弓形虫致密颗粒蛋白GRA2真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA2的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA2引物，运用PCR方法扩增其基因片段，经克隆至pMDl8-T载体后，亚克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（-）而构建重组表达质粒pcDNA3．1-GRA2。脂质体法将构建的重组质粒转染HFF细胞，RT—PCR法检测转染细胞中GRA2的表达情况。结果PCR扩增GRA2基因序列正确，构建的重组表达质粒pcDNA3．1-GRA2经PCR、EcoRⅠ／HindⅢ双酶切和测序鉴定正确；转染GRA2基因的细胞，RT—PCR可见目的条带。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3．1-GRA2，为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

结核分支杆菌ESAT-6真核表达质粒的构建及蛋白表达的鉴定

目的 用6kDa早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)基因构建真核表达重组质粒pcDNA3．1( )-ESAT-6，并鉴定其在真核细胞(COS-7)中的蛋白表达。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用PCR对ESAT-6基因进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pUCm—T上，经测序反应确定无误后，再将PCR反应产物克隆于真核表达载体pcDNA3．1( )上。并用脂质体介导真核表达重组质粒pcDNA3．1( )-ESAT-6转染真核细胞COS-7，72h后，通过SDS—PAGE和免疫印迹鉴定ESAT-6基因表达的蛋白。结果 用结核杆菌基因ESAT-6构建重组真核表达质粒pcDNA3．1( )-ESAT-成功，通过SDS—PAGE证明重组质粒转化的细胞内有一分子量6kDa的特异蛋白，免疫印迹证明该6kDa蛋白能与抗ESAT-6单克隆抗体反应。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6真核表达重组质粒成功构建，该质粒转染的细胞能够产生、分泌结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6。     

抗人VEGF发卡状核酶基因的构建及其对肝癌细胞VEGF蛋白表达的影响

利用计算机辅助设计合成针对人VEGF的发卡状核酶（RZ），定向亚克隆于真核表达载体pcDNA3．1^＋中，转染肝癌细胞SMMC-7721，RT—PCR鉴定。ELISA法和MTT法检测SMMC-7721细胞对照组、SMMC-7721／pcDNA3．1^＋空载体对照组和SMMC-7721／RZ基因转染组细胞VEGF表达和增殖情况，流式细胞术检测各组细胞周期和凋亡情况。结果为SMMC-7721／RZ基因转染组细胞VEGF表达水平和细胞增殖速率显著低于SMMC-7721细胞对照组和SMMC-7721／pcDNA3．1’空载体对照组。MC-7721／RZ基因转染组细胞出现凋亡峰，其凋亡率达11．O％，而细胞对照和空载体细胞对照均末出现。认为SMMC-7721／RZ转基因细胞株的成功构建和生物学特性的初步研究为进-步建立裸鼠人肝癌模型及评价RZ对体内肝癌生长的抑制作用奠定了-定的基础。     

重组转化生长因子β3基因对大鼠肝星状细胞Ⅰ型胶原表达的影响

目的观察转化生长因子D3基因（TGFβ3）对大鼠肝星状细胞株（HSC—T6）Ⅰ型胶原合成的影响。方法TGFβ3表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFβ31和TGFβ1表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFD11的构建。通过脂质体介导方法，将pcDNA3．1（＋）-TGFβ1、pcDNA3．1（＋）-TGFβ3分别及共同转染体外培养的HSC—T6细胞，荧光定量PCR法及Westernblot法分别检测转染后TGFβ1、TGFD3、Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达。将pcDNA3．1（＋）-TGFD1转染HSC—T6细胞，经G418筛选建立高表达TGFD1的HSC～T6细胞克隆，pcDNA3．1（＋）-TGFD3转染克隆细胞，荧光定量PCR法检测转染后TGFβ3、TGFβ1及Ⅰ型胶原mRNA的表达，Westernblot法检测TGFβ1、Ⅰ型胶原蛋白的表达情况。结果构建的pcDNA3．1（＋）TGFD3、pcDNA3．1（＋）-TGFD1质粒可转染HSC—T6细胞，转染率28．2％。pcDNA3．1（＋）TGF侈3转染细胞后，Ⅰ型胶原mRNA及蛋白的表达较空白组及对照组增加，以72h增高最为明显（P〈0．05）；共转染组Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达较pcDNA3．1（＋）-TGFβ1转染组明显降低（P〈0．05）。TGF侈3转染克隆细胞后，TGFD1mRNA表达较克隆组无明显改变（P〉0．05），而蛋白质表达明显下降（P〈0．05），Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质表达均较克隆组明显降低（P〈0．05）。结论TGFD3基因转染正常培养的HSC—T6细胞，增加Ⅰ型胶原的表达；转染高表达TGFβ1的克隆组HSC—T6细胞，Ⅰ型胶原表达明显降低，提示TGFβ3对肝纤维化的发生有抑制作用。     

