滤,于60℃水浴中浓缩成每毫升药液含生药116g。痹肿消汤组灌服痹肿消汤煎液10mL/kg(相当于生药62.1g),2次/d灌服;模型组灌服生理盐水10mL/kg,2次/d灌服。正常组自由进水。应用双向凝胶电泳技术分别分离正常组、模型组及痹肿消汤组大鼠关节滑膜的总蛋白后,经胶体考染显色、图像分析、识别差异表达的蛋白质点,应用MALDI-TOF-MS质谱仪得到相应的肽质量指纹图谱,然后搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点。结果:纳入实验的70只大鼠,造模不成功被淘汰7只,最终痹肿消汤组26只、模型组27只、对照组10只,共63只大鼠进入结果分析。①建立了正常组、模型组和痹肿消汤组关节滑膜的双向凝胶电泳图谱,其平均蛋白质点数分别为947±39,994±41,1031±52,其匹配率为92%,91%,94.2%。②发现并鉴定了正常组、模型组和痹肿消汤组大鼠滑膜的差异表达大于2倍的蛋白质点55个,这些差异表达蛋白质的功能涉及物质代谢、能量产生、物质转运、抗氧化应激、信号转导及细胞骨架蛋白,随即用免疫印迹的方法差异蛋白质annexin1、aldolaseA在正常组、模型组、痹肿消汤组中的表达,其结果也显示了类似的表达差异。结论:类风湿关节炎模型关节滑膜病变是一个多种蛋白质参与的复杂过程。滑膜组织的比较蛋白质组学分析是一种筛选病变相关蛋白的可靠方法之一。annexin1、aldolaseA可能与实验性关节炎的关节滑膜病变有关;痹肿消汤可能通过对实验性关节炎大鼠滑膜蛋白质表达的调控达到治疗目的。     

抗骨增生胶囊含药血清对软骨细胞增殖凋亡及基质金属蛋白酶分泌的影响

背景:抗骨增生胶囊在治疗骨关节疾病方面有很好的疗效,基础研究多集中于颈椎病等骨关节疾病上.目的:拟观察抗骨增牛胶囊含药血清对白细胞介索1β引起的软骨细胞增殖凋亡及基质金属蛋白酶分泌的影响.设计、时间及地点:分组对照体外细胞学实验,于2007-03/09在河北医科大学解剖教研室细胞培养中心完成.材料:新生1周sD大鼠,用于培养软骨细胞;体质量200 g左右SD大鼠10只,以中药水溶液灌胃后定时取血制备含药血清.方法:采用胶原酶NB4消化法从大鼠关节软骨中分离出软骨细胞并进行原代和传代培养,实验分为3组:空白血清组:90%L-DMEM 10%空白血清,每口给予同等量的生理盐水;白细胞介索1β组(90%DMEM 10%空白血清 自细胞介素1β);中药血清 白细胞介素1β组(90%DMEM 10%中约血清 白细胞介素1β).白细胞介素1β加入量为5μg/L,培养72 h.将实验用细胞消化传代后制成单细胞悬液,以1×108L-1的密度接种于96孔培养板,100μL/孔,每组6孔.主要观察指标:倒置显微镜下观察中药含药血清对软骨细胞增殖的影响:四甲基偶氮唑盐比色法检测其各孔吸光度变化;流式细胞仪分析凋亡细胞百分率;基质金属蛋白酶13 Elisa试剂盒检测不同组基质金属蛋白酶13分泌情况.结果:在正常培养基条件下,细胞形态均匀,死亡脱落细胞较少.空白血清组软骨细胞的增殖速度缓慢,细胞较稀疏.白细胞介索1β组细胞明显稀疏,部分细胞胞浆中窄泡增多,细胞核形态不规则.在中药血清培养基作用下,软骨细胞增殖的速度较白细胞介素1 B组快,胞体显著增大,细胞核形态规则.白细胞介素1β组细胞增殖数量减少,凋亡细胞百分率增加,其培养的细胞上清液中基质金属蛋白酶13含量升高,抗骨增生胶囊含药血清可对抗白细胞介素1β对软骨细胞的影响.结论:体外条件下,抗骨增生胶囊含药血清能够抑制白细胞介素1β诱导的软骨细胞凋亡:降低基质金属蛋白酶13水平.     

