IL-12基因修饰树突状细胞体外诱导免疫杀伤肝癌细胞

目的探讨IL-12基因修饰树突状细胞(DC)体外诱导免疫杀伤肝癌细胞的效能及其机制。方法IL-12基因修饰肝癌病人外周血DC(DC-IL-12),ELISA法检测DC-IL-12培养上清中IL-12和IFN-γ水平,以冻融HepG2所获得的肿瘤相关抗原(TAA)刺激DC-IL-12,MTT法检测TAA负载的DC-IL-12刺激同源T淋巴细胞增殖分化能力,细胞毒试验检测DC-IL-12诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)及其上清液对HepG2肝癌细胞株的杀伤作用,ELISA法检测CTL上清液IFN-γ水平。结果DC经IL-12基因修饰后48h分泌高水平IL-12(24·35±5·4)pg/ml及IFN-γ(725±30)pg/ml,均显著高于未转染DC组(P<0·01)。DC-IL-12诱导的CTL及其上清液对HepG2均有显著杀伤作用,杀伤率显著高于未转染DC组,分别为(82·43±8·7)%vs(57·4±4·3)%和(76·45±8·5)%vs(18·23±5·3)%(P<0·01),DC-IL-12诱导的CTL上清液IFN-γ水平显著高于未转染DC组,分别为(1125·0±32·7)pg/ml、(281·3±14·7)pg/ml(P<0·01)。结论IL-12基因修饰增强DC体外诱导自体T淋巴细胞产生特异性抗肝癌免疫,其机制与IL-12基因修饰促进DC分泌IL-12、增强T淋巴细胞活化及分泌IFN-γ密切相关。     

脾内转染白细胞介素-2和/或12基因增强接种肝癌大鼠T细胞功能研究

目的　探讨脾内直接注射白细胞介素IL 2、12基因对血IL 2和IL 12 ,以及T细胞活性的影响。方法　构建IL 2和或IL 12基因的逆转录病毒载体。含IL 2和或IL 12基因的包装细胞于不同时间进行脾内注射转染脾细胞。比较大鼠血IL 2和IL 12浓度、T细胞活性和毒性反应。结果　IL单基因治疗后血清IL 2或IL 12明显增高。IL 2 /IL 12联合基因组中血清IL 2和IL 12增加较单基因组显著。病理示肝癌组织中淋巴细胞浸润明显增多。IL治疗组治疗后 7d ,T细胞活性较对照组显著增高 (P <0 .0 5 )。联合基因组治疗后 7d ,T细胞功能较IL单基因组增强(P <0 .0 5 )。结论　脾内直接注射IL 2和或IL 12基因可增强T细胞活性 ,IL联合基因治疗优于IL单基因。     

白细胞介素-2基因转染联合特异性细胞毒性T淋巴细胞对裸鼠肝癌的影响

目的 观察白细胞介素-2(IL-2)基因转染联合特异性细胞毒性T淋巴细胞(sCTL)治疗裸鼠肝癌的疗效.方法 荷肝癌裸鼠6只,随机分为pORF-hIL-2质粒转染实验组和对照组,检测血浆白细胞介素(IL)-2的浓度.荷肝癌裸鼠24只,随机分成对照组、IL-2基因治疗组、sCTL治疗组和IL-2基因联合sCTL治疗组,观察肿瘤体积变化及生存时间.结果 实验组血清IL-2浓度在转染后第3天到达顶峰135.3 ng/L,持续15 d,对照组检测不到IL-2;各组肿瘤体积(治疗15 d后)变化为(262.27±78.30)、(151.65±63.93)、(27.16±27.69)、(-63.32±16.92)mm3;中位生存时间20、27.5、60、90 d;差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 联合应用IL-2基因转染和sCTL细胞治疗裸鼠的HepG2移植瘤,可以明显地提高抗瘤效应,表现协同增效作用.     