WWOX基因转染抑瘤效应的实验研究

目的建立肿瘤抑制基因WWOX真核表达载体，观察其瞬时转染对肿瘤细胞凋亡的影响。方法采用RT-PCR方法，从正常人胚肾细胞HEK-293中钓取WWOX基因，将其克隆至pMD18-T载体上，测序正确后克隆到真核表达载体pcDNA4／myc-His中；采用脂质体介导法体外瞬时转染人肺腺癌A549细胞；RT—PCR法和Western印迹法分别检测WWOX基因mRNA和蛋白表达水平；流式细胞术检测细胞凋亡率；克隆形成试验观察肿瘤细胞克隆形成能力的变化。结果成功构建了WWOX的真核表达载体，体外转染的A549细胞凋亡率明显高于未转染和空载体转染细胞，且细胞克隆形成能力下降，形成率为35．43％，明显低于未转染细胞和空载体转染细胞。结论所构建的pcDNA4／myc-WWOX真核表达载体转染肿瘤细胞能够抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡。     

高表达重组人组织激肽释放酶7基因的前列腺癌单克隆细胞株的构建

目的：建立稳定高表达重组人组织激肽释放酶7基因（ KLK7）的前列腺癌细胞株DU145,为前列腺癌发生机制的研究奠定基础。方法 PCR法扩增KLK7 cDNA,并克隆到真核表达载体pcDNA3．1上;经过限制性内切酶酶切、DNA测序验证正确后,以脂质体法转染人前列腺癌DU145细胞;通过G418筛选,每个单克隆细胞扩大培养,建立稳定转染KLK7的DU145单克隆细胞株。采用Western blot 法检测DU145细胞株KLK7表达。结果酶切鉴定及DNA 测序分析显示 pcDNA3．1-KLK7真核表达载体成功构建;转染后,成功获得稳定高表达KLK7的DU145单克隆细胞株。 Western blot 结果显示,pcDNA3．1-KLK7转染的DU145细胞KLK7表达量明显高于转染空载体组细胞（P＜0．01）。结论 pcDNA3．1-KLK7真核表达载体的建立及稳定高表达KLK7的前列腺癌单克隆细胞株的建立,为研究KLK7在前列腺癌发生发展中的作用提供了条件。     

hSp17真核表达载体构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的构建人精子蛋白17（hSp17）基因的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/hSp17,为其临床应用奠定基础。方法用PCR方法获取hSp17基因片段,NheⅠ、KpnⅠ双酶切、粘端连接的方法构建含有hSp17基因的pcD-NA3.1（＋）/hSp17真核表达载体。将该载体行脂质体介导转染卵巢癌细胞HO8910,免疫细胞化学方法检测转染细胞hSp17蛋白表达,G418筛选稳定表达hSp17蛋白的细胞株。结果酶切和测序结果均证实pcDNA3.1（＋）/hSp17重组质粒的构建完全正确。免疫细胞化学方法证实外源性hSp17基因能够在卵巢癌HO8910细胞瞬时表达。经G418连续筛选,得到阳性克隆细胞株,并证实了外源性hSp17基因在卵巢癌HO8910细胞中稳定表达。结论成功构建了稳定表达外源性hSp17蛋白的卵巢癌细胞株;其可为卵巢癌的免疫治疗奠定基础。     

结核分枝杆菌新抗原Mtb8.4基因的克隆与真核表达

目的克隆结核杆菌新抗原Mtb8．4基因，导入真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建成重组质粒pcDNA3．1（＋）-Mtb8．4，并在真核细胞中进行表达。方法提取人结核杆菌H37Rv株的基因组作为模板，进行PCR扩增，获得Mtb8．4目的基因后，与pcDNA3．1（＋）载体进行连接重组，用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定；重组质粒转染COS-7细胞48k后，用RT-PCR方法鉴定Mth8.4在转录水平的表达情况。结果pcDNA3．1（＋）．Mth8．4真核表达载体构建成功；转染COS-7细胞后，Mtb8．4在转录水平成功表达。结论pcDNA3．1（＋）-Mtb8．4真核表达质粒的构建成功以及Mtb8．4在COS-7细胞中的成功表达，为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备结核病pcDNA3．1（＋）-Mtb8．4DNA疫苗奠定了基础。     

