子囊霉素工程菌的构建及初步发酵工艺优化

摘要：基于子囊霉素的生物合成途径和机制，根据生物合成基因簇序列设计引物，应用PCR扩增游动放线菌(Antinoplanes sp.)N902-109赖氨酸合成途径关键基因——天冬氨酸激酶/天冬氨酸半醛脱氢酶/磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(lysC/asd/ppc)基因，整 合至子囊霉素产生菌株吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中，成功构建了过表达lysC/asd/ppc基因的重组工程菌，命名为 AS-07。将AS-07工程菌进行摇瓶发酵研究，结果表明，与野生菌相比，子囊霉素的产量提高了25%。通过初步优化摇瓶发酵工 艺，AS-07工程菌与野生菌相比，子囊霉素的产量提高了85%。     

雷帕链霉菌次级代谢产物及其生物合成的研究进展

摘要：雷帕链霉菌(Streptomyces rapamycinicus)是一种重要的工业菌株,主要用于生产新型大环内酯类抗生素——雷帕霉 素。该抗生素具有抗真菌、抗肿瘤、免疫抑制和抗衰老等众多生物活性,临床上主要用作器官移植的免疫抑制剂以及抗肿瘤药 物。全基因组测序表明,雷帕链霉菌野生型菌株NRRL5491基因组全长12.7Mb,编码多达48个次级代谢产物生物合成基因簇(共 长达3Mb),证明其具备强大的次级代谢潜力。除雷帕霉素以外,至今已有多种活性天然产物被鉴定,包括放线菌酸、尼日利亚 菌素、洋橄榄叶素、安莎类抗生素和六烯类抗生素等,相关合成基因簇及其生物合成途径已被解析。本文将就雷帕链霉菌中各 种次级代谢产物的生物学功能、生物合成基因簇及其生物合成过程等研究进展进行总结梳理,并就如何更好挖掘雷帕链霉菌中 的活性天然产物进行简单展望与讨论。     

雷帕霉素生物合成基因簇的研究进展

雷帕霉素有效的免疫抑制作用备受关注,尤其是雷帕霉素产生菌吸水链霉菌的雷帕霉素生物合成基因簇的测定,雷帕霉素的生物合成途径得到全面系统的研究.本文从雷帕霉素基因簇出发,重点综述雷帕霉素生物合成代谢的研究进展.     

雷帕霉素及其衍生物开发现状、作用机制及生物合成研究进展

目的 介绍了近年来雷帕霉素及其衍生物的开发现状、作用机制与生物合成途径,探讨了通过前体定向生物合成与诱变生物合成的方式,获得雷帕霉素衍生物的研究进展,展望了雷帕霉素及衍生物的研究前景.方法 分析、归纳、总结近年来发表的相关文献.结果与结论 雷帕霉素及其衍生物是新型强效的免疫抑制剂与抗肿瘤药物,具有抗真菌、抗增殖及潜在延长哺乳动物寿命周期等作用.采用前体定向生物合成、诱变生物合成与组合生物合成的方式,可快速获得其具药理活性的衍生物.基于生物合成途径,采用系统生物学相关手段可获高产工程化菌种应用于工业化生产.     

链霉菌沉默生物合成基因簇调控的研究进展

本文以天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)中黄色色素coelimycin生物合成调控及开发策略的研究进展为代表,介绍了链霉菌中沉默生物合成基因簇调控激活的新进展,为链霉菌天然产物基因簇的挖掘和新次级代谢产物的发现提供研究思路。     