白细胞介素-12基因再修饰基因瘤苗免疫小鼠的脾细胞过继治疗肝癌

目的　探讨白细胞介素 (IL) 2和B7 1双免疫基因转染肝癌细胞瘤苗免疫小鼠后获得的脾淋巴细胞经mIL 12基因修饰后治疗小鼠肝癌的可行性和疗效。方法　用 2 0 0PFU 细胞滴度的重组腺病毒载体 (Adv)将人IL 2和B7 1基因共同转染小鼠肝癌Hepal 6细胞株 ,经 80mg L丝裂霉素 (MMC)处理制备成肝癌细胞瘤苗 ,免疫同系小鼠后分离其脾淋巴细胞 (SLC) ,转染mIL 12基因 (Adv滴度 2 0 0PFU 细胞 )后注射入直径 1cm的小鼠皮下移植肝癌内 ,观察抗瘤效果。结果　转mIL 12基因SLC治疗组小鼠瘤体增加值最小 ( 0 .0 8± 0 .0 5 )cm3,与各对照组比差异有显著性 [(转染BGFP基因SLC、未转染SLC和生理盐水注射组分别为 ( 3 .46± 0 .15 ) ,( 3 .5 6± 0 .2 3)和( 8.12± 0 .5 4)cm3,P <0 .0 5 ]。结论　IL 2和B7 1双基因修饰肝癌瘤苗诱导小鼠产生的免疫脾淋巴细胞可能成为一种新的过继免疫治疗效应细胞及携带IL 12基因的载体细胞 ;基因治疗、特异性主动免疫和过继性细胞免疫治疗结合将有更优越的抗瘤效果。     

Mda-7/IL-24基因转染对肝癌细胞凋亡影响的研究

目的 为了研究Mda-7／IL-24基因对肝癌细胞系Hep3B凋亡的影响。方法 构建了Mda-7／IL-24基因的真核表达载体pcDNA3．1／Mda-7／IL-24，用脂质体介导的基因转染法分别将真核重组体pcDNA3．1／Mda-7／IL-24和pcDNA3．1空载体质粒导人人肝癌细胞系Hep3B细胞中，经G418筛选获得细胞克隆。通过聚合酶链式反应（PCR）、免疫组织化学等方法检测基因和蛋白的表达，同时检测了细胞的生长和凋亡情况。结果 pcDNA3．1／Mda-7／IL-24转染的Hep3B细胞能够检测到Mda-7／IL-24的表达，可以抑制细胞生长，DNA琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞特有的“梯状”条带，转染空载体和未转染的Hep3B细胞未见凋亡表现。结论 将外源性Mda-7／IL-24基因导人Hep3B细胞后，可以促进凋亡，Mda-7／IL-24作为一种肝癌的治疗基因，具有广泛的应用前景。     

IL-12基因修饰树突状细胞体外诱导免疫杀伤肝癌细胞

树突状细胞(dendritic cell，DC)是体内功能最强的抗原呈递细胞，通过IL-12基因修饰DC可望使其在呈递肿瘤抗原的同时又持续分泌高滴度的IL-12，从而更有效地诱导T淋巴细胞增殖、分化，进一步增强特异性抗肿瘤免疫。我们采用HepG2肝癌细胞株的肿瘤相关抗原(TAA)致敏IL-12基因修饰的DC，观察了其体外诱导自体T淋巴细胞产生特异性抗肝癌免疫的效能。     

肝细胞肝癌病人血清IL-12、IL-2、sIL-2R水平的相关性

目的探讨肝细胞肝癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)病人血清IL 12、IL 2、sIL 2R水平的相关关系。方法 6 0例HCC病人 ,随机分为 2组。试验组 (30例 )接受IL 2 (IL 2 10 0万U/d× 7d ,静脉点滴注射 )治疗 ;对照组 (30例 )没有接受生物治疗。两组基础治疗基本相似。采用酶联免疫吸附 (ELISA)法检测所有病人治疗前后血清IL 12、IL 2、sIL 2R水平变化。结果血清IL 12水平与血清IL 2水平正相关 ,IL 12与sIL 2R无关 ,IL 2与sIL 2R负相关。IL 2治疗后平均血清IL 12、IL 2、sIL 2R水平显著性升高。IL 2治疗后血清IL 12水平下降的HCC病人预后差。结论IL 12与IL 2之间可能存在一个反馈环路 ,sIL 2R是这个环路的负调节因素。IL 2治疗可刺激内源性IL 12释放。HCC病人的预后可能与IL 2诱生的IL 12变化有关     