pcDNA3．1（＋）-SAA真核表达载体构建、转染及其对人鼻咽癌细胞CNE-2增殖的影响

目的构建peDNA3．1（＋）-血清淀粉样蛋白A（SAA）真核表达载体,观察其在人鼻咽癌细胞CNE-2中的表达及对CNE-2增殖的影响。方法以CNE-2细胞的eDNA为模板,通过PCR扩增得到SAA片段,经酶切、纯化后与peDNA3．1（＋）连接;重组质粒经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染法转染人鼻咽癌细胞CNE-2,用Westernblot法检测转染前后该细胞中SAA蛋白的表达,并用MTr法检测转染重组质粒后的细胞增殖情况。结果peDNA3．1（＋）-SAA经酶切、测序鉴定完全正确,真核表达载体构建成功;转染peDNA3．1（＋）-SAA真核表达载体后CNE-2细胞中SAA蛋白表达水平明显高增高;转染pcDNA3．1（十）-SAA后CNE-2细胞增殖速度加快。结论成功构建peDNA3．1（＋）-SAA真核表达载体,其能稳定表达于人鼻咽癌细胞CNE-2并促进细胞增殖;此为进一步研究SAA的生物学功能及鼻咽癌的新型治疗方法奠定了基础。     

钩端螺旋体lipL21基因真核表达质粒的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的构建钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL21基因片段的真核表达重组质粒．利用脂质体体外转染HeLa细胞，探讨其在体外真核细胞中的表达情况，为寻找新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子提供实验依据。方法应用PCR技术从钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增lipL21基因，纯化回收后克隆入pUCM-T载体，再亚克隆入真核表达载体poD-NA3．1（＋），运用脂质体2000将重组体pcDNA3．1（＋）-lipL21转染入HeLa细胞，细胞免疫组化法观察目的基因的表达。结果双酶切及测序鉴定证明成功构建了lipL21真核表达重组体pcDNA3．1（＋）-lipL21，DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。重组质粒pcDNA3．1（＋）-lipL21体外在HeLa细胞中能有效表达目的蛋白LipL21。结论成功构建了钩端螺旋体lipL21基因真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-lipL21，且能够在体外真核细胞中表达；为进一步筛选新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子奠定了一定的实验基础。     

核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及其在A549中的表达

目的 建立人核心蛋白聚糖(decorin,DCN) 真核表达载体,并在A549细胞中进行表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 用PCR法扩增出DCN分子编码序列的cDNA全长,与pcDNA3.1(+)载体连接,构建真核表达载体pcDNA3.1-decorin,并转化到大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体;脂质体介导重组载体转染A549细胞,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和Western印迹法检测其表达.结果 获得了约1 080 bp大小的特异性DNA片段;PCR产物与真核表达载体进行连接,经过双酶切、PCR以及测序鉴定证实分泌型DCN cDNA片段正确插入真核表达载体pcDNA3.1中.RT-PCR方法可见转染组mRNA表达明显增多,免疫组化和Western印迹方法可见转染组细胞DCN蛋白表达明显增高.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-decorin,建立了稳定转染DCN的A549细胞株.     

GFP基因真核表达质粒的构建及其在人胚肾293细胞中的表达

目的 克隆绿色荧光蛋白（GFP）基因并构建真核表达载体，观察其在人胚肾293（下称293细胞）细胞中的表达和分布，为制备自行设计的以λ噬菌体为载体的人类免疫缺陷病毒（HIV）核酸疫苗的阳性对照奠定基础。方法 以克隆好的pUC18／GFP为模板，根据Genbank中GFP的核苷酸序列设计引物，并在引物的5′端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点，特异性扩增GFP基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒，再经双酶切、连接构建含GFP编码基因的真核表达载体，酶切鉴定分析后，将该重组质粒通过脂质体介导，转染293细胞。荧光显微镜观察GFP在细胞内的表达和分布。结果重组质粒经Barn HⅠ、XhoⅠ双酶切成5．4kb与0．7kb的片断，表明表达载体pcDNA3．1（＋）中插入了GFP基因片断，测序结果表明编码框正确，并在293细胞中获得了表达，分布均匀。结论 pcDNA3．1（＋）／GFP真核表达载体已成功构建，并可在293细胞中表达。     