海洋放线菌Streptomyces costaricanus SCSIO ZS0073中fungichromin生物合成基因簇的分析鉴定

目的 对分离自我国广西红沙红树林湿地公园的放线菌菌株Streptomyces costaricanus SCSIO ZS0073进行基因组测序分析,并对其生产的制霉色基素(fungichromin)的生物合成基因簇进行分析鉴定。 方法 对S. costaricanus SCSIO ZS0073菌株进行基因组提取,利用Highseq4000和PacBio SMRT技术相结合的手段对该菌株进行了基因组完成图测序;利用生物信息学方法对基因组进行注释并寻找fungichromin的生物合成基因簇,对fungichromin生物合成骨架基因fgmJ1进行置换突变,确定fungichromin生物合成基因簇,结合fungichromin结构特征和其基因簇内遗传信息及聚酮化合物的生物合成原理,对其生物合成途径进行推测。 结果 全基因组测序发现S. costaricanus SCSIO ZS0073菌株基因组含有一条线性染色体和一个圆形质粒,基因组含有36个次级代谢产物生物合成基因簇。利用基因敲除手段对fungichromin的生物合成基因簇进行了确认并进行了生物合成途径推导。 结论 fungichromin生物合成基因簇的确定和生物合成途径的推导为该化合物的基因工程改造研究奠定了分子基础。     

新型强效免疫抑制剂雷帕霉素的生物合成

雷帕霉素是吸水链霉菌产生的新型强效免疫抑制剂,本文综述了雷帕霉素的生物合成,探讨了雷帕霉素构成单元、相关酶及雷帕霉素效价三者之间的关系,指出以雷帕霉素生物合成相关酶或前体含量为指标可能是筛选雷帕霉素高产突变株的又一途径。     

链霉菌抗生素生物合成的基因调控

链霉菌中抗生素生物合成受到许多调控基因的调控,它们通过途径特异性调控方式、全局性调控以及双组分调控方式对基因表达进行调控.概述这些调控基因将有利于改良抗生素生产菌株及新型抗生素的研究,并为改造链霉菌抗生素生物合成相关基因、提高产量提供理论依据.本文归纳了国内外链霉菌抗生素生物合成基因簇各调控基因及其研究进展.     

恩拉霉素与雷莫拉宁生物合成研究进展

目前耐药革兰阳性菌在医院感染中的比例不断上升,具有新型革兰阳性病原菌抑制机制的恩拉霉素和雷莫拉宁成为目前研究的热点.含有17个氨基酸的肽类抗生素,恩拉霉素和雷莫拉宁的生物合成基因簇已分别从链霉菌Streptomyces fungicidicus ATCC21013和游动放线菌Actinoplanes sp.ATCC33076中克隆到.本文综述了恩拉霉素与雷莫拉宁生物合成途径研究的最新进展,为进一步利用基因工程手段对其进行结构改造提供依据.     

海洋放线菌SCSIO 07745中红霉素衍生物的分离、鉴定和生物合成基因簇的分析

目的：对从中国南海沉积物样品中分离的放线菌SCSIO 07745中抑菌活性次级代谢产物进行研究,并对相应产物的生物合成基因簇进行分析。方法：提取菌株SCSIO 07745基因组DNA,利用Illumina Hiseq和PacBio SMRT技术进行基因组测序;通过对16S rDNA序列进行分析构建系统发育进化树以鉴定菌种;以有机溶剂萃取得到发酵产物并利用正相反相柱层析等色谱手段进行分离纯化;通过波谱数据分析对化合物进行结构鉴定。利用生物信息学技术对基因组进行注释并对合成该化合物的基因簇进行定位分析,推导其生物合成途径。结果：该放线菌被鉴定为糖多孢红霉菌Saccharopolyspora erythraea,从其发酵产物中分离鉴定了2个大环内酯类化合物sporeamicin A(1)和erythromycin A enol ether(2)。全基因组序列测序发现该菌株基因组DNA为线状,含有31个次级代谢产物生物合成基因簇,其中基因簇3可能负责红霉素衍生物的生物合成,并对其生物合成途径进行了推导。结论：筛选得到了1株产生红霉素类化合物的海洋糖多孢红霉菌S. erythraea SCSIO 07745,为红霉素类抗生素的开发提供了新的菌株资源。同时,该菌株的全基因组序列为其蕴藏的次级代谢产物的挖掘奠定了基础。     

