小鼠胚胎成纤维细胞的分离与培养

目的 探讨影响小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）分离和培养的一些因素,以建立稳定的MEF培养体系。方法 取BALB／c小鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对MEF的生长形态,生长曲线及细胞周期进行观察,并对不同胚胎日龄以及不同胰酶作用时间对MEF分离及培养的影响进行研究。结果 13.5d胎龄鼠胚的MEF分离效果优于10.5d,18.5d胎龄鼠胚;MEF在体外为贴壁生长型细胞,第三代细胞增殖旺盛;在室温条件下,0.25%胰酶消化MEF时间以3－5min为宜。结论 MEF在第3代增殖旺盛,最适宜作胚胎干细胞的饲养层。     

小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备条件的研究

目的：建立小鼠胚胎成纤维细胞饲养层最佳分离培养及丝裂霉素C(MMC)处理的方法,用于培养胚胎干细胞。方法：取不同胎龄的胎鼠分离原代成纤维细胞,观察不同胎龄和培养、分离条件对细胞增殖的影响;观察不同浓度和不同作用时间下MMC对细胞增殖的抑制作用。用MTT法测定细胞增殖的数量。取妊娠3．5d的囊胚在经MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞集落生成情况。结果：制备小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的最佳胎龄是12．5～14．5d：室温条件下,0．25％胰蛋白酶消化时间最好在3～5min之内：原代细胞培养2～4d后即可传代,MMC能抑制胚胎成纤维细胞的增殖,最佳的作用浓度和时间是20μg/ml,2～4h,成纤维细胞饲养层可以维持10d。囊胚在饲养层上能发育成典型的“鸟巢”状干细胞集落。结论：从12．5～14．5d胎龄小鼠胚胎分离培养的胚胎成纤维细胞质量最佳,经20μg／ml MMC处理2～4h后,可以作为饲养层用于胚胎干细胞的分离克隆。     

γ射线对ICR小鼠胚胎成纤维细胞的抑制作用研究

目的建立安全有效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层体系,用于人胚胎干细胞的培养和研究。方法取ICR小鼠胚胎制备原代成纤维细胞,观察不同剂量的γ射线对成纤维细胞的抑制作用,用流式细胞仪分析MEF细胞周期的改变,用MTT测定细胞的数量。结果在30Gy剂量的γ射线条件下,能有效地抑制小鼠胚胎成纤维细胞的分裂,且不影响其活力。结论在合适剂量的Y射线照射下,能安全有效的抑制MEF的有丝分裂,为人胚胎干细胞的研究奠定基础。     

ICR小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层的制作

目的：建立ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系，用于胚胎干细胞建系及研究。方法：选取不同胎龄的鼠胚原代细胞分离成纤维细胞，制作饲养层，使用不同浓度丝裂霉素C处理，以细胞形态、生长曲线、囊胚种植情况为饲养层评价指标。结果：ICR小鼠胚胎成纤维细胞可在胎龄12．5～14．5d进行原代细胞分离；12．5d为最佳分离时间；13．5和14．5d分离的细胞需在3代以后使用；6代以前细胞可用于饲养层制作；20mg/L丝裂霉素C作用2．5h可达到较好的处理效果。结论：ICR小鼠可用来分离、培养胚胎成纤维细胞，用于胚胎干细胞饲养层的制作。     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备

目的：探讨小鼠胚胎干细胞饲养层细胞的制备。方法：小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞培养胚胎干细胞。另在无饲养层细胞培养液中,含白血病抑制因子条件下培养小鼠胚胎干细胞,观察两种情况下胚胎干细胞的生长情况。结果：小鼠胚胎成纤维细胞呈放射状或旋涡状走行,胚胎干细胞呈克隆状生长。结论：胚胎干细胞能良好生长,且保持未分化状态。     

