参与抗生素生物合成的FADH_2依赖型卤化酶研究进展

从发现第一个天然卤化物到现在已有100多年了.在已发现的约4500个天然卤化物中有很多在医药等领域应用广泛,其中包括许多重要的抗生素.直到19世纪90年代中期,人们一直认为生物卤化反应主要由卤过氧化物酶负责催化.近期在许多关于抗生素生物合成基冈簇的研究中发现FADH_2依赖型卤化酶催化的卤化反应殖是许多微生物及其它生物中的主要卤化机制.本文综述了参与抗生素生物合成的FADH_2依赖型卤化酶的发现,催化机制及各种来源的该类卤化酶研究进展,并介绍了该类酶在组合生物合成及寻找天然卤化物等方面的应用.     

放线菌1161代谢产物分离纯化及其菌种鉴定

本文对放线菌1161粗提物进行抗菌活性检测,并利用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析该菌株代谢产物,然后对其代谢产物1161-S8和1161-S9进行分离,最后对该菌株进行分类鉴定。结果表明,该菌株代谢产物对Bacillus subtilis、Sarcina lutea、Staphylococcus aureus、methicillin-resistant Staphylo-coccus aureus(MRSA)、vancomycin-resistant Enterococcus faecalis(VRE)均显示出较强的抗菌活性;UPLC-MS/MS分析其粗提物显示可能为结构相似的一系列的化合物,通过质谱氢谱和碳谱数据判断1161-S8和1161-S9分别为阿扎霉素F4和阿扎霉素F5。同时结合该菌株培养特性、生理生化特性、16SrRNA序列比对与系统进化分析,将其初步鉴定为Streptomyces malaysiensis,是阿扎霉素新的产生菌。     

海洋放线菌WBF16次级代谢产物的分离与结构鉴定

目的分离和鉴定海洋来源的放线菌WBF16代谢产物中的抗肿瘤活性成分。方法利用大孔树脂、Sephadex LH-20凝胶柱层析、硅胶柱层析、反相柱色谱和HPLC等方法对该放线菌发酵产物进行分离,根据理化性质和波谱学方法进行化学结构的鉴定;利用MTT法来检测化合物的抗肿瘤活性。结果从海洋放线菌代谢产物中分离得到其特征代谢产物色霉素A2(1)和2-甲基-5,6,7-三甲氧基-1,4-萘醌(2)。结论化合物2为新天然产物,化合物1为首次从海洋微生物中分离得到,同时化合物1对人口腔上皮癌KB细胞、人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株SMMC-7721的细胞毒活性较好,IC50值分别为3.81、7.21和12.58μg/L。     

海洋放线菌WBF7的鉴定及其抗肿瘤代谢产物的初步研究

目的 对海洋放线菌WBF7进行菌种鉴定，并对其抗肿瘤代谢产物进行初步研究。方法 通过形态学观察、培养特征和生理生化特性检测、细胞壁组分以及16S rDNA基因序列分析，鉴定菌株；将其发酵液PH调至2、7或10后100℃加热处理1h，研究活性物质的稳定性；用石油醚、乙酸乙酯及其水饱和正丁醇对其发酵液依次进行萃取，研究活性物质的极性；通过MTT法对处理后样品进行抗肿瘤活性研究。结果 通过菌种鉴定，将菌株WBF7归属为灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens）；其抗肿瘤活性物质具有较强的酸碱稳定性和热稳定性，并且易于被乙酸乙酯萃取。结论 海洋放线菌WBF7是第一次从海洋中分离得到的灰略红链霉菌，其抗肿瘤代谢产物稳定性好，大部分极性中等，具有较好的开发前景。     

槲寄生内生菌IA-4-2及其代谢产物的分离、鉴定和神经氨酸酶抑制作用考察

摘 要 目的：研究对神经氨酸酶具有抑制作用的槲寄生内生菌次生代谢产物。方法: 采用AB 8大孔吸附树脂、C₁₈-SPE柱层析结合制备型HPLC等手段进行分离纯化,根据GC-MS和HPLC等分析手段确定化合物结构,并且利用神经氨酸酶抑制药筛选试剂盒测定活性。结果: 从槲寄生内生菌IA 4 2中获得对神经氨酸酶具有较强抑制作用的化合物,经结构鉴定为吲哚-3-甲醛,其对神经氨酸酶的 IC₅₀为128.2 μg?ml^-1。结论:槲寄生内生菌次生代谢产物吲哚-3-甲醛对神经氨酸酶抑制作用明显,值得进一步研究。     