弓形虫SAG1-MIC3融合基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建编码弓形虫RH株膜表面蛋白1（SAG1）和微线体蛋白3（MIC3）的重组真核表达载体pcDNA3．1-SAG1-MIC3并鉴定，为弓形虫疫苗研制作准备。方法采用PCR技术从弓形虫基因组DNA中分别扩增SAGl和MIC3基因片段。分别克隆人pMD18T载体，并对重组人外源基因的质粒通过PCR、酶切和测序鉴定；采用亚克隆技术将SAG1和MIC3基因克隆至真核表达载体pcDNA3．1（-），经含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性重组质粒pcDNA3．1-SAG1-MIC3，PCR、酶切和测序鉴定；采用脂质体法将重组载体转染Hela细胞，经RT—PCR法检测转染细胞转录情况。结果MIC3和SAG1基因的TA-cloning经PCR和酶切鉴定，大小分别为933bp和789bp，与预期值一致；pcNDA3．1-SAG1-MIC3经酶切鉴定，目的片段约为1722bp．与SAG1MIC3长度相当；测定重组载体的核苷酸序列。与GenBank中的相应序列100％同源；PCR验证载体携带的SAG1-MIC3融合基因在Hela细胞中转录生成mRNA。结论成功构建重组真核表达载体pcDNA3．1SAG1-MIC3．为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。     

丙型肝炎病毒CTL表位基因真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的构建含丙型肝炎病毒（HCV）复合多表位基因的真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染细胞系。方法通过生物信息学预测分析的方法得到涵盖HCV不同基因型与小鼠H2复合体的多个细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位,串联后人工合成基因序列,将其克隆入真核表达载体pEGFP-N3中,然后利用脂质体法转染CHO细胞,通过持续G418筛选建立稳定转染细胞株。最后通过荧光显微镜观察、RT-PCR和Western Blot等方法证实多表位基因的表达。结果所构建的含有HCV复合多表位基因的真核表达载体pEGFP-mEpi在CHO细胞中能稳定表达。结论真核表达载体的成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究复合多表位疫苗的基因免疫奠定了基础。     

刚地弓形虫RH株ROP11基因的克隆与真核表达载体的构建

目的构建刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）棒状体蛋白11（ROP11）的真核表达重组质粒行在真饮细胞中表达目的蛋白。方法设计合成弓形虫ROP11基因引物,运用RTPCR方法扩增ROP11基因并克隆至真干发表达质粕pcDNA3．1（＋）,构建重组表达质粒pcDNA3．1-ROP11。将重组质粒转染HeLa细胞,采用间接免疫荧光法检测目的蛋白表达。结果RT—PCR扩增弓形虫ROP11基因片段为1548bp,与预期大小相符。构建的重组质粒pcDNA3．1-ROP11经PCR及EcoRI和NotI双酶切鉴定正确。重组质粒测序后与GenBank报道的ROP11基因比对,核什酸序列同源性和推导氨基酸序列同源性均为99％。免疫荧光检测显示,在重组质粒转染的HeLa细胞胞浆观察到黄绿色荧光,对照组无荧光。结论成功构建了真核表达质粒pcDNA3．1-ROP11,该重组质粒能够在真核细胞中表达日的蛋白,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。     

淋病奈瑟球菌表面蛋白A基因疫苗的构建及其诱导小鼠的免疫应答

目的构建淋病奈瑟球菌表面蛋白A（NspA）基因疫苗，并接种小鼠，评价其诱导的体液和细胞免疫应答。方法将NspA基因插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／NspA，并经PCR、双酶切及测序鉴定。反转录一聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫组织化学法分别检测NspA基因转染细胞后mRNA和蛋白的表达。以pcDNA3．1（＋）／NspA重组质粒免疫45只雄性BALB／c小鼠，试管凝集法检测免疫小鼠抗体滴度，ELISA检测IFN-γ水平，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测脾淋巴细胞增殖。提取接种部位股四头肌总DNA，PCR检测BALB／c小鼠肌细胞内NspA基因。结果成功构建pcDNA3．1（＋）／NspA基因疫苗，能在真核细胞中转录和表达。pcDNA3．1（＋）／NspA免疫组的抗体滴度达1：640，pcDNA3．1（＋）和PBS免疫组均无特异性抗体检出。空载体pcDNA3．1（＋）组IFN-γ为（23．79±11．85）pg／mL，pcDNA3．1（＋）／NspA免疫组为（169．71±30．52）pg／mL（P〈0．01）；脾淋巴细胞增殖的刺激指数（SI）分别为1．05±0．30和1．94±0．74（P〈0．01）。并证实NspA基因可在小鼠肌细胞中稳定存在。结论构建淋病奈瑟球菌NspA基因疫苗，将其免疫BALB／c小鼠可诱导特异性体液和细胞免疫应答，为进一步用于淋病预防奠定了基础。     

