药品微生物检测实验室环境菌库的建立

目的 建立药品微生物检测实验室环境菌库。方法 从药品微生物检测实验室环境中不同部位、设备材料及活动人员进行连续7个月采样收集获得248株细菌和6株霉菌,对收集的细菌采用全自动微生物生化鉴定仪(Vitek2 Compact)进行鉴定,对生化鉴定无确切结果的90株细菌及6株霉菌均采用3500 MicroSeq基因测序分析系统进行细菌16S rDNA和霉菌LSU rDNA测序鉴定,同时也对某次采样收集的6株金黄色葡萄球菌采用Diversilab系统进行同源性分析。结果 通过整理和分析收集获得的254株菌的鉴定结果,初步建立了药品微生物检测实验室环境菌库。结论 为今后开展污染水平的风险评估和不良事件调查提供技术平台,同时也为制药企业开展建立环境微生物信息库和微生物污染溯源提供技术指导。     

洋葱伯克霍尔德菌群(Bcc)的分类鉴定研究进展

目的：探讨适用于药品微生物控制中的洋葱伯克霍尔德菌群(Bcc)的鉴定策略。方法：结合药品微生物控制中对Bcc的鉴定和分型需求，对目前应用较为广泛的微生物鉴定技术的特点和鉴定或分型能力进行阐述和讨论，提供满足不同鉴定水平要求的鉴定策略。结果：对于Bcc，不同的鉴定方法能达到的鉴定水平存在差异。手动/自动化的生化鉴定系统可达到属/菌群水平的准确鉴定；基质辅助激光解析电离飞行质谱(MALDI-TOF MS)以及16S rRNA序列分析技术可达到菌群的准确鉴定；看家基因如 recA或hisA等的序列分析，基本可达到菌种水平的鉴定，必要时，可补充多位点序列分型(MLST)进行确认。MLST、核糖体分型(Ribotyping)或全基因组测序(WGS)技术则适用于菌株水平的分型和溯源。结论：明确不同的鉴定技术对于Bcc的鉴定能力和应用特点，针对不同的鉴定需求给出相应鉴定方法的建议，为在实际应用中涉及Bcc检验、鉴定和溯源分析的生产企业、检验人员提供参考和借鉴。     

洁净室环境中一株细菌bd5的分离鉴定及系统发育分析

对一株从药品检验洁净室中分离得到的环境菌bd5进行系统分类鉴定。该菌株的16S rDNA序列测序及系统发育分析结果显示,bd5属于罗氏菌属(Rothia),与该属的7个种系统发育关系最密切,因基因序列相似性皆大于95.8%而聚为一簇。虽然bd5与污泥罗氏菌(Rothia amarae)单独相聚,形成一个独立亚分支,但序列差异性达1.8%。生理生化试验结果进一步表明该菌不仅有罗氏菌"属"级的生化特征,还具有与其他种相区别的生化反应。综合形态学特征、生化特性、16S rDNA序列相似性及系统发育关系分析显示,菌株bd5可能为罗氏菌属的一个潜在新种。     

基于多种微生物鉴定技术的制药企业环境微生物鉴定结果分析和应用研究

目的 运用多种微生物鉴定技术建立制药企业无菌制剂高风险生产区环境微生物鉴定信息库。方法 连续4个季度对中间体、制药用水、洁净空间、人员设备表面等收集微生物,采用VITEK生化鉴定、MALDI-TOF MS蛋白鉴定和16S rRNA/ITS基因鉴定技术进行鉴定,结合微生物形态学和来源信息进行分析,建立相应的微生物鉴定信息库。结果 共收集获得89株细菌和5株真菌的鉴定结果,开展相关形态学分析：在收集的94株菌中,革兰氏阳性球菌和革兰氏阳性芽孢杆菌共占比60.6%,是洁净区常见污染菌;B级环境收集到46株微生物,葡萄球菌是主要优势菌属,占比45.7%,其次是芽孢杆菌(17.4%)、微球菌(6.5%)和酵母菌(4.3%),B级还分离到1株洋葱伯克霍尔德菌;制药用水收集到29株微生物,主要为革兰氏阴性菌(58.6%)。结论 本研究建立了融合生化、蛋白、基因鉴定结果的微生物鉴定信息库并开展相关分析,为制药企业开展风险控制,加强对不可接受微生物的管理,开展微生物数据偏差调查和溯源分析提供依据;企业还可利用鉴定结果建立环境微生物地图,有针对性地控制并消除微生物污染,提高无菌保障水平,确保药品质量安全。     

医药工业洁净室洁净空气微生物定性分析与探讨

目的 探讨医药工业洁净室洁净空气中微生物分布情况.方法 对部分洁净室洁净空气进行沉降菌检测,采用形态学观察,生理生化反应检测以及16S rDNA序列测定等技术对微生物进行分析.结果 通过实验共获得放线菌1株,真菌4株,细菌10株.结论 一般洁净空气中以细菌为主,有少量真菌及放线菌,企业生产者应掌握这些菌的分布情况,分析这些菌落形成的原因,对洁净室环境做出针对性控制手段以保证产品质量.     