海洋放线菌KSC2-1次级代谢产物化学成分的分离与鉴定

目的研究海洋放线菌KSC2-1次级代谢产物,以期得到有活性的先导化合物。方法利用硅胶柱色谱,凝胶柱色谱(Sephadex LH-20),制备高效液相色谱(PRE-HPLC)等手段进行分离纯化,通过理化性质和光谱数据对化合物进行了结构鉴定。结果从海洋放线菌KSC2-1的发酵液的正丁醇萃取物中分离得到10个化合物,分别鉴定为:3-(α-羟丙酰基)-1H-吲哚(3-(α-hydroxypropionyl)-1H-indole,1)、3-乙酰基-1H-吲哚(3-acetyl-1H-indole,2)、1H-吲哚-3-醛(1H-indole-3-carbaldehyde,3)、1H-吲哚-3-羧酸(1H-indole-3-carboxylic acid,4)、2-(1H-吲哚-3-基)乙醇(2-(1H-indol-3-y1)eth-anol,5)、3-乙基-3-羟基-1-甲基吲哚啉-2-酮(3-ethyl-3-hydroxy-1-methylindolin-2-one,6)、2-羟基-1-(4-羟苯基)乙酮(2-hydroxy-1-(4-hydroxyphenyl)ethanone,7)、4-羟基苯乙醇(4-(2-hydroxyethyl)phenol,8)、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷(thymine nucleoside deoxyribose,9)、尿嘧啶核糖核苷(uracil nu-cleoside,10)。结论化合物1-10均为首次从海洋放线菌KSC2-1次级代谢产物中分离得到。     

软珊瑚共附生真菌Schizophyllum sp. CGF9-1-2次生代谢产物研究

目的 首次对软珊瑚来源共附生裂褶菌属真菌Schizophyllum sp. CGF9-1-2次生代谢产物的化学成分进行研究,以期获得结构新颖、生理活性好的次生代谢产物。方法 以PDA及真4培养基发酵软珊瑚共附生真菌Schizophyllum CGF9-1-2;采用硅胶、凝胶、ODS等柱层析、高效液相色谱法（HPLC）等方法对其菌丝体的乙酸乙酯部位进行分离纯化;采用核磁共振（NMR）、（高分辨）质谱（（HR）MS）和旋光（ORD）等现代波谱解析手段,并与文献数据对照方法确定化合物结构。结果 从其乙酸乙酯部位共分离鉴定10个化合物,依次为7, 8-二甲基四氧嘧啶（1）、杂色曲霉素（2）、Arugosin C（3）、酒酵母甾醇（4）、（22e,24r）-3β, 5α, 9α-三乙烯基麦角甾-7, 22-二乙烯-6酮（5）、1-亚油酸甘油酯（6）、10-十七烯酸甲酯（7）,2-辛烷烯酸甲酯（8）、十八烷酸（9）和十四烷酸（10）。结论 首次从裂褶菌属真菌CGF9-1-2中分离鉴定10个化合物,结构类型涉及吡嗪类、芳香酚酸类和长链脂肪酸及酯类。丰富了宿主软珊瑚中海洋微生物的种类,确定其次生代谢产物的多样性,为进一步药理活性实验奠定了基础。     

植物内生菌HCCB00167产物的发酵、分离和结构鉴定

目的对植物内生菌HCCB00167发酵产物酯溶性部分的化合物进行分离和结构鉴定。方法采用乙酸乙酯萃取、硅胶柱色谱制备分离纯化;通过质谱和核磁共振等谱学数据进行化学结构鉴定。结果从HCCB00167菌株发酵液中分离并鉴定了3个化合物,分别为麦角甾醇(1)、过氧化麦角甾醇(2)和4-丁基-吡啶-2-羧酸(3)。结论其中4-丁基-吡啶-2-羧酸为首次从陆生真菌中得到。     