胃癌相关基因GCRG213正反义真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建胃癌相关基因GCRG213正、反义真核表达载体．方法:从pGEM-T质粒上扩增出的胃癌相关基因GCRG213的DNA片段,两端分别引入限制性内切酶KpnI,BamHI和EcoRI, BamHI识别位点．按正向、反向克隆入真核表达载体pcDNA3．1( )．测序正确的重组子pcDNA3．1-a(含GCRG213正向克隆), pcDNA3．1-b(含GCRG213反向克隆)和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞, G418筛选获得稳定转染的细胞株,采用半定量RT-PCR及Wlestern blot比较转染不同质粒的 MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异．结果:经测序证实,GCRG213正向克隆和反向克隆正确插入真核表达载体 pcDNA3．1( ),组成重组子pcDNA3．1-a(含正向克隆),pcDNA3．1-b(含反向克隆)．重组子 pcDNA3．1-a,pcDNA3．1-b和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株．与对应的空载体比较,RT-PCR结果显示转染pcDNA3．1-a的 MKN45细胞中其mRNA的表达上调35．4％,而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中其mRNA 的表达下调32．1％;Western blot结果显示转染 pcDNA3．1-a的MKN45细胞中其蛋白的表达上调49．4％,而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中其蛋白的表达下调50．3％．结论:成功构建胃癌相关基因GCRG213正、反义真核表达载体．     

甲型流感病毒M2蛋白胞外功能区真核表达质粒的构建和表达分析

目的 构建流感病毒M2蛋白胞外功能区（M2e）真核表达质粒，并研究其在真核细胞中的表达。方法 根据Genbank（NCBI ISDN13425）中查得的M2e编码序列，设计并合成两条DNA单链;在两条链两端添加碱基构成酶切位点的粘性末端，退火后使之互补结合成为M2e编码序列；然后将其插入到经双酶切的真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-M2ef经酶切和DNA测序鉴定后，转染HEK293细胞。用免疫荧光技术检测pcD—NA3．1（＋）-M2e在HEK293细胞的表达。并通过MTT检测刺激淋巴细胞增殖及M2e蛋白的分泌情况。结果 合成的寡核苷酸链经退火形成双链，插入酶切的真核表达载体后构建成pcDNA3．1（＋）-M2e。免疫荧光技术证实该质粒表达的M2e蛋白定位于细胞膜上，转染细胞的培养上清经MTT实验证实能刺激淋巴细胞增殖，表明表达的M2e蛋白也可分泌至细胞外。结论成功构建了流感病毒M2e的真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-M2e，表达的M2e蛋白不仅存在于绳胞膜上，也可分泌到细胞外。流感病毒M2e基因真核表达质粒的构建及成功表达为流感病毒基因工程疫苗、通用疫苗和核酸疫苗的研究奠定了基础。     

GPI—PLD过表达对甲状腺癌细胞株SW579生物学特征的影响

目的研究GPI—PLD基因转染并过度表达对SW579细胞的影响。方法用脂质体转染法将GPI—PLD真核表达载体pcDNA3．1（＋）／GPI—PLD转入SW579细胞,以未转染的SW579细胞及转染空载体pcDNA3．1（＋）的细胞为对照,筛选出阳性细胞克隆。以胎盘碱性磷酸酶为底物,定量检测GPI—PLD活性,RT—PCR法确定GPI—PLDmRNA表达水平。细胞计数绘制生长曲线,台盼蓝排斥法观察补体介导的细胞毒（CDC）杀伤率,ELISA检测癌胚抗原（CEA）的表达情况。结果阳性细胞克隆GPI—PLD酶活性水平比对照组升高约3倍,GPI—PLDmRNA表达水平约增加6倍;GPI—PLD基因过度表达可促进GPI锚定的蛋白质如CEA和PLAP等被大量水解释放入培养基,导致细胞增殖能力减弱,对补体杀伤的敏感性增强。结论成功将GPI—PLD基因转染入SW579细胞,并在细胞中稳定表达。GPI—PLD过表达能抑制肿瘤细胞增殖,增强肿瘤细胞对补体杀伤的敏感性。