两株携带blaNDM-1基因布氏柠檬酸杆菌耐药性及同源性分析

目的 探讨携带blaNDM-1基因布氏柠檬酸杆菌的耐药特点及同源性。方法 试验菌株为从临床尿液标本中分离到的两株耐碳青霉烯类的布氏柠檬酸杆菌。采用Vitek-2全自动微生物鉴定与药敏分析系统进行鉴定及药敏试验,PCR扩增blaNDM-1基因并测序验证,质粒接合试验了解blaNDM-1基因是否可通过质粒进行水平传播,并对两菌株进行多位点序列分型(MLST)及ERIC-PCR分析。结果 两株菌对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类和碳青霉烯类均高度耐药,并携带blaNDM-1基因。接合试验成功将两株菌的blaNDM-1基因转移至大肠埃希菌EC600。MLST分型为ST171,ERIC-PCR发现扩增条带位置完全相同,即为同一基因型。结论     

两株携带blaNDM-1基因布氏柠檬酸杆菌耐药性及同源性分析

目的 探讨携带blaNDM-1基因布氏柠檬酸杆菌的耐药特点及同源性。方法 试验菌株为从临床尿液标本中分离到的两株耐碳青霉烯类的布氏柠檬酸杆菌。采用Vitek-2全自动微生物鉴定与药敏分析系统进行鉴定及药敏试验，PCR扩增blaNDM-1基因并测序验证，质粒接合试验了解blaNDM-1基因是否可通过质粒进行水平传播，并对两菌株进行多位点序列分型(MLST)及ERIC-PCR分析。结果 两株菌对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类和碳青霉烯类均高度耐药，并携带blaNDM-1基因。接合试验成功将两株菌的blaNDM-1基因转移至大肠埃希菌EC600。MLST分型为ST171，ERIC-PCR发现扩增条带位置完全相同，即为同一基因型。结论 检出两株具有相同基因型ST171携带blaNDM-1基因的布氏柠檬酸杆菌，且菌株对碳青霉烯类在内的多种抗生素均高度耐药。     

G17-白喉毒素嵌合蛋白的表达、纯化和免疫原性初步研究

目的  构建胃泌素多肽G17-白喉毒素A亚单位（diphtheria toxin subunit A,DTA）嵌合蛋白,并初步研究其免疫原性。方法  用酶切法将编码G17的基因与DTA基因连接后,插入载体pET11C,并在大肠埃希菌BL21中表达。先后用阴离子交换色谱法和分子排阻色谱法对表达的目的蛋白进行纯化。用纯化的G17-DTA免疫NIH小鼠,并用ELISA检测小鼠抗G17抗体。结果  构建的G17-DTA嵌合蛋白可在大肠埃希菌中高效表达,表达量达0.5~0.6 mg/ml菌液。经2次纯化后,G17-DTA的纯度可达95%。纯化的G17-DTA在小鼠中诱生了抗G17抗体。结论  构建的G17-DTA嵌合蛋白能在大肠埃希菌中表达,而且在小鼠中具有免疫原性。     

磺基水杨酸处理对高效液相色谱法检测人纤维蛋白原中蔗糖含量的影响

目的:研究磺基水杨酸处理样品对高效液相色谱法检测人纤维蛋白原中蔗糖含量的影响。方法:通过比较未经或经磺基水杨酸处理的蔗糖对照品溶液色谱图,确认磺基水杨酸处理对蔗糖水解的影响。蔗糖对照品溶液和人纤维蛋白原样品分别经磺基水杨酸处理2、3、4、5 h,研究处理时间对蔗糖水解的影响。用未经和经磺基水杨酸处理的蔗糖对照品溶液分别...     