昆明山海棠与类风湿关节炎滑膜细胞体外增殖和凋亡

背景:昆明山海棠应用于类风湿关节炎治疗已被证实有确切疗效,但对于其作用机制目前尚不明确.目的:验证昆明山海棠对类风湿关节炎滑膜巨噬样细胞和成纤维样细胞体外增殖活性及对其凋亡影响,分析其剂量效应关系.设计、时间及地点:细胞学体外分组对照实验,于2003-08/2007-06在汕头大学医学院第一附属医院中心实验室和南方医科大学细胞生物实验室完成.材料:类风湿关节炎6例及正常滑膜组织3例,来源于汕头大学医学院第一附属医院骨科和南方医院脊柱骨病科患者术中获得的标本.昆明山海棠制备水提取液,含生药0.667 g/mL..方法:收集获得的滑膜组织,通过消化法获得原代类风湿关节炎及正常滑膜细胞,第2-4代细胞用免疫磁珠法筛选滑膜CD68~+细胞和CD68~-细胞,在接种72 h后加入实验各组分别在培养液中加入最终体积分数分别为5,10,20 mL/L的昆明山海棠药液处理24 h和48 h.同时设立不加药物的阴性对照及不加细胞空白对照.主要观察指标:相差倒置显微镜、扫描电镜观察细胞形态,用MTT法测定细胞增殖情况,流式细胞仪检测和TUNEL.法检测细胞凋亡.结果:分选后滑膜CD68~-细胞为成纤维样细胞,滑膜CD68~+细胞为滑膜巨噬样细胞.施予干预因素后,各组有部分细胞体积缩小,胞膜皱缩,微绒毛和伪足减少或消失,部分细胞可见团块脱落形成凋亡小体.当昆明山海棠体积分数为2%时,各组细胞均有不同程度抑制,显示昆明山海棠有细胞毒性,对类风湿关节炎滑膜CD68~-、CD68~+细胞的抑制效应和诱导细胞效应强于同种正常滑膜细胞(P<0.01).在药物体积分数为1%时,对类风湿关节炎滑膜细胞有明显抑制效应(P<0.01).昆明山海棠对诱导类风湿关节炎滑膜细胞凋亡作用有明显时间依赖性和剂量依赖性,且凋亡率与相同条件下的抑制率表现出较好的直线相关关系(r=0.497,P<0.01).结论:昆明山海棠对于类风湿关节炎滑膜巨噬样细胞和滑膜成纤维样细胞有诱导凋亡和明显抑制异常增殖作用.在一定浓度下,昆明山海棠对于正常滑膜细胞毒性较小且对类风湿关节炎滑膜细胞的有较明显抑制异常增殖和诱导细胞凋亡的效应.     

胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织醛缩酶A表达及痹肿消汤的干预效应

目的:观察胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织醛缩酶A表达及痹肿消汤干预的影响。方法:实验于2005-05/2005-07在中南大学湘雅医院中西医结合研究所实验室、卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室完成。选用51只健康SD大鼠,以随机数字表法选出36只造模,采用皮下注射牛Ⅱ型胶原与完全福氏佐剂诱导SD大鼠实验性关节炎)模型,另15只作为正常对照组,注射等量生理盐水。成模大鼠30只以随机数字表法分为模型组和痹肿消汤组,各15只。痹肿消汤组于初次免疫7d后开始灌服痹肿消汤(痹肿消汤由白花蛇舌草、肿节风、苡米、络石藤、丹参、骨碎补等15味中药组成,体表面积比换算关系,大鼠用药为70kg成人临床用药3倍,药材从中南大学湘雅医院中药房一次性选购,两次水煎取药液备用),相当于生药62.1g/(kg·d),每只约1.5mL,2次/d灌服;模型组与正常组同体积生理盐水。观察大鼠一般情况,并定期对其进行关节炎指数评分。按0～4级进行评分,0分:无关节炎;1分:有红色斑点后轻度肿胀;2分:关节部位中度肿胀;3分:关节严重肿胀;4分:关节严重肿胀且不能负重。采用免疫印迹法(Westernblot)检测正常组、模型组及痹肿消汤组大鼠在不同时间点滑膜组织醛缩酶A的表达,运用ImageTool3.0灰度扫描软件对结果进行半定量分析。结果:纳入实验的51只大鼠,造模不成功被淘汰6只,最终痹肿消汤组15只、模型组15只、对照组15只,共45只大鼠进入结果分析。①各组大鼠关节炎指数比较:模型组大鼠关节炎指数于免疫后25d左右达到高峰,30d后呈下降趋势;痹肿消汤组大鼠亦于25d左右达高峰,但较模型组低。②各组大鼠滑膜组织醛缩酶A的表达:模型组醛缩酶A表达在25,35,45d递增(P<0.05～0.01),且明显高于同时间正常组及痹肿消汤组(P<0.05～0.01);痹肿消汤组醛缩酶A表达在各时间点明显低于同时间模型组及正常组(P<0.05,P<0.005,P<0.001),在25,35d和45d表达水平呈递减趋势(P<0.05,0.01)。结论:类风湿关节炎关节病变过程中醛缩酶A表达增加,且随免疫时间延长而逐渐上调。痹肿消汤能下调关节炎大鼠滑膜醛缩酶A表达,这可能是其阻抑类风湿关节炎骨质侵蚀的重要机制之一。     

白藜芦醇调控体外培养人骨关节炎滑膜细胞白细胞介素18的表达

背景：白藜芦醇可在体外抑制软骨细胞的凋亡。目的：观察白藜芦醇对体外培养人骨关节炎滑膜细胞中白细胞介素18、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α表达的影响。方法：对兔以白藜芦醇临床等效剂量灌胃后,制备含10%,20%,40%白藜芦醇含药血清,与人骨关节炎滑膜细胞共培养,以正常兔血清培养细胞为对照。结果与结论：ELISA检测及免疫细胞化学检测结果显示,不同浓度白藜芦醇含药血清组体外培养滑膜细胞白细胞介素18、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α分泌量较正常兔血清组明显降低（P〈0.01）,并随白藜芦醇浓度的增加,白细胞介素18、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α分泌量逐渐降低（P〈0.01或P〈0.05）。白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α水平依次与白细胞介素18水平呈正相关。表明白藜芦醇能够显著下调白细胞介素18、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α在骨关节炎滑膜细胞中的表达,减轻滑膜炎症反应。     

益气养阴活血方对肾小球系膜细胞增殖及ERK通路的影响

目的 观察益气养阴活血方含药血清对高糖条件培养的大鼠肾小球系膜细胞增殖及胞外信号调节激酶(ERK)通路的影响.方法 制备益气养阴活血方和福辛普利含药血清.将大鼠肾小球系膜细胞分为正常对照组、高糖培养组、高糖培养+福辛普利含药血清组和高糖培养+三个不同浓度益气养阴活血方含药血清组.培养6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后用Western-blot法对系膜细胞中磷酸化ERK1/2(pERK1/2)的表达进行半定量分析,用4-甲偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖.结果 与正常对照组相比,高糖组早期(24 h、48 h)能显著促进系膜细胞增殖,福辛普利和高浓度中药含药血清组均可抑制高糖引起的系膜细胞增殖(P<0.05),两组间无统计学差异(P>0.05).高糖刺激6 h后系膜细胞中pERK1/2蛋白的表达即明显增高,24 h达到高峰,后逐渐减弱,福辛普利和不同浓度中药含药血清干预后,pERK1/2蛋白水平显著下降(P<0.05),中药组和西药组间无统计学差异(P>0.05).结论 益气养阴活血方能抑制肾小球系膜细胞增殖和ERK通路的磷酸化,这可能是其临床肾脏保护作用机制所在.     