海洋放线菌WBF16的分类鉴定

鉴定抗菌活性放线菌WBF16的分类地位;通过观察其培养特征、生理生化特性,以及对其细胞壁组分和16S rDNA序列的分析,将该菌鉴定到种;该放线菌为链霉菌属假浅灰链霉菌的一个新菌株.     

实验室药品无菌检查能力的验证及结果分析

目的：通过无菌检查能力验证考查实验室无菌检查水平,提升实验室药品无菌检查能力和实验室管理能力。方法：对3次能力验证共计12个样品,分别采用直接接种法和薄膜过滤法进行无菌检查;采用16S核糖体DNA(r DNA)序列分析法和全自动生化鉴定仪对其中4个阳性结果的16株分离菌株、日常监测发现的29株环境微生物进行鉴定。结果：16株分离菌株分别为金黄色葡萄球菌和白色念珠菌,与29株环境菌不同,结合实验过程的回顾性判断,确认无菌检测结果有菌生长的样品为样品中有微生物污染。12个样品的检验结果为4个有菌生长,8个无菌生长,均为满意结果。结论：实验室可以使用16S rDNA序列分析法和全自动生化鉴定仪对检验发现的污染菌进行鉴定。本研究中无菌检查能力验证的结果分析和能力验证的实施过程的回顾,有利于提高实验室检测结果的准确性和有效性。     

16S rDNA序列分析法在注射剂微生物污染鉴定及溯源分析中的应用

目的 对一次注射剂无菌检查阳性结果进行溯源。方法 采用16S rDNA序列分析法对污染菌A1和污染调查中采集的16株葡萄球菌进行鉴定和同源性分析,并将分析结果用脉冲场凝胶电泳进行验证。结果 A1的鉴定结果为科氏葡萄球菌;科氏葡萄球菌科氏亚种菌株的核糖体16S亚基序列完全相同;结合PFGE分析显示A1来自无菌检查使用的隔离器污染。结论 制药企业可以使用16S rDNA序列分析法进行生产和检验中污染菌的鉴定和溯源,但对于与如科氏葡萄球菌科氏亚种一样核糖体16S亚基序列完全相同的菌株,需要结合其他同源性分析方法进行最终的判定。     

产非达霉素药用植物内生放线菌N12W0304的分类鉴定#br#

目的 对一株分离自药用植物仙鹤草中的产非达霉素菌株N12W0304进行分类研究。方法 通过形态特征、培养特征观察、生理生化特征、胞壁分析及16S rDNA序列分析等多相分类研究对菌株进行鉴定。结果 菌株N12W0304属于游动放线菌属(Actinoplanes sp.)菌株。结论 本报道是首次从仙鹤草中分离到游动放线菌属非达霉素产生菌。     

无菌药品生产企业微生物洁净室微生物污染的鉴定与结果分析

目的:利用DNA测序技术对天津地区5家药品生产企业微生物洁净室采集到的微生物菌株进行测序鉴定和结果分析,为药品微生物污染追踪溯源提供技术支持。方法:采用革兰氏染色技术、VITEKⅡ生化鉴定和分子测序鉴定技术,对我市5家无菌药品生产企业微生物洁净室(A/B和A/C级洁净区)采集到的90株细菌和6株霉菌共计96株菌进行鉴定和分析。结果:通过96株菌株的鉴定结果,发现葡萄球菌属细菌数最多,占全部分离株的50.0%,芽孢杆菌属占18.8%,库克氏菌属占10.4%。其中表面微生物有52株,占54.2%,沉降菌有20株,占20.8%,浮游菌有24株,占25.0%。结论:利用DNA测序技术对采集到的环境菌株进行鉴定结果更为准确可靠,菌株的采集位置及鉴定结果能有效地为无菌药品企业微生物污染情况进行整体分析和风险控制。     

1株甲基杆菌的鉴定

目的：鉴定1株在生物制品生产车间采集的菌株 wh01的种属。方法观察该菌株的形态,并用细菌鉴定仪进行检定。采用 PCR 法扩增菌株的16S rDNA 和甲醇脱氢酶大亚基的 mxaF 基因,用生物信息学软件进行分析。结果该菌株经细菌鉴定仪检定为沙门菌属,但其形态与沙门菌有很大差别,其16S rDNA 和 mxaF基因序列与甲基杆菌属序列的相似性高达99％。结论该菌株属于甲基杆菌属。     

