用Y-参比法测定发酵液中林可霉素的含量

研究发酵液中林可霉素的分光光度测定方法。根据分光光度法测定林可霉素的原理，研究林可霉素的测定影响因素和规律，得出最佳测定波长为380nm、络合反应时间为30min、浓度为0．02mol／L的络合剂PdCl2剂最佳用量为0．5ml、林可霉素浓度在20—300μg／ml范围内吸光度A与林可霉素浓度C有线性关系。根据Y-参比法，建立了测定发酵液中林可霉素的含量的有效方法。     

微孔板法与传统方法对比测定花菇、猴头菇和茶树菇的抗氧化活性

目的：对比微孔板法和传统方法分光光度法测定花菇、猴头菇和茶树菇体外抗氧化活性的差异。方法超声波法提取3种菇的水提物和醇提物,以VC为对照品,均与底物1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）反应,其中微孔板法为微孔板结合酶标仪于517 nm波长处快速测定菇类提取物的DPPH·抑制率,传统分光光度法于紫外-可见分光光度计517 nm波长处检测。对2种方法的测定结果进行曲线拟合,并进行方法重复性对比。结果2种方法抗氧化结果IC50基本一致,曲线拟合度较好,差异无统计学意义（P>0.05）;其中对照品VC的微孔板法拟合模型公式为y=23.872Lnx+152.526,分光光度法模型公式为y=22.469Lnx+146.044,2种方法的模型中系数和常数经t检验差异有统计学意义（P<0.01）,提示重叠率高。分别对3种样品的提取液进行曲线拟合,结果显示3种菇提取液2种抗氧化活性测定结果的曲线拟合度均较好,差异有统计学意义（P<0.05）。实验中微孔板法试剂用量较小,精密度更高。结论2种菇类体外抗氧化活性测定方法实验结果一致,差异不明显,微孔板法在试剂用量和精密度方面略具优势。     

混合醇萃取用以降低林可霉素产品中B组分含量的工艺研究

本文以提高林可霉素产品纯度为目的 ,研究了以混合高碳醇为萃取剂从发酵液中提取林可霉素的工艺过程 ;以混合高碳醇 (80 %辛醇∶2 0 %癸醇 )为萃取剂从发酵液 (pH10 )中提取林可霉素 ,常温下 12级连续逆流操作时 ,萃取率可达 92 .8%;萃取相经过洗涤后 ,以等当量的盐酸反萃 ,反萃液经浓缩、脱色和结晶 ,所得产品中林可霉素B含量 (1.3 %)远低于传统丁醇提取工艺产品 (4 .2 %)。在此基础上 ,还探讨了混合高碳醇萃取和丁醇萃取工艺相结合的可行性 ,以丁醇提取工艺的林可霉素一次结晶为原料 ,通过两级萃取和单级洗涤操作 ,再以盐酸溶液反萃 ,结晶后产品中林可霉素B含量小于 1.8%,提升了产品质量等级     

分步酸解法快速检测发酵液中普鲁兰糖含量

建立分步酸解快速检测发酵液中普鲁兰糖含量的方法。使用不同浓度盐酸对两个相同发酵液样品进行酸解,分别将蔗糖和普鲁兰糖降解为单糖,再利用生物传感分析仪对酸解之后样品中葡萄糖含量进行定量分析,从而利用两者之间葡萄糖含量的差值计算出发酵液中普鲁兰糖的含量。在对酸解时间、盐酸浓度、蔗糖和普鲁兰糖检测范围以及该方法精密度和准确度进行研究之后,确定了蔗糖酸解条件为:0.6 mol/L盐酸、沸水浴3 min;普鲁兰糖的酸解条件为:2 mol/L盐酸、沸水浴30 min。实验证明,此方法精密度良好,RSD为0.7743%,准确度高,回收率为97.96%~100.72%;用时较短,40 min左右即可较准确的测定发酵液中普鲁兰糖含量。实验证明此方法是一种可行的高效、快速测定发酵液中普鲁兰糖含量的方法。     