HCMV体外感染小鼠胚胎成纤维细胞的研究

目的 观察人巨细胞病毒(HCMV)AD169株体外感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的生物学特征,为探讨HCMV AD169株能跨种属感染MEF提供依据.方法 将100 TCID50 HCMV AD169株病毒悬液接种至MEF和人胚胎成纤维细胞(HF)上,逐日观察HCMV特征性细胞病变效应(CPE);分别收集感染后1、3、5 d 的MEF和HF培养物,提取细胞DNA,采用实时荧光定量PCR检测HCMV立即早期基因(IE)拷贝数变化;分别采用HCMV立即早期基因(IE-1)、主要衣壳蛋白(MCP)和包膜糖蛋白(gB)单克隆抗体进行间接免疫荧光实验检测感染后的1、3、5 d MEF和HF中相应病毒蛋白的表达.结果 观察到HCMV AD169株接种MEF出现病毒所致CPE,与HF出现的CPE相似;实时荧光定量PCR检测HCMV IE基因拷贝数发现,MEF在HCMV AD169感染后的1、3、5 d,病毒基因拷贝数呈增长趋势,但均低于相同时间点的HF中病毒拷贝数;间接免疫荧光检测HCMV感染MEF和HF后1、3、5 d HCMV IE-1、MCP和gB蛋白表达情况时发现,在MEF上HCMV IE-1、MCP和gB蛋白表达随时间延长呈增强趋势.结论 HCMV AD169株可以体外感染MEF,并在其中复制增殖.     

人成纤维细胞对人胚胎干细胞生长的支持作用

目的观察人成纤维细胞对人胚胎干细胞（hESC）生长的支持作用，建立完全非动物源性培养系统。方法采用人包皮成纤维细胞为饲养层，以血清替代品取代动物血清，支持人胚胎干细胞生长，观察其增殖和分化情况。结果包皮成纤维细胞能很好地支持人胚胎干细胞生长增殖，并保持87％左右未分化表型：碱性磷酸酶（AKP）染色强阳性，阶段特异性胚胎抗原3（SSEA-3），肿瘤排斥抗原160（TRA-1-60）表达强阳性，可见转录因子OCT-4mRNA表达。核型正常，体外能形成拟胚体。结论人成纤维细胞完全可以支持人胚胎干细胞增殖，可望为胚胎干细胞定向诱导分化应用于临床打下基础。     

用饲养层分离胚胎干细胞集落的实验初探

目的 用饲养层分离胚胎干细胞集落。方法 用胚龄为13~14 d的小鼠胚胎分离原代成纤维细胞,制成饲养层,用于囊胚的培养。结果 小鼠原代胚胎成纤维细胞（PMEF）贴壁能力较好,增殖快,易铺层。囊胚和内细胞团（ICM）在饲养层上贴壁生长良好,当培养4~5 d时,其增殖率为16/28（57%）。在ICM离散48 h后,各种胚胎干细胞（ES）集落开始出现。此种集落经碱性磷酸酶染色成阳性。结论 用饲养层分离胚胎干细胞获得初步成功。     

小鼠胎儿成纤维细胞及胚胎干细胞转绿色荧光蛋白基因的研究

目的检测用增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）转染的小鼠胎儿成纤维细胞及小鼠胚胎干细胞的转染效率及EGFP的表达情况。方法电穿孔法将EGFP转入胎儿成纤维细胞及胚胎干细胞，G418筛选，荧光显微镜观察转染效率及绿色荧光蛋白表达情况。结果胚胎干细胞的转染率高于成纤维细胞，转染后的两种细胞经药物筛选均有绿色荧光蛋白表达。结论电穿孔转染细胞的方法简单、效率高，是一种较为理想的基因转染方法，经药物筛选后的两种细胞均可用于核移植，为转基因克隆动物的研究奠定了基础。     