白细胞介素-2基因修饰树突状细胞体外增强其诱导的抗肝癌免疫反应

目的探讨腺病毒介导的白细胞介素(IL)-2基因修饰能否使抗原冲击的树突状细胞(DC)在体外诱导出更强的抗肝癌免疫反应。方法IL-2的重组腺病毒载体体外转染经肝癌细胞株HepG2冻融抗原致敏的DC(AdIL-2-HepG2/DC),FACS分析AdIL-2-HepG2/DC表面分子的表达,酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测IL-2水平,3H-TdR掺入法检测T淋巴细胞增殖分化能力,噻唑蓝(MTT)法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应。结果AdIL-2-HepG2/DC能高水平的表达CD1a(61.7±8.1)%,CD11c(72.9±6.2)%,CD80(81.1±7.1)%,CD86(76.4±6.8)%以及HLA-DR(90.6±6.4)%,并分泌较高水平的IL-2(6.78±0.18)mq/L。AdIL-2-HepG2/DC能非常显著地刺激自体T细胞增殖(CPM值为21 878±1089),当靶细胞为HepG2时,其诱导的CTL杀伤活性(74.5±3.8)%显著高于其他各组,并且其杀伤能力与效应细胞数量成正比。结论AdIL-2- HepG2/DC可以增强体外诱导的特异性抗肝癌免疫反应。     

腺病毒介导的mda-7／IL-24抑制肝癌VEGF和MMP-9的表达

目的 观察mda-7/IL-24基因对高转移性人肝癌细胞HCCLM6中VEGF和MMP-9的作用,从而探讨mda-7/IL-24基因在抑制肿瘤转移方面的作用.方法 构建Ad.Mda-7并转染至HCCLM6;transwell实验检测侵袭能力的变化;通过RT-PCR和Western Blot分别检测转染mda-7/IL-24基因前后VEGF和MMP-9表达mRNA和蛋白的变化;构建HCCLM6高转移型裸鼠模型,采用Ad.Mda-7肿瘤内注射法干预,观察mda-7/IL-24对裸鼠生存状况的影响和肿瘤内VEGF和MMP-9 的变化.结果 复制缺陷型腺病毒能介导外源基因mda-7/IL-24在肝癌细胞中高效表达;mda-7/IL-24能显著下调肝癌细胞中VEGF和MMP-9的表达.Ad.mda-7能延长裸鼠的生存时间,抑制肿瘤的生长,瘤体内VEGF和MMP-9表达明显降低(P<0.05).结论 mda-7/IL-24基因能明显抑制肝癌细胞的侵袭力,其机制可能与下调VEGF和MMP-9的表达有关.     

化疗诱导人肝癌细胞凋亡中p53和bcl-2基因的调控

目的 建立化疗药物丝裂霉素诱导肝癌细胞凋亡的模型,初步探讨在该凋亡过程 中重要凋亡相关基因ｐ５３和ｂｃｌ－２的调控作用。方法 用丝裂霉素诱导人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２凋亡,我显微镜和透射电镜观察肝癌细胞的形态学改变,琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞ＤＮＡ片段的梯状条带,用流式细胞仪免疫荧光法检测凋亡不同时期Ｐ５３和Ｂｃｌ－２蛋白的表达量。结果 ８ｍｇ／ｍｌ丝裂霉素作用１２,２４,４８ｈ后,Ｐ５３蛋白表达量明显增高,尤以１２ｈ明显,而后逐渐下降。Ｂｃｌ－２蛋白在整个凋亡过程中无明显变化。结论 在化疗药物丝裂霉素诱导肝癌细胞凋亡过程中,ｐ５３基因参与了调控,并为凋亡信号传导途径中的早期事件。丝裂霉素诱导的肝癌细胞凋亡途径为ｐ５３依赖方式,而在该凋亡过程中,ｂｃｌ－２基因的调控并不重要。     