核心肽对类风湿关节炎滑膜细胞增殖与凋亡的影响

背景:前期研究发现,在类风湿关节炎关节腔中注入核心肽,可以明显抑制病情活跃度且抑制滑膜的浸润增生.但由于T细胞和滑膜细胞之间联系密切,核心肽是通过直接作用于滑膜细胞还是通过T细胞介导抑制滑膜细胞尚缺乏研究.目的:对比观察核心肽对类风湿关节炎和骨性关节炎滑膜细胞增殖与凋亡的影响.方法:采用酶消化法分离类风湿关节炎和骨性关节炎患者手术切取的病变滑膜组织滑膜细胞,MTT法检测滑膜细胞增殖率.取第3代类风湿性关节炎和骨性关节炎滑膜细胞分5组干预:空白对照组、甲氨蝶呤组、10,25,50 μmol/L核心肽组.MTT法检测各组滑膜细胞增殖率变化;采用流式细胞仪检测各组滑膜细胞凋亡情况.结果与结论:类风湿关节炎滑膜细胞体外增殖速度较骨性关节炎滑膜细胞快(P<0.05).3种剂量的核心肽均可抑制骨性关节炎滑膜细胞的增殖,诱导其凋亡,且具有剂量相关性,高剂量时,核心肽更明显表现出对骨性关节炎滑膜细胞凋亡的诱导作用.而对于类风湿关节炎滑膜细胞,只有中、高剂量核心肽显示出明显的诱导细胞凋亡作用,但未见明显的剂量依赖性.核心肽对类风湿关节炎滑膜细胞的凋亡诱导作用明显小于其对骨性关节炎细胞的凋亡诱导作用.结果提示核心肽对滑膜细胞具有一定的直接作用,高剂量核心肽在体外可抑制类风湿关节炎滑膜细胞的过度增殖,而中、高剂量核心肽可诱导类风湿关节炎滑膜细胞的凋亡.     

续断含药血清对成骨细胞增殖的影响及其细胞毒性检测

目的:观察不同浓度续断含药血清的细胞毒性及其对成骨细胞增殖的影响。方法:实验于2001-01/07在中山医科大学附属第二医院脐血库、医学研究中心以及中山医科大学放免检测中心完成。①制备大鼠含药血清:取雌性SD大鼠18只,随机分为3组,续断组6只,空白对照组8只,雌激素组4只,按体质量分别给予续断生药、生理盐水、雌激素灌胃3d后取血,离心后取上清液。②根据文献方法分离、培养人的原代成骨细胞。③含药血清细胞毒性的观察:成骨细胞按1.0×108L-1密度接种培养24h,换成无血清培养液24h后,用含不同续断浓度(100%,50%,25%,12.5%,6.25%,3%)的大鼠血清处理细胞。采用直接计数法和四氮唑蓝法观察不同浓度续断含药血清的细胞毒性。④细胞增殖的定量分析:将培养人成骨样细胞用不同组大鼠血清稀释,分为5%,10%和20%续断组,5%,10%和20%雌激素1组,5%,10%和20%空白对照组,5%,10%和20%雌激素2组。采用氚-胸腺嘧啶和四氮唑蓝法检测细胞增殖能力。结果:①续断含药血清细胞毒性的观察结果:直接计数表明含续断血清浓度12.5%和25%时,细胞生长数量最多,四氮唑蓝法测定A值最高。②续断对成骨细胞增殖的影响:氚-胸腺嘧啶掺入法显示10%续断组,10%,20%雌激素1组,各浓度雌激素2组细胞增殖显著高于空白对照组、5%雌激素1组和5%续断组(P<0.01);四氮唑蓝法显示10%,20%续断组,10%,20%雌激素1组,10%,20%雌激素2组细胞增殖显著高于空白对照组、5%雌激素1组和5%续断组(P<0.01)。结论:高剂量续断对成骨细胞增殖产生抑制作用,低剂量无明显影响,中剂量续断对细胞增殖的刺激作用最强。