小鼠胚胎干细胞饲养层制备条件的研究

目的:建立稳定高效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于分离克隆胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞).方法:取妊娠13.5～14.5d的胎鼠,采用组织消化法结合组织块培养法分离、培养小鼠成纤维细胞;MTT法测定细胞生长曲线,结合倒置显微镜观察筛选小鼠成纤维细胞饲养层的最佳种植密度;MTT法筛选丝裂霉素c作用的最佳浓度和时间.取妊娠3.5d的小鼠囊胚在经丝裂霉素C处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞生长情况.结果:组织消化法结合组织块培养法是分离培养小鼠成纤维细胞的较好的方法;1 × 105～2×105个/ml种植密度适于饲养层铺板;丝裂霉素c 10μg/ml作用3.5h或20μg/ml作用2.5h能抑制成纤维细胞增殖,细胞至少在7d内维持稳定的水平;妊娠3.5d小鼠囊胚在饲养层上培养能形成Es集落.结论:制备的胎鼠成纤维细胞饲养层能有效地支持小鼠胚胎干细胞的生长.     

ICR胎鼠成纤维细胞培养方法的优化

目的确定胎鼠成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)最优制备方法,为MEF的制备节省时间与原材料。方法取胎鼠组织,采用组织块培养法、胰酶消化培养法、胰酶消后组织块培养法进行分离培养MEF,比较观察MEF纯度、生长速度、细胞形态等指标,筛选最节省时间与原料的一种培养方法。结果组织块培养法所得MEF生长速度慢,细胞体积小,杂细胞少,纯化所需传代次数少。胰酶消化培养法的MEF生长速度快,体积较大,杂细胞数量多,纯化所需传代次数较多。胰酶消化后组织块培养法的消化后组织块的成纤维细胞生长速度介于前两种方法之间,细胞体积和形态与组织块法培养结果相似,杂细胞数量较少,纯化所需传代次数少。结论胰酶消化结合组织块培养法能最大限度的利用材料,在短时间内可制备大量MEF,满足核移植试验与作为饲养层细胞的需求。因此,胰酶消化结合组织块培养法是MEF最优培养方法。     

IRM-2小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养和生物学特性

目的分离原代培养IRM-2小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）,从本质上揭示IRM-2小鼠的辐射抗性。方法分离IRM-2小鼠MEFs,并进行原代培养和传代培养。观察MEFs生长形态,测定第3代和第5代细胞生长曲线、细胞周期和增殖指数。结果IRM-2小鼠在胎龄14～16d进行原代MEFs分离,MEFs在体外为贴壁生长型细胞,6代前MEFs生长良好。第3代和第5代MEFs在培养至第3天开始进入对数生长期,到第6天时细胞数达到高峰。MEFs增殖活跃,第3代和第5代细胞增殖指数分别为53%和46%。结论成功分离、培养了IRM-2小鼠MEFs,为进一步利用MEFs研究小鼠的辐射抗性机制奠定了基础。     

低氧对人胚肺成纤维细胞表型与增生的影响

采用单层细胞超薄切片技术和免疫细胞化学方法, 观察常氧（Ｎ）、低氧（Ｈ）、常氧和低氧猪肺动脉内皮细胞条件培养液（ＮＥＣＣＭ 和ＨＥＣＣＭ） 等不同条件, 对肺血管外膜成纤维细胞的表型与增殖的影响。结果表明： （１） 仅ＨＥＣＣＭ 组成纤维细胞显示表型转变,胞浆内出现微肌丝、致密体、基膜等平滑肌细胞超微结构,粗面内质网明显减少;且此组细胞α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ） 表达较其余３ 组明显增高（Ｐ＜ ０． ０１）; （２） Ｈ 和ＨＥＣＣＭ 组增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ） 表达较Ｎ 和ＮＥＣＣＭ 组明显升高（Ｐ＜ ０． ０１）。结果提示： （１） 低氧可经肺动脉内皮细胞介导, 引起人胚肺成纤维细胞向平滑肌样细胞转化,而单纯低氧无此作用;（２） 低氧可直接或经内皮细胞介导,刺激人胚肺成纤维细胞增殖。     