白细胞介素12对肝癌基因治疗的实验研究

目的 研究携带白细胞介素１２（ＩＬ－１２）基因逆转录病毒载体对体内肝癌生长抑制作用,探索基因治疗肝癌新途径。方法 构建携带ＩＬ－１２的逆转录病毒载体,转染逆转录病毒包装细胞系ＰＡ３１７,应用该包装细胞对实验性肝癌大鼠进行治疗,观察抗肿瘤作用,免疫功能变化。     

白细胞介素(IL)-12干扰RNA对树突状细胞IL-12 mRNA及细胞因子的影响

目的 探讨白细胞介素（IL）-12干扰RNA（siRNA，IL-12p35 siRNA、IL-12p40 siRNA）重组腺病毒载体感染树突状细胞后对其功能的影响。方法 用重组腺病毒载体（IL-12p35 siRNA、IL-12p40 siRNA、阴性对照HK siRNA）感染DC，检测IL-12p35亚基mRNA、IL-12p40亚基mRNA和IL-10 mRNA的表达，同时检测上清中IL-12p70、IL-10水平。结果 IL-12p35siRNA、IL-12p40 siRNA重组腺病毒载体分别感染树突状细胞后，干扰了IL-12p35亚基mRNA和IL-12p40亚基mRNA的表达，但是只有IL-12p35 siRNA重组腺病毒载体感染DC上清中IL-12p70明显减少，同时引起了IL-10mRNA和IL-10的升高。结论 IL-12p35亚基特异性siRNA能够成功阻止IL-12mRNA的表达，降低了具有生物活性IL-12p70的浓度，提高IL-10的浓度。     

肝癌合并肝硬化时脾脏对机体免疫状态影响的实验研究

目的 建立大鼠肝硬化肝癌模型，并行脾脏切除，探讨脾脏在肿瘤免疫中的作用。方法 将健康雄性SD大鼠55只背部皮下注射40％四氯化碳（CCl4)花生油溶液建立肝硬化模型，将Walker-256癌肉瘤接种于肝脏内并行脾切除术，2周后观察肿瘤的生长、转移、腹水、NK细胞活性及CD25。结果 切脾组腹水量、肿瘤转移较对照组明显，肿瘤体积明显大于对照组（P＜0.01)，荷瘤后2周两组NK细胞活性均较荷瘤前降低（P＜0.01)，而荷瘤前与荷瘤后切脾组与模拟切脾组之间比较无统计学差异（P＞0.05)。荷瘤2周后两组动物CD25较荷瘤前升高（P＜0.01)，而荷瘤前后切脾组与对照组之间比较无变化（P＞0.05)。结论 荷瘤早期切除脾脏加速肿瘤的生长、转移，而对NK细胞活性及CD25的表达影响不及肿瘤对其的影响。     

经不同途径应用NK-NKG5-SV细胞防治肝细胞肝癌的研究

目的研究NKG5-SV导入肝癌病人NK细胞对其抗肝细胞肝癌作用的影响.方法Percoll不连续密度梯度离心法分离肝癌病人外周血NK细胞,以逆转录病毒为载体将NKG5-SV基因和报告基因LacZ导入NK细胞.将不同NK细胞与LCI-D20裸鼠人肝癌同时皮下接种或待LCI-D20肿瘤成瘤后瘤内注射,观察对肿瘤成瘤和生长的影响.术中经切缘或脾内注射不同的NK细胞,观察其对LCI-D20肝癌切除术后转移复发的影响.结果不同NK细胞与LCI-D20肝癌同时皮下接种NK-NKG5-SV细胞组成瘤率、肿瘤直径(cm)均低于NK-LacZ细胞组(P均小于0.01).肿瘤内注射不同NK细胞,NK-NKG5-SV细胞组的肿瘤生长明显低于NK-LacZ细胞组(P均小于0.05).肝癌切除术中应用NK细胞对照组、NK-LacZ细胞组、NK-NKG5-SV细胞组切缘复发瘤直径、肝内转移灶数目、转移灶累及肝叶数、转移灶累及腹内部位数分别为切缘注射1.51±0.47、0.86±0.49、00±1.76,2.40±1.80、0.80±0.54、0.40±1.18,01),2.60±0.70、1.40±0.54、1.0.50=0.19(P＜0.4.20=2.16、1.80±0.13、0.60±0.54(P＜0.05).脾内注射1.18±0.34、0.86±0.40、0.70±0.35,2.40=1.6 7、0.60±0.89(P＜0.05)、0.40±0.89(P＜0.05),2.2±1.09、0.4±0.54(P＜0.05)、0.2± 0.01(P＜0.01).4.60±1.14、1.20±1.70(P＜0.01)、0.80±1.09(P＜0.01).结论NK细胞具有抑制LCI-D20肝癌生长及防治肝癌切除术后转移复发的作用.NKG5-SV基因转染NK细胞后可提高NK细胞的抗肝癌作用.     

