应用酵母双杂交系统筛选MRP2胞内区相互作用蛋白

目的 应用酵母双杂交技术研究与多药耐药蛋白MRP2发生相互作用的蛋白.方法 应用酵母双杂交系统,以人MRP2胞内区C末端220个氨基酸为诱饵,筛选成人肝cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白.利用生物信息学分析,一对一酵母回复性杂交等提供的信息,筛除假阳性.结果 经过酵母双杂交共获得162个克隆,经过验证分析,最终确定3个无重复阳性克隆.结论 获得的3个基因编码的蛋白可能揭示MRP2新的作用机制.     

利用酵母双杂交系统筛选与FXR1P相互作用的蛋白

目的筛选FXR1P相互作用蛋白,探讨FXR1P生物学功能。方法应用酵母双杂交技术,构建诱饵表达载体pGBKT7/FXR1,转化酵母菌AH109,与转化了人胎脑cDNA文库的酵母菌Y187交配筛选阳性克隆并测序。结果重组表达载体pGBKT7/FXR1构建成功;从人胎脑cDNA文库中筛选出5个与FXR1P结合的蛋白基因,分别与5种已知的编码蛋白基因序列同源：胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸合成酶（CMAS）、铁蛋白重链多肽1（FTH1）、高尔基体自身抗原golgina亚类4（GOLGA4）、17-β羟类固醇脱氢酶1（HSD17B1）、绒毛膜生长催乳激素1（CSH1）。结论为进一步研究FXR1P的功能及脆性X综合征发病机制提供新的线索。     

酵母双杂交筛选雄激素受体辅助调节因子267-α(ARA267-α)的相互作用蛋白

目的:通过酵母双杂交系统筛选与雄激素受体辅助调节因子267-α(androgen receptor-associated coregulator 267-α,ARA267-α)有相互作用的蛋白质,为研究ARA267-α的生理功能寻找证据和方向.方法:以能表达ARA267-α中4个PHD(p1ant homeodomain)和1个SET[Su(var)3-9,Enhancer-of-zeste,Trithorax]结构域的pGBKT7-PHD-SET重组质粒为"诱饵",采用酵母融合(yeast mating)方法筛选预转化的人脑cDNA文库.挑选阳性酵母菌落进行质粒提取、限制性内切酶分析和DNA测序.将测序结果在GenBank中进行核苷酸序列同源性比对,确定它们所对应的基因.通过再次酵母双杂交排除假阳性相互作用.结果:筛选cDNA文库共获得约600个阳性酵母菌落,随机挑选其中的65个菌落提取混合质粒.经过在氨苄青霉素培养盘中筛选,共得到43个文库pACT2-cDNA质粒.选取35个酶切片段不同的文库pACT2-cDNA质粒进行测序,测序结果比对揭示,35个cDNA插入片段来源于16种不同的基因.酵母双杂交证实其中RanBPM是ARA267-d的假阳性作用蛋白.结论:通过筛选cDNA文库发现ARA267-α可以与多个不同的蛋白质相互作用,这提示ARA267-α可能是一个具有多种生理功能的蛋白分子,而RanBPM极可能是一个转录因子.     

2型糖尿病合并牙周病患者CRP及细胞间黏附分子的变化

目的:观察2型糖尿病合并牙周病患者血液C反应蛋白(CRP)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的水平变化及其意义.方法:150例患者分为3组,2型糖尿病合并牙周病组60例,2型糖尿病组50例,牙周病组40例,另选择同期健康体检合格者40例作为对照组,采用免疫散射比浊法测定血清CRP水平,采用ELISA法测定血清ICAM...     

甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)基因多态性与长江以南汉族人群系统性红斑狼疮(SLE)的相关