骨髓成纤维细胞无血清培养体系的建立及R蛋白对其生长的影响

R蛋白是一种存在于巨噬细胞膜上的受体蛋白，在调节吞噬作用过程中起着重要作用。除巨噬细胞外，骨髓基质细胞也可分泌R蛋白。本文建立了小鼠骨髓成纤维细胞无血清培养体系，并调查了无血清培养条件下R蛋白对小鼠成纤维祖细胞生长的影响。结果发现：多聚赖氨酸能增强成纤维细胞贴壁能力；成纤维细胞生长在无血清培养体系及含血清培养体系中无显著差异（P＞0．05）；R蛋白对成纤维细胞生长有一定的促进作用（P＜0．05）。     

积雪草甙、羟基积雪草甙对体外培养人胚胎成纤维细胞的影响

目的研究积雪草甙（asiaticoside,Ad）和羟基积雪草甙（madecassoside,Md）对体外培养人胚胎成纤维细胞（Human embryonic skin fibroblasts,HESFb）增殖过程的影响。方法在不同浓度（0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml）Ad和Md的环境下对人胚胎细胞进行体外培养,用CCK-8试剂盒通过酶标仪检测不同培养时间（0、1、2、3、4、5d）HESFb的OD值,用SPSS13.0统计软件进行统计分析。结果在实验时间内Ad和Md在10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml浓度时均对人胚胎成纤维细胞的增殖有促进作用,200μg/ml浓度时最明显,且Ad比Md作用强。两组在400μg/ml浓度时均有抑制作用。结论在一定浓度和培养时间内一定剂量的Ad和Md对体外培养的HESFb增殖有促进作用,同剂量相比Ad比Md明显。而较高剂量的时候均可出现抑制作用。     

硫酸软骨素A对NIH－3T3鼠成纤维细胞及人皮肤成纤维细胞增殖的影响

用ＭＴＴ法检测了硫酸软骨素Ａ（４－硫酸软骨素，ＣＳ－Ａ）对ＮＩＨ－３Ｔ３鼠成纤维细胞和人皮肤成纤维细胞存活与增殖的影响。发现所侧ＯＤ值随ＣＳ－Ａ浓度的增高而增大，两者呈正相关（３Ｔ３鼠成纤维细胞：ｒ＝０．８１５４，Ｐ＜０．０５；人皮肤成纤维细胞：ｒ＝０．９１５，Ｐ＜０．０１），表明ＣＳ－Ａ对这两类成纤维细胞的存活和增殖有促进作用。采用ＰＡＰ和ＡＢＣ免疫细胞化学染色，观察到两类细胞的胞膜上有ＣＳ分布，提示ＣＳ可能参与膜结构的组成，对细胞－细胞与细胞－基质之间的相互作用有重要意义；为进一步探讨硫酸软骨素在肝纤维化中的作用提供了可靠的实验依据。     

川芎含药血清对小鼠胚胎干细胞增殖和分化的影响

【目的】观察川芎含药血清对小鼠胚胎干细胞(ES细胞)增殖及分化的影响。【方法】川芎含药血清与ES细胞共培养,采用CCK-8法检测细胞活性,逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌细胞特异基因肌球蛋白重链(β-MHC)m RNA的表达水平。【结果】与大鼠血清组和胎牛血清组比较,川芎含药血清组的ES细胞活性差异无统计学意义(P0.05),川芎含药血清组心肌细胞特异基因β-MHC表达水平显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。【结论】川芎含药血清对ES细胞向心肌细胞分化有促进作用。     