海星共附生真菌Penicillium sp．GGF16－1－2中次级代谢产物研究

目的 全球天然产物社会分子网络（GNPS）和单菌株多次级代谢产物（OSMAC）策略从海洋微生物中寻找结构新颖、活性好的次生代谢产物。方法 在GNPS指导下，通过硅胶柱层析及半制备高效液相色谱（HPLC）等方法对海星共附生真菌penicillium sp. GGF16-1-2在不同培养基的次级代谢产物进行分离纯化。通过核磁共振（NMR）、高分辨质谱（HRMS）、旋光（ORD）和圆二色光谱（CD）等现代波谱解析方法以及对比文献确定化合物的结构。结果 在GNPS追踪指导下从penicillium sp. GGF16-1-2中D培养基分离得到9个聚酮类化合物，依次为phenol A（1）、decarboxydihydrocitrinone（2）、stoloniferol B（3）、sclerotinin A（4）、(1S,3R,4S)-1-(4"-hydroxyl-phenyl)-3,4-dihydro-3,4,5-trimethyl-1H-2- benzopyran-6,8-diol（5）、β-diversonolic ester（6）、sydowinin A（7）、ω-hydroxy-emodin（8）和dibutyl phthalate（9）。而在真1培养基中GNPS预测到二聚体类成分存在，并在GNPS指导下初步分离得到桔霉素二聚类化合物：citrinin H1（10）和dicitrinone B（11）。结论 OSMAC策略和GNPS可以预测并获得骨架丰富、结构新颖的化合物。对海星共附生真菌penicillium sp. GGF16-1-2次生代谢产物研究发现真1培养基比D培养基更适合桔霉素二（多）聚体类化合物的产生。     

放线菌FIM06-0063产生的安莎类化合物的分离、纯化及其结构鉴定

目的分离、纯化、鉴定来自放线菌FIM06-0063发酵液中的安莎类化合物。方法采用大孔吸附柱层析、硅胶柱层析等方法对FIM06-0063菌株的次级代谢产物进行分离纯化,以紫外、质谱、核磁等方法对获得的组分进行结构鉴定。结果从FIM06-0063菌株发酵液中共分离到4个安莎类化合物,经波谱方法鉴定,分别为:9-甲氧基-安丝菌素P-3(9-methoxy-ansamitocinP-3,1),安丝菌素P-2(ansamitocin P-2,2),安丝菌素P-3(ansamitocin P-3,3)和安丝菌素P-4(ansamitocin P-4,4)。结论首次从微生物发酵液中分离得到化合物1,为一个新的天然产物。活性研究表明该化合物对HL60肿瘤细胞具有增殖抑制活性,其IC50值为72.68nmol/L。     

一株具有抗肿瘤活性的土壤放线菌的筛选与菌种鉴定

目的快速高效的筛选到有抗肿瘤活性的土壤放线菌。方法初筛采用MTT法检测样品作用后A549细胞、HGC-27细胞和正常对照细胞N9的成活率,PI染色流式细胞检测技术复筛可能致细胞凋亡的菌株,以及对活性菌株进行种属鉴定。结果与结论从350株土壤放线菌中初筛得到16株菌种,它们的代谢产物对A549及HGC-27细胞有抑制作用,但对N9细胞生长无影响;复筛得到1株编号为1070的菌株的代谢产物能使A549细胞经过处理后,经流式细胞仪检测到亚二倍体峰,峰高为32.07%。从菌株菌落形态、孢子丝形态、生理生化特性及16SrDNA序列、系统进化分析鉴定该菌种为Streptomyces capillispiralis。     

抗流感病毒H1N1海绵放线菌的筛选及菌株HA10201的鉴定

目的从海绵中分离筛选具有抗H1N1活性的放线菌,并对活性菌株HA10201进行鉴定。方法采用CPE和MTT方法对从海绵中分离的放线菌进行抗H1N1活性筛选,对活性较强的菌株HA10201进行形态学和生理生化特性研究,测定其16SrDNA序列并进行系统发育分析。结果菌株HA10201发酵液稀释20倍后对H1N1抑制率达68.1%,HA10201与Streptomyces roseorubens的形态和生理生化特征最为接近,且与其16SrDNA序列相似性为99.40%,且在发育树上聚为一个分支。结论菌株HA10201鉴定为S.rose-orubens,其发酵液具有较强的体外抗H1N1活性,值得进一步研究。     