氟化钠对林可霉素发酵的影响

研究了在15L发酵罐中添加氟化钠对林可霉素合成的影响。结果表明,96h向培养基中添加100mg/L氟化钠,发酵液中林可霉素的效价达5795u/ml,比对照提高12.6%。进一步研究发现,氟化钠可以降低糖酵解途径中丙酮酸激酶的酶活力,使更多碳源流向磷酸戊糖途径,可为林可霉素合成提供更多前体,从而提高林可霉素产量。     

复方林可霉素滴耳液中林可霉素质量浓度测定方法的研究

目的:建立复方林可霉素滴耳液中林可霉素质量浓度测定方法。方法:采用高效液相色谱法(HLPC)和旋光法测定林可霉素质量浓度。结果:采用HLPC法与旋光法测定林可霉素质量浓度分别在0.79～3.20mg/mL、17.90～35.70mg/mL范围内,线性关系良好;平均回收率与RSD分别为98.23%,100.10%与1.17%,0.14%。结论:旋光法操作简便、快捷,准确度高,可用于快检及半成品检测;HLPC法准确度高,用于成品检测。     

HPLC法测定盐酸林可霉素注射液含量的不确定度分析

目的建立HPLC法测定盐酸林可霉素注射液含量的不确定度分析方法。方法按照测量步骤,根据《测量不确定度评定与表示》（JJF1059—1999）中有关规定评估其不确定度。结果盐酸林可霉素注射液中林可霉素含量测定的合成不确定度为0．3％,扩展不确定度分别为0．6％（K=2）。结论测量不确定度可用于对盐酸林可霉素注射液含量测定结果的评定。     

高效液相法测定林可霉素工业发酵干燥残渣中的药物残留

目的用高效液相色谱法分离分析林可霉素发酵工程药物残渣中林可霉素的含量。方法色谱柱为ZORBAX SB-C18色谱柱(5μm,4.6mm×150mm);流动相为硼砂缓冲液(0.05mol/L,pH=6.0)∶甲醇(42∶58);流速为1.0ml/min;检测器:紫外可变波长检测器;检测波长为214nm;检测灵敏度为0.01AUFS。结果标准曲线的回归方程:A=3483.7C-11.4(n=5,r=0.9999,线性范围为0.111~8.00μug/ml)。三批发酵工程药渣中林可霉素的残留量分别为0.412%、0.389%、0.423%。结论该方法简便、准确、高效,可用于发酵工程提取效率的判断,以及药渣中药物残留的判断,为药物残留应用于生物肥料生产提供可靠依据。     

比浊法测定红霉素生物效价及其高通量测定方法探讨

基于比浊法测定抗生素体外抑菌活性原理,以红霉素发酵液为研究对象,采用96孔微孔板培养检定菌,直接用酶标仪检测各孔的光密度,定量分析发酵液中红霉素含量,并与管碟法比较.本文建立的抗生素生物效价检测方法具有快速、高效、样品和试剂用量少、结果可靠等优势,适合在有检测大量样品和快速获取结果的工作中推广.     

免疫比浊法测定血清淀粉样蛋白A的钩状效应及其解决方案

目的探讨研制的血清淀粉样蛋白A(SAA)试剂盒的钩状效应及其解决方法。方法以83个西门子定值血清为研究对象,分析研制的SAA试剂盒的线性范围、准确度和精密度等性能;用试剂盒检测超高值血清样本,验证是否存在钩状效应,并研究稀释法能否解决钩状效应。结果 SAA试剂盒线性范围为1～200 mg/L,测定值与样本定值之间的偏差在20%以内,精密度CV均3.0%。浓度超出200 mg/L样本的实测值明显低于定值,浓度范围在1～1000 mg/L的拟合曲线未出现明显的下降趋势,而1～2000 mg/L、1～3000 mg/L拟合曲线出现明显的下降趋势,存在钩状效应。用稀释法测定异常值样本,测定值与定值相近。结论所发现的非正常测定值由钩状效应所致,稀释法能够解决钩状效应问题。     