小鼠胚胎干细胞植入大鼠脑内存活和增殖

【目的】观察小鼠胚胎干细胞 (ES细胞 )植入大鼠的隔区和海马内后存活和增殖的情况。【方法】以SD大鼠为宿主 ,将BrdU标记的ES细胞植入宿主的隔区和海马内 ,移植后l、2、3、4和 8周后取脑 ,冰冻切片 ,进行尼氏、BrdU、PCNA免疫组织化学染色 ,观察ES细胞存活和增殖的情况。【结果】ES细胞移植入大鼠隔区和海马内后 ,从第l周到第 3周 ,移植物呈团块生长 ,第 4周移植物较第 3周缩小 ,第 8周未发现移植物 ;BrdU和PCNA(核增殖抗原 )免疫染色结果阳性。【结论】小鼠ES细胞移植入大鼠隔区和海马内后 ,可以存活增殖 4周左右     

ALA-PDT对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖抑制作用的研究

目的 探讨5-氨基酮戊酸光动力疗法(ALA-PDT)在体外对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响,并确定合适的光敏剂浓度和激光能量密度密度.方法 体外培养人体瘢痕疙瘩成纤维细胞.实验分为空白对照组、激光组(仅予不同能量密度He-Ne激光照射)、光敏剂组(仅予不同浓度光敏剂ALA同时培养)和ALA-PDT组(先后予ALA培养和He-Ne激光照射).采用MTT法计算各组细胞增殖抑制率.结果 激光组和光敏剂组对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖无明显抑制作用.ALA-PDT组中,当He-Ne激光剂量(>10 J/cm~2)与ALA浓度(>0.125 mmol/L)达到一定程度时,抑制作用明显,随激光能量密度和药物浓度的同时增大,抑制作用逐渐增大.结论 ALA-PDT对体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖有明显抑制作用,其抑制作用随药物浓度和激光能量密度增加而增加,最佳的参数:ALA浓度为0.25 mmol/L,He-Ne激光能量密度为40 J/cm~2.     

鼠角膜缘干细胞3D共培养模型的建立及生存率、表型维持

目的 探讨纤维蛋白凝胶、鼠胚胎成纤维细胞与鼠角膜缘干细胞的3D共培养模型是否有助于角膜缘干细胞的生存率提高和细胞表型的维持.方法 细胞采用96孔圆底培养板培养,并分为3组:①鼠角膜缘干细胞单独培养组(A组),含3×104个角膜缘干细胞;(2)鼠角膜缘干细胞与纤维蛋白共培养组(B组),将纤维蛋白原配成10 mg/mL的磷酸盐溶液,与鼠角膜缘干细胞混合成3×105/mL的混合悬液,取100 μL 细胞悬液培养;③鼠角膜缘干细胞、纤维蛋白和鼠胚胎成纤维细胞共培养组(C组),将鼠角膜缘干细胞与鼠胚胎成纤维细胞以1:0.5混合,配成含有10 mg/mL纤维蛋白原的4.5×105/mL混合悬液,取100 μL 进行培养.于培养后4、24和48 h,以Annexin Ⅴ染色,采用流式细胞仪检测其细胞生存率和凋亡率.以Western blot检测角膜缘干细胞分化蛋白Keratin K3/K76的表达.结果 角膜缘干细胞在4、24 和48 h的生存率最高者为C组,分别是(95.7±2.0)%、(95.1±1.2)% 和(92.0±1.7)%;其次为B组,分别是(95.2±3.0)%、(89.8±1.5)% 和(80.0±0.8)%;最低为A组,分别是(95.0±1.2)%,(84.5±1.2)% 和(70.0±0.9)%.细胞凋亡率的趋势与此相反.角膜干细胞分化蛋白的表达强度,在4 h时各组之间的表达强度无统计学差异,但在48 h时,C组的表达强度(70±4)明显低于B组(97±6)和A组(102±4).结论 鼠角膜缘干细胞与纤维蛋白和鼠胚胎成纤维细胞的共同培养模式有助于提高角膜缘干细胞在3D培养中的存活率,可减少鼠角膜缘干细胞的分化和有益于其表型的维持.