 目的 探讨甲基CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,MeCP2)基因单核苷酸多态性与中国长江以南汉族人群系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)的易感性。方法 采用病例对照研究设计,收集病例141例,对照144例。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对rs2239464、rs2075596两位点进行基因分型,在不同的遗传模式下分析两个位点基因多态性与SLE的相关性。根据赤池信息准则(Akaike’s information criteria,AIC)值最小原则,筛选最优模型。结果 在显性、隐性、相加及相乘遗传模式下,两位点基因型或等位基因频率分布在病例组与对照组间的差异均有统计学意义(P<0.05)。显性遗传模式下,rs2239464、rs2075596位点GG/AG基因型为SLE的保护性基因型(ORrs2239464=0.528,95%CIrs2239464:0.315~0.885;ORrs2075596=0.435,95%CIrs2075596:0.264~0.717)。隐性遗传模式下,rs2239464、rs2075596位点GG基因型在统计学上具有显著的保护性作用(ORrs2239464=0.108,95%CIrs2239464:0.013~0.863;ORrs2075596=0.097,95%CIrs2075596:0.012~0.771)。相加遗传模式下,以AA基因型为参照,rs2239464位点GG基因型为SLE的保护性基因型(OR=0.094,95%CI:0.012~0.758),rs2075596位点AG及GG基因型也具有保护性作用(ORAG =0.498,95%CIAG:0.298~0.832;ORGG =0.077,95%CIGG:0.010~0.612)。相乘遗传模式下,rs2239464、rs2075596两位点的G等位基因为SLE的保护性等位基因(ORrs2239464= 0.503,95%CIrs2239464:0.319~0.793;ORrs2075596=0.445,95%CIrs2075596:0.289~0.686)。rs2239464,rs2075596位点的最优遗传模式均为相加遗传模式。结论 在中国长江以南汉族人群中MECP2基因rs2239464,rs2075596位点基因多态性与SLE相关,突变等位基因G可能是SLE保护性等位基因。     

siRNA干扰Caco-2细胞鞘磷脂合酶2 (SMS2)基因对药物转运体的影响

 目的  研究鞘磷脂合酶2 (sphingomyelin synthase 2,SMS2)缺损对人结肠癌细胞(colon cancer cell,Caco-2)中药物转运体P 糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)及多药耐药相关蛋白2 (multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)的表达与功能的影响。方法  SMS2特异性siRNA转染至Caco-2细胞。采用RT-PCR和real-time PCR检测SMS2-特异性siRNA的干扰效率;采用Western blot法检测siRNA转染后P-gp和 MRP2蛋白表达的变化;采用胞内蓄积试验,通过HPLC检测P-gp及MRP2专一性底物罗丹明123及普伐他汀的蓄积含量,分析下调SMS2水平对Caco-2细胞中P-gp及MRP2功能的影响。结果  应用siRNA下调SMS2水平后,P-gp和MRP2的蛋白质水平均显著下调;胞内蓄积实验结果显示罗丹明123及普伐他汀的蓄积量明显增加,说明P-gp和MRP2的外排功能减弱。结论  SMS2基因表达下调对Caco-2细胞中P-gp和MRP2的表达以及功能均有显著影响。     

EF-hand对钙调磷酸酶B同源蛋白2的生物学功能影响

目的探讨EF-hand结构对钙调磷酸酶B同源蛋白2（CHP2）的生物学功能的影响。方法通过PCR扩增CHP2 cDNA片段,构建带GFP标签的野生型及EF-hand突变型CHP2表达质粒;与钠氢离子交换蛋白1（NHE1）共转染PS120细胞;采用激光共聚焦显微镜、膜滤过法、免疫共沉淀等手段,明确CHP2结合Ca2＋的数量、部位,以及对CHP2与NHE1结合的影响;在血清饥饿条件下,观察表达EF-hand突变的CHP2（NHE1/CHP2-EF3m/4m）对细胞生存的影响。结果分别突变EF-hand结构EF3或EF4,CHP2结合Ca2＋减少;同时突变EF3和EF4,CHP2不能结合Ca2＋;免疫共沉淀实验结果显示乙二胺四乙酸（EDTA）剥夺CHP2携带的Ca2＋之后,CHP2与NHE1结合的数量明显减少;不携带Ca2＋的CHP2在细胞内与NHE1结合的数量也明显减少;在血清饥饿条件下,表达不携带Ca2＋的CHP2的细胞存活数量减少。结论 CHP2能结合2个Ca2＋,结合部位在EF3和EF4;携带Ca2＋能增强CHP2与NHE1的结合能力;在血清饥饿条件下,携带Ca2＋的CHP2能提升细胞抵抗死亡的能力。     

糖化血清蛋白及游离脂肪酸在2型糖尿病患者血清中的变化分析

目的:通过对2型糖尿病患者空腹糖化血清蛋白(GSP)和空腹、餐后2h的血糖及游离脂肪酸(FFA)浓度的测定,分析其变化情况及意义。方法:选取2型糖尿病患者34例,正常对照组31例,采用葡萄糖己糖激酶法测定血糖浓度;酮胺氧化酶法测定GSP的浓度;酶比色法测定FFA的浓度。结果:2型糖尿病组空腹GSP、FFA及餐后2h的血糖浓度与正常对照组相比较,差异有显著性(P<0.05);2型糖尿病组空腹及餐后2h的血糖浓度与FFA呈正相关(r=0.8722、r=0.8553,P<0.01),与GSP呈正相关(r=0.9277、r=0.9091,P<0.01);餐后FFA虽较餐前略有下降,但无显著差异(P>0.05)。结论:GSP和FFA浓度的测定对2型糖尿病的监控具有重要价值。     