B群脑膜炎球菌疫苗研究进展

 脑膜炎球菌是引起流行性脑脊髓膜炎的主要病原菌,是全球重要的公共卫生问题。目前仍缺少安全有效的疫苗用于控制和预防B群脑膜炎球菌引起的感染。此文对B群脑膜炎球菌疫苗研究进展及存在问题进行综述。     

火箭免疫电泳在W135群脑膜炎球菌发酵工艺优化中的应用

目的  应用火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis，RIEP）检测W135群脑膜炎球菌（group W135 meningococcus，MenW135）发酵液的多糖含量，来指导MenW135发酵工艺的改进。方法  制备家兔MenW135抗血清，并确定RIEP琼脂糖凝胶中的抗血清浓度。分别以不同发酵条件培养MenW135，并分别在培养2、3、4、5、6 h时取样，用分光光度法检测菌液的吸光度（A），用RIEP检测菌液的多糖含量。结果  检测MenW135多糖的RIEP琼脂糖凝胶中的抗血清浓度确定为0.1%。在MenW135发酵2~5 h期间，MenW135多糖含量与其A值呈正相关性。然而，在MenW135发酵5~6 h期间，菌液的A值不增加，但菌液的多糖含量仍在升高。结论  相对于通过菌液的A值来观察菌液的多糖含量，RIEP检测能直接获得菌液的多糖含量，从而更好地指导MenW135多糖疫苗发酵工艺的优化。     

b型流感嗜血杆菌结合疫苗接种反应及其处理

 b型流感嗜血杆菌（ Haemophilus influenzae type b,Hib）疫苗在中国属于二类疫苗,其安全性良好,接种反应发生率低。Hib疫苗接种后的一般反应包括局部红肿、疼痛,低热等,无需处理可自愈。Hib疫苗接种后的异常反应包括局部水泡和化脓、全身过敏性皮疹和紫癜、消化道反应、情绪异常等,这些异常反应经对症治疗可得到恢复。     

两性霉素B分离纯化工艺研究

本文开发了一种高纯度两性霉素B的分离纯化工艺,通过工艺参数精细化控制,探索了两性霉素B的溶出率和乙醇加入量、溶液pH的关系,将陶瓷膜超滤技术应用于浸泡液处理,以及表面活性剂甘油应用于结晶体系,并确定了结晶的最佳pH值,本方法制备的两性霉素B结晶粉的生物效价检测含量大于970u/mg,面积归一百分含量大于95%,杂质含量低,产品质量优于同行业产品。     

酶标仪法测定微孔板发酵液中林可霉素

目的 建立酶标仪法测定微孔板发酵液中林可霉素的含量。方法 对酶标仪法的主要影响因素进行优化,并验证此 方法的精密度;在此基础上,分别利用酶标仪法与分光光度计法测定 25 株突变株经 48 孔板发酵后林可霉素的含量并进行曲线 拟合,以验证两种方法的相关性。结果 确定了在测定林可霉素含量的适宜反应体系中 0.02mol/L 氯化钯溶液为 150μL,盐酸添 加浓度为 1mol/L,且该方法精密度良好;拟合曲线相关系数 R2 =0.9551,显示两种方法具有很好的相关性。结论 该实验结果表 明酶标仪法能准确、快速地测定微孔板发酵液中林可霉素的含量,为后续高通量选育林可霉素高产菌株奠定了基础。     

两性霉素B分离纯化工艺研究

本文开发了一种高纯度两性霉素B的分离纯化工艺,通过工艺参数精细化控制,探索了两性霉素B的溶出率和乙醇加入量、溶液pH的关系,将陶瓷膜超滤技术应用于浸泡液处理,以及表面活性剂甘油应用于结晶体系,并确定了结晶的最佳pH值,本方法制备的两性霉素B结晶粉的生物效价检测含量大于970u/mg,面积归一百分含量大于95%,杂质含量低,产品质量优于同行业产品。 本工艺稳定,流程简单,便于规模化生产。