卡伍尔链霉菌TJ430的分离鉴定及抗菌活性研究

目的 从土壤中分离、筛选稀有放线菌,对其产生的抗生素进行评价,以期发现新型农用抗生素.方法 采用高温烘烤法对土壤中稀有放线菌进行富集,采用改良的HV培养基进行分离.对分离获得的编号为TJ430的菌株采用形态学观察法、细胞化学组分分析法、生理生化及酶学特性分析、16S rDNA序列分析和DNA杂交法进行鉴定.菌株TJ430产生的抗生素水溶液在温室内进行生物防效试验.结果 共计分离获得570株稀有放线菌,其中TJ430表现出优良的广谱抗真菌活性.鉴定表明T J430是一株卡伍尔链霉菌.生物防效试验结果表明,TJ430产生的抗生素水溶液对番茄晚疫病、番茄细菌性斑点病、黄瓜菌核病及黄瓜炭疽病的防效分别为100％、79.36％,98.11％和75.79％.结论 菌株TJ430产生的抗生素具有宽泛的抗菌谱和良好的抗菌活性,具备较好的开发应用前景.     

湖泊放线菌SIIA-A16124的分类鉴定及基因组挖掘

目的 对湖泊放线菌SIIA-A16124进行分类鉴定和基因组挖掘。方法 采用多相分类法对菌株的形态学、生理生化、细胞壁化学组分、16S rRNA基因序列进行测定和分类鉴定,采用基因组挖掘分析生物合成基因簇,经发酵培养、抗菌活性检测及活性产物质谱分析,推测其活性产物的化合物结构类别。结果 菌株SIIA-A16124的16S rRNA基因与菌株Actinokineospora inagensis NRRL B-24050T同源性最高为99%;菌株SIIA-A16124在ISP3培养基上中等产孢和水解淀粉的特性与模式菌株存在明显差异;鉴定菌株SIIA-A16124为动孢菌Actinokineospora sp.,具有羊毛硫肽生物合成基因簇,其活性次级代谢产物属于羊毛硫肽类抗生素。结论 首次发现动孢菌属放线菌具有生物合成羊毛硫肽类抗生素的能力。     

南海稀有放线菌的分离及其卤化酶基因分析

目的 探究中国南海沉积物中放线菌的多样性并从中发现合成药物先导化合物的新菌源.方法 采用6种选择性培养基分离24份来自南海沉积物样品中含有的放线菌.挑选不同培养特征的放线菌进行初步分类鉴别、16S rRNA基因序列系统进化分析及基于PCR的卤化酶基因筛选.结果 共分离到900株放线菌,挑选的210株放线菌分别属于放线菌9个科,13个属,210株菌中有38株含有卤化酶的生物合成基因片段.结论 海洋环境蕴含丰富的放线菌资源并具有产生天然的有活性卤化物的潜能.     

抗甲型流感H1N1病毒红树林内生放线菌的筛选及菌株HA12210的鉴定

目的对红树林内生放线菌进行抗H1N1病毒活性检测,并对具有较高活性的菌株HA12210进行鉴定。方法采用嗜杀酵母系统和CPE+MTT联合法模型对菌株发酵液进行抗H1N1病毒活性的初筛和复筛;对菌株HA12210进行培养和形态特征、生理生化特征的鉴定,测定其16SrDNA序列并进行系统发育分析。结果菌株HA12210发酵液稀释20倍后对H1N1病毒的抑制率达到73.2%。HA12210与Micromonospora marina JSM1-1T形态和生理生化特征接近,并与其16SrDNA序列相似性最高(99.70%),且在发育树上聚为同一分支。结论鉴定活性菌株HA12210为Micromonospora marina,本文首次报道了该菌株的抗H1N1病毒活性。     

链霉菌NOV-0827产生的抗肿瘤活性成分的分离纯化和结构鉴定

目的 分离、纯化和鉴定链霉菌NOV-0827发酵液中的抗肿瘤活性成分.方法 采用大孔吸附柱层析、硅胶柱层析、凝胶柱层析等方法对该菌株的次级代谢产物进行分离纯化;根据理化性质和波谱学方法进行化学结构的鉴定;利用MTT法来检测化合物的抗肿瘤活性.结果 从该菌株发酵液中共分离到3个化合物,NOV-0827-A、NOV-0827-B和NOV-0827-C,经波谱方法鉴定分别与文献中报道的氨基香豆素类(aminocoumarin)抗生素新生霉素,大环内酰胺类抗生素GT-32A和GT-32B同质.活性研究表明NOV-0827-B和NOV-0827-C均对结肠癌细胞SW620具有较强的增殖抑制活性,其IC50值分别1.107μmol/mL和5.358μmol/mL.结论 首次从同一陆生链霉菌菌株的发酵液中分离得到新生霉素及其他两个具有抗肿瘤活性的大环内酰胺类物质.     