浆细胞性淋巴细胞EB病毒与bcl—2蛋白表达的关系

目的 探讨浆细胞性淋巴瘤中EB病毒感染与bcl-2蛋白表达的关系。方法 采用免疫组织化学、原位杂交分别检测7例浆细胞性淋巴瘤bcl-2、LMP－1蛋白的表达及EBER1／2,并且对bcl-2、EBER1／2双阳性病例进行双标记检测。结果 7例浆细胞性淋巴瘤均呈bcl-2蛋白阳性,2例喉部病例呈EBER1／2阳性（双标记证实,其中EBER1／2阳性的肿瘤细胞60％－70％同时bcl-2阳性,bcl-2阳性的肿瘤细胞80％－90％同时EBER1／2阳性）,其中有1例呈LMP－1阳性。结论 浆细胞性淋巴瘤bcl-2蛋白表达率很高,EBER1／2表达率较低。EB病毒的感染与bcl-2蛋白的高表达相关性不大,可能与病变部位有关。     

高敏C反应蛋白和脂蛋白(a)联合检测在冠心病诊断中的应用

目的 探讨高敏C反应蛋白（hs-CRP）和脂蛋白（a）联合检测对冠心病的诊断价值。方法 对166例疑诊冠心病的患者进行冠状动脉造影检查，根据造影结果分为冠心病组（CHD组）和非冠心病组（非CHD组），并分别进行hs-CRP和Lp（a）的测定、分析。结果 CHD组患者血浆hs-CRP和Lp（a）浓度均高于非CHD组（P〈0．01）。两项指标联合检测对CHD患者诊断的特异度（89．2％）高于分别应用hs-CRP（86．5％）或Lp（a）（70.3％）单一指标。结论 hs-CRP和Lp（a）两项指标联合检测更有助于冠心病的预测和论断．     

肺癌组织中Nrf2、Keap1和NQO1蛋白的表达

目的:研究肺癌组织中Nrf2、Keap1和NQO1蛋白表达的情况。方法:采用免疫组化法检测67例肺癌患者的肺癌组织及癌旁正常组织中Nrf2、Keap1和NQO1蛋白的表达,并分析Keap1、Nrf2和NQO1蛋白的表达与肺癌临床病理特征的关系。结果:Keap1蛋白在肺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期鳞癌和Ⅲ期、Ⅳ期腺癌中的表达高于癌旁正常组织(P<0.05);Nrf2蛋白在肺Ⅰ期鳞癌和Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期腺癌中的表达低于癌旁正常组织(P<0.05);NQO1蛋白在肺Ⅰ期鳞癌中的表达低于癌旁正常组织(P<0.05),在Ⅱ期腺癌中的表达高于癌旁正常组织(P<0.05)。3种蛋白的表达与肺癌患者的临床分期和是否侵及胸膜有关(P<0.05)。结论:肺癌组织中Keap1、Nrf2、NQO1蛋白表达异常,提示Keap1-Nrf2/ARE通路在肺癌的发生发展中可能发挥重要的作用。     

血管紧张素-(1-7)对二肾一夹高血压大鼠肾纤维化和功能的影响

目的观察血管紧张素-(1-7)[angiotensin-(1-7),Ang-(1-7)]对二肾一夹(two-kidney,one clip hypertension,2K1C)高血压大鼠肾脏结构和功能的影响.方法采用微渗泵植入技术,复制Ang-(1-7)对高血压大鼠干预模型,光镜下观察肾脏病理变化;考马斯亮蓝法测定尿蛋白,全自动生化分析仪测定血肌酐、尿素氮.结果 Ang-(1-7)干预28 d后,2K1C高血压大鼠肾纤维化明显减轻(光镜),尿蛋白(g/L)显著减少(0.263±0.172vs 0.579±0.158,P＜0.01),对血肌酐(52.9±19.8vs 53.579±24.3,P＞0.05)、尿素氮(4.4±2.6vs 4.2±1.8,P＞0.05)无显著影响.结论 Ang-(1-7)对2K1C高血压大鼠肾纤维化具有一定保护作用,并减轻蛋白尿.     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的:利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因.方法:采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM-T Easy Vector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆.将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息.结果:扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4 个,ESTs 2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个.结论:成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因.