火箭免疫电泳在W135群脑膜炎球菌发酵工艺优化中的应用

目的  应用火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis，RIEP）检测W135群脑膜炎球菌（group W135 meningococcus，MenW135）发酵液的多糖含量，来指导MenW135发酵工艺的改进。方法  制备家兔MenW135抗血清，并确定RIEP琼脂糖凝胶中的抗血清浓度。分别以不同发酵条件培养MenW135，并分别在培养2、3、4、5、6 h时取样，用分光光度法检测菌液的吸光度（A），用RIEP检测菌液的多糖含量。结果  检测MenW135多糖的RIEP琼脂糖凝胶中的抗血清浓度确定为0.1%。在MenW135发酵2~5 h期间，MenW135多糖含量与其A值呈正相关性。然而，在MenW135发酵5~6 h期间，菌液的A值不增加，但菌液的多糖含量仍在升高。结论  相对于通过菌液的A值来观察菌液的多糖含量，RIEP检测能直接获得菌液的多糖含量，从而更好地指导MenW135多糖疫苗发酵工艺的优化。     

青霉素酰化酶电极

用海藻酸钠-氯化钙包埋法制备青霉素酰化酶电极,电极涂液中海藻酸钠浓度为1％,酶量大于15U/100mg较好。经聚乙烯亚胺处理的电极的抗磷酸盐性能良好,测试在pH 7.05缓冲液中进行,加样搅拌平衡后,取停止搅拌5min后的pH读数,△pH-青霉素G浓度的线性范围为0～1.88mg/ml。温度和pH对pH响应值均有影响。     

一种复合蛋白粉对林可霉素发酵的影响

经前期摇瓶试验筛选获得一种能够提高林可霉素发酵水、平的复合蛋白粉,使摇瓶发酵单位提高至4500μg/ml。在200 L发酵罐放大试验过程中,结合中间补料,考察了氮源对林可霉素产生菌菌丝生长及产物合成的影响。结果表明,含有复合生白粉的培养基中,溶解磷浓度显著高于对照组和其他试验组,显著延缓菌丝自溶,使林可霉素发酵单位提高至9561μg/ml。添加相相同浓度无机磷的培养基试验组虽然同样能够延缓菌丝的自溶和促进林可霉素的合成,但其提高能力远低于含复合蛋白粉培养基组。推测复合蛋白粉中的有机磷源可能在林可霉素的,生物合成过程中起重要作用。     

响应面法优化林可霉素产量与组分

以林可霉素A(Lin A)产量提高以及林可霉素B组分(Lin B)含量降低为目标，在单因素实验基础上，利用响应面法对林可链霉菌18-8菌株的含硫前体物质(硫酸钠、甲硫氨酸、半胱氨酸)与戊糖磷酸途径(HMP)的关键前体(葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钠)以及相关醇类、离子(肌醇、氯化钴)等物质进行组合优化。首先对7个因素进行Plackett-Burman实验，筛选得到3个显著性因子：葡萄糖酸钙、肌醇和氯化钴。再通过Box-Behnken设计3因素3水平实验，利用Design-Expert 8.5软件进行回归分析，得到最佳优化条件为：氯化钴7.97mg/L、葡萄糖酸钙6.0g/L、肌醇0.42g/L。摇瓶验证Lin A液相效价为5210mg/L，比优化前提高21%，Lin B含量为4.3%，比出发菌株的Lin B含量(6.0%)降低39.5%；在15L发酵罐中进行发酵实验，Lin A液相效价可达8980mg/L，比对照(6630mg/L)提高35%，Lin B含量在90h达到最低含量2.4%，相比对照Lin B含量(4.8%)降低50%，效果显著。     

紫外分光光度法快速测定庆大霉素 C1a 含量在高通量筛选中的应用

目的 探索庆大霉素 C1a 含量的快速检测方法,实现诱变菌株的高通量筛选。方法 以紫外分光光度法作为检测庆 大霉素 C1a 含量的手段,对庆大霉素 C1a 单组分生产菌株进行 ARTP、LiCl、微波和 ARTP+LiCl 诱变,通过高通量筛选获得高产 菌株,并在 5L 发酵罐中对高产稳定性菌株进行验证。结果 紫外分光光度法和高效液相色谱法对发酵液中庆大霉素 C1a 含量进 行测定,最大相对误差为 3.98%;筛选获得了 10 株高产菌株,其中 AL324 菌株与出发菌株相比,摇瓶效价提高了 52%;通过稳 定性传代实验,获得了 4 株高产稳定性菌株。5L 发酵罐验证实验表明 AL324 与出发菌株相比效价提高了 81.3%。结论 紫外分 光光度法可以快速检测发酵液中庆大霉素 C1a 含量,该方法应用于高通量筛选中,获得了高产菌株,筛选结果表明 ARTP+LiCl 复合诱变方法的正突变率较高,是一种有效的庆大霉素 C1a 高产菌株诱变方式。     