一株高产抗寄生虫环肽emodepside前体产生菌的鉴定及其次级代谢产物PF1022A的结构分析

目的 抗寄生虫环肽emodepside前体产生菌的鉴定及其次级代谢产物PF1022A结构分析。方法 本实验室通过紫外诱变得到一株高产抗寄生虫环肽emodepside前体的突变株，采用形态观察、生理生化特征鉴定、ITS基因序列对比及系统发育学分析等相结合方法来确定该菌株的分离学地位，以及对该菌株经深层发酵，经LC-MS、1H NMR和13C NMR、DEPT 90和DEPT 135、1H-1H COSY、HMQC、HMBC分析测定来确定产生次级代谢产物X的分子结构。结果与结论 鉴定突变株CBR72-MCB-01呈现出座坚壳属(Rosellinia)菌株的形态学特征；经鉴定代谢产物结构与文献报道的抗寄生虫环肽PF1022A结构一致。     

Structure identification and analysis of the suspected chemical precursor of 2-fluorodeschloroketamine and its decomposition products

In this work, 1-[(2″-fluorophenyl)(methylimino)methyl]cyclopentan-1-ol (2-fluorodeschlorohydroxylimine) was identified as a suspected chemical precursor of 2-fluorodeschloroketamine (2-FDCK) using gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS) and gas chromatography-quadrupole/time-of-flight mass spectrometry (GC-Q/TOF-MS) and comparing the data with those of ketamine and its chemical precursor, hydroxylimine. Furthermore, the entire fragmentation pathway of 2-fluorodeschlorohydroxylimine was theorized from the GC–MS spectrum recorded using an electron ionization (EI) source, and the mechanisms and decomposition pathways of 2-fluorodeschlorohydroxylimine were elucidated. In protic solvents, the nitrogen atom in the C═N group of 2-fluorodeschlorohydroxylimine underwent a protonation reaction. Thereafter, the traces of water present in protic solvents promoted the hydrolysis of the protonated imine, and a carbon cation was obtained following the loss of methylamine. The carbon cation could follow the classical decomposition mechanism of imines and yield an α-hydroxyl ketone, which was the major decomposition product, (2′-fluorophenyl)(1″-hydroxycyclopentyl)methanone. The cation could also undergo a loop expansion rearrangement and yield another α-hydroxyl ketone, 2-(2′-fluorophenyl)-2-hydroxycyclohexan-1-one. The structures of the two aforementioned decomposition products were elucidated using several techniques including theoretical calculation, GC–MS, nuclear magnetic resonance (NMR), the prediction and assistance elucidation functions of ACDLabs-Structure Elucidator Suite, and the virtual separation technology of diffusion-ordered spectroscopy. The aforementioned study revealed important information about the chemical precursor of 2-FDCK and its decomposition. Furthermore, a set of methods for the qualitative analysis of 2-fluorodeschlorohydroxylimine were established, which facilitated accurate analysis of 2-fluorodeschlorohydroxylimine samples following decomposition or destruction.     

白刺链霉菌(Streptomyces albospinus)CT205次生代谢产生活性物质的分离纯化及结构鉴定

目的 为了确定白刺链霉菌(S. albospinus)CT205次生代谢产生抗菌活性物质的结构。方法 S. albospinus CT205进行液体摇瓶发酵，对发酵上清液进行溶媒萃取、减压浓缩、薄板检测Rf值，采用制备型薄板分离获得单体化合物。紫外扫描检测吸收峰的波长范围，以HPLC-TOF-HR-MS检测物质分子量，并检测其核磁共振波谱(1H NMR、13C NMR)及红外光谱。结果 GF254薄板在氯仿:乙酸乙酯:甲醇:甲酸(16:1:2:0.04)的层析系统展层时，Rf 值为0.68的组分具有抗菌活性。紫外扫描显示在λ=215nm处有最大吸收峰，HPLC-TOF-HR-MS检测分析一级质谱、二级质谱表明活性物质分子量为282.2，该物质与放线酮分子量相同，1H NMR、13C NMR检测其骨架结构，红外光谱佐证活性物质各功能基团(羰基，羟基，氨基等)的存在。结论 确定活性物质成分为放线酮，又名环己酰亚胺(cycloheximide)。