腺病毒介导MDA-7/IL-24选择性杀伤肝癌 细胞HepG2的研究

目的 ：观察MDA-7/IL-24基因对肝癌的选择性杀伤作用，为肝癌的基因治疗提供理论基础。 方法 ：将携带人MDA-7/IL-24基因的腺病毒Ad.mda-7感染人正常肝细胞L02和肝癌细胞HepG2;用RT-PCR法观察MDA-7/IL-24基因的表达;ELISA方法检测细胞培养上清液中MDA-7/IL-24蛋白的浓度;4甲基偶氮唑蓝染色法（MTT）及Hoechst染色观察MDA-7/IL-24对肝癌细胞的生长抑制和杀伤作用;Annexin-V和PI双染后流式细胞仪检测2种细胞的凋亡;用流式细胞仪检测细胞周期。 结果 ：复制缺陷型腺病毒能介导外源基因MDA-7/IL-24在肝癌细胞株HepG2和正常细胞L02中的高效表达;细胞培养上清液中有MDA-7/IL-24蛋白的表达; MDA-7/IL-24能明显抑制肝癌细胞生长并可促进肝癌细胞的凋亡;MDA-7/IL-24阻滞肝癌细胞于G2/M期，能选择性杀伤肝癌细胞而对正常的肝细胞无阻滞作用和毒性作用。结论 ：复制缺陷型重组腺病毒载体Ad.mda-7能介导MDA-7/IL-24基因在人肝癌细胞中高效表达，促使细胞增殖阻滞及诱导肿瘤细胞凋亡，选择性地杀伤肝癌细胞HepG2，而对正常肝细胞L02无任何毒性作用。     

体外转染小鼠白细胞介素12基因抑制膀胱癌EJ细胞的实验研究

目的将含有小鼠白细胞介素12（mIL-12）全长基因的质粒转染到膀胱癌EJ细胞中,观察脾细胞对转染mIL-12膀胱癌细胞的杀伤作用。方法用脂质体转染法将含有mIL-12全长基因质粒转染到EJ细胞中,ELISA法检测IL-12表达水平。在脾细胞作用0～2 d时ELISA法连续检测上清干扰素γ（INF-γ）水平变化。转染后40 h加入制备好的小鼠脾细胞悬液约1×10^6作用24 h后,MTT法检测对膀胱癌细胞的抑制率。结果转染后40、60 h检测到IL-12的高表达（375±15） pg／ml和（400±50）pg／ml,较未转染组9～15 pg／ml明显增高;在EJ细胞表面可以检测到IL-12的表达,而对照组则无;加入脾细胞悬液1 d后,脾细胞加转染后的EJ细胞组的抑制率为58．7％（P〈 0．025）,而脾细胞加未转染EJ细胞组、单纯EJ细胞组以及转染的EJ细胞组差异无统计学意义（P〉 0．05）。脾细胞加入转染后EJ细胞上清24 h的。INF-γ为（155±21）pg／ml,与未转染组（65±8）pg／ml比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论体外转染mIL-12基因到膀胱癌EJ细胞中能够表达IL-12,在小鼠脾细胞存在的条件下,通过一系列的免疫调节作用,诱导T细胞、NK细胞等产生INF-γ等细胞因子从而杀伤膀胱癌细胞。