透明颤菌血红蛋白基因的克隆及其在林可链霉菌中的表达

目的通过将透明颤菌血红蛋白基因vgb克隆到林可链霉菌染色体黑色素生物合成基因m elC位点,使m elC基因被破坏失活,vgb基因实现表达同时提高林可霉素产量。方法构建大肠杆菌-链霉菌重组质粒pYHT04,通过接合转移实验将重叠延伸PCR得到的具有红霉素抗性基因启动子的透明颤菌血红蛋白基因,以双交换的方式整合进林可链霉菌黑色素生物合成基因m elC中。采用不同装瓶量摇瓶发酵,HPLC检测发酵液中林可霉素含量。结果重组菌株颜色变浅,CO结合差光谱显示在420 nm处有明显吸收峰,随着装瓶量的增加重组菌株发酵液中林可霉素效价与对照菌株相比降低幅度较小。结论重组菌株m elC基因失活不能继续合成黑色素,vgb基因得到表达并表现出生物学功能,限氧条件下重组菌株发酵液中林可霉素效价高于对照菌株,有希望应用于工业发酵生产。     

氯离子对灰黄霉素发酵的影响

在灰黄霉素发酵培养基中，分别用单加NaCl，单加KCl和同时加入NaCl,KCl三种方法提供灰黄霉素生物合成中所必需的Cl^-。比较三种方法对灰黄霉素发酵影响的差别。当提供的Cl^-浓度为0.214mol/L，单用KCl时灰黄霉素的发酵单位最高，而单用NaCl时，发酵液中的去氯灰黄霉素含量明显低于其它两种方法。     

冬凌草甲素对膀胱癌T24细胞增殖的抑制作用

目的探讨不同浓度的冬凌草甲素（ORI）在不同时间点对膀胱癌T24细胞增殖的抑制作用,为临床决策提供参考依据。方法将冬凌卓甲豢作用于T24细胞,利用酶标仪在不同时间点（λ=570nm）测定不同浓度的冬凌草甲素吸光度,同样方式用MTT法检测细胞的抑制率,流式细胞仪测定细胞凋亡率,其数值均以均数±标准差表示,每组结果由两位研究者重复测量2次校埘。结果随着培养时间的延长及浓度的增加,T24细胞的吸发光度数值呈明显下降趋势,差异有统计学意义（P〈0．05）。浓度为8μmol／L时抑制率递增,16μmol/L时抑制率已接近50％,而32μmol／L时抑制率最高可达70％以上,变化显著,差异有统计学意义（P〈0．05）。随时间、浓度梯度的变化,T24细胞凋亡率不断增加,最高可达60％以上,差异有统计学意义（P〈0．05）。证明冬凌草甲素对膀胱癌T24细胞增殖的抑制具有明显的浓度-效应与时间-效应的关系。结论冬凌草甲素可诱导膀胱癌T24细胞凋亡,有明显的抗肿瘤作用。     

基于淀粉酶活性检测的麦芽质量评价方法

目的：建立基于淀粉酶活性检测的麦芽质量评价方法,并对不同产地麦芽药材进行质量评价。方法：采用平衡透析的方法去除麦芽中干扰3,5-二硝基水杨酸（DNS）显色的还原糖,以可见光分光光度法和酶标仪吸收光比色法测定麦芽中淀粉酶水解淀粉所产生的还原糖含量,并据此计算得到淀粉酶的活力。酶促反应最佳pH为5．6,反应时间为5分钟,测定波长为540nm,DiNS显色剂用量为2mL,显色时间为15分钟。结果：可见光分光光度法和酶标仪吸收光比色法均有较好的精密度和重复性。不同地区麦芽药材的淀粉酶活性差异较大,最低值和最高值分别为81．14和571．22U·g-1。结论：麦芽的淀粉酶活性测定方法可用于麦芽类药材的质量评价。