《中国药典》拟收载洋葱伯克霍尔德菌群(Bcc)检查法中标准菌株的稳定性研究

目的：应用现有微生物分类鉴定技术手段,对《中国药典》拟收载洋葱伯克霍尔德菌群(Bcc) 检查法中所选用的标准菌株进行冻存及传代稳定性考察。方法：选取美国药典USP43-NF38 Bcc检查法中的一株Bcc标准菌株ATCC25416为对照菌株。以3株拟收载标准菌株和1株对照标准菌株为试验菌株,分别对这些试验菌株冻存0.5年、1年、2年的样本及连续6代的传代样本进行菌落表型观察、Biolog生化鉴定分析、16S rRNA基因测序及RiboPrinter全自动基因指纹图谱分析,并使用BioNumerics 7.6对核糖体图谱数据进行聚类分析。结果：试验菌株在经冻存及传代后,各菌株表型无明显差异;菌株的Biolog生化鉴定结果虽略有差异,但菌株关键生化代谢属性稳定,其鉴定结果均属Bcc;同时,各菌株的16S rRNA测序结果一致;核糖体带型相似值均大于0.95。结论：在本研究考察的冻存时间及传代次数内,3株《中国药典》洋葱伯克霍尔德菌群检查法拟收载的标准菌株的表型、基因型相对稳定。     

Resistance of the Burkholderia cepacia complex to fosmidomycin and fosmidomycin derivatives

The Burkholderia cepacia complex (BCC) is a group of 17 closely related opportunistic pathogens that are able to infect the respiratory tract of cystic fibrosis patients. BCC bacteria are intrinsically resistant to many antibiotics and are therefore difficult to eradicate. Fosmidomycin could be a new therapeutic agent to treat BCC infections as it inhibits 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (Dxr), a key enzyme in the non-mevalonate pathway essential in BCC bacteria for isoprenoid synthesis. In this study, the antimicrobial activity of fosmidomycin and eight fosmidomycin derivatives towards 40 BCC strains was investigated. All BCC strains were resistant to fosmidomycin, although addition of glucose-6-phosphate reduced the minimum inhibitory concentration values of FR900098, the fosmidomycin acetyl derivative, from 512 mg/L to 64 mg/L for Burkholderia multivorans and B. cepacia. This enhanced activity was linked to increased expression of the genes involved in glycerol-3-phosphate transport, which appears to be the only route for fosmidomycin import in BCC bacteria. Furthermore, upregulation of a fosmidomycin resistance gene (fsr) encoding an efflux pump was observed during fosmidomycin and FR900098 treatment. These results strongly suggest that the observed resistance in BCC bacteria is due to insufficient uptake accompanied by fosmidomycin and FR900098 efflux.     

分枝杆菌的多相分类鉴定

分枝杆菌属除麻风分枝杆菌外,主要包括结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌.近年来,随着结核病(结核分枝杆菌复合群为其致病菌)的回潮,非结核分枝杆菌感染率由4%急速上升到10%,快速和准确地鉴定它们显得非常重要.在我国非结核分枝杆菌的表型鉴定一直沿用以生化实验为核心的传统鉴定方法,且欠缺数值分类的补充分析.全细胞脂肪酸气相色谱分析这种表型鉴定方法仅在有条件的省份开展.随着分子生物学的发展以及系统发育理论的提出,与之相应的基因分型方法也被用于分枝杆菌属的鉴定.本文详细阐述了系统发育的理论以及应用于非结核分枝杆菌的遗传学分类鉴定方法,即DNA-DNA杂交和16S rDNA基因序列分析.为进一步提高表型鉴定的准确性,又详细介绍了一些用于数值分类的应用软件.总之,多相分类鉴定已被广泛应用于非结核分枝杆菌的分类鉴定中.本文也介绍了一些结核分枝杆菌复合群基因分型鉴定方法及其在结核分子流行病学中的广泛应用.     

Identification of fungi based on the nucleotide sequence homology of their internal transcribed spacer 1 (ITS1) region

In this study, we examined the identification of fungi based on the sequence homology of the internal transcribed spacer 1 (ITS1) region. A newly designed primer pair could amplify the target region of all 42 strains tested. The PCR products were sequenced and the sequence homologies were searched by BLAST. It was demonstrated that this method is a reliable identification method at the genus or species level. At present, available databases are still insufficient to identify some fungi, but with the accumulation of further data in the ITS1 database, this method will be available for the identification of fungi.     

Molecular identification and phylogenetic analysis of Bothrops insularis bacterial and fungal microbiota

Bothrops insularis, known as the golden lancehead snake, has its natural habitat restricted to Queimada Grande Island on the southern coast of Brazil. This culture-dependent study aimed to identify microorganisms obtained from the mouth, eyes, and cloaca of this species. Swabs from 20 snakes were collected for fungal and bacterial isolation. DNA was extracted from all samples, and identification was performed by amplifying the ITS1-5.8S-ITS2 regions and the 16S rDNA gene, respectively. All strains were identified and deposited in the GenBank nucleotide database. MEGA v6.0 software was utilized to construct phylogenetic trees. In total, 100 strains were isolated and characterized, from which 42 fungi were distributed into 23 species and 58 bacteria into 13 species. The genus Fusarium was predominant since 11 strains and probably a new species was isolated from this fungus. Pseudomonas aeruginosa and Enterococcus faecalis were the predominant groups of aerobic bacteria isolated. Phylogenetic analyses between bacterial and fungal sequences suggest a similarity between the microorganisms found on the island and on the continent. These findings may be attributed to anthropic actions resulting from both expeditions to the island and actions of migratory birds, which are the main sources of food for snakes.