结核分枝杆菌三种基因重组质粒的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a表达重组质粒,并原核表达重组蛋白。方法将目的基因亚克隆到pET-28a表达载体,转化入大肠埃希菌BL21（DE3）plysS,诱导表达重组蛋白ESAT-6、CFP10、phoS2。结果成功构建基因工程菌株ESAT-6、CFP10、phoS2/pET-28a/BL21（DE3）plysS,表达重组蛋白ESAT-6、phoS2,因以包涵体形式存在,无法纯化。结论成功构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a重组质粒,分别表达分子量约10×103、31×103的ESAT-6、phoS2重组蛋白,但无法纯化,CFP10不表达。     

结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及表达质粒构建

目的 克隆并构建编码结棱分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结棱分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出Ag85B基因(978bp)，并克隆到T栽体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转入大肠杆菌E．coli DH5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与文献报道一致，证实符合表达框架。结论成功地克隆并构建了Ag85B基因的重组表达质粒pGEX-Ag85BV。     

结核分枝杆菌Rv3872基因的克隆、表达和纯化

目的原核表达并纯化结核分枝杆菌Rv3872蛋白。方法聚合酶链反应（PCR）技术从结核分枝杆菌标准株H37Rv全基因组中扩增出的表达Rv3872基因序列，将其克隆到pMD18-T载体后，测序分析。亚克隆该目的基因到pET28a表达载体，最终转化至大肠杆菌BL21（DE3），获得正确的阳性克隆子后大量表达重组Rv3872蛋白，再经纯化、定量后，通过Western blot分析其抗原性。结果扩增Rv3872基因经序列测定与GenBank公布的序列完全一致，表达蛋白经SDS-PAGE分析，在约15000kD处有表达条带，纯化后的重组蛋白占总蛋白的90％以上。免疫印迹分析显示重组的Rv3872蛋白具有抗原性。结论成功表达结核分枝杆菌的Rv3872蛋白，为结核病血清学诊断候选抗原筛选和开发应用打下基础。     

结核分枝杆菌ESAT6基因克隆与表达质粒构建

目的 克隆结核分枝杆菌(MTB)分泌蛋白ESAT6基因，并构建重组表达质粒。方法 根据Genbank中ESAT6基因序列，针对其编码区合成引物，采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出ESAT6基因，并连接到T载体，然后定向克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 经双内切酶消化所切下的片段，大小与预计相符；测序结果证实基因序列正确，符合表达框架。结论 成功构建了重组原核表达质粒pGEX-ESAT6。     

结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及表达质粒构建

目的　克隆并构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出Ag85B基因 (978bp) ,并克隆到T载体 ,然后用双内切酶消化后 ,与同样酶消化的pGEX 4T 2连接 ,转入大肠杆菌E .coliDH5α,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果　酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符 ,测序结果与文献报道一致 ,证实符合表达框架。结论　成功地克隆并构建了Ag85B基因的重组表达质粒 pGEX Ag85BV。     

结核分枝杆菌ESAT6基因克隆与表达质粒构建

目的　克隆结核分枝杆菌 (MTB)分泌蛋白ESAT6基因 ,并构建重组表达质粒。方法　根据Genbank中ESAT6基因序列 ,针对其编码区合成引物 ,采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出ESAT6基因 ,并连接到T载体 ,然后定向克隆到原核表达质粒pGEX 4T 2 ,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果　经双内切酶消化所切下的片段 ,大小与预计相符 ;测序结果证实基因序列正确 ,符合表达框架。结论　成功构建了重组原核表达质粒 pGEX ESAT6。     

结核分枝杆菌MPT64基因克隆与表达质粒构建

[目的] 克隆并构建编码结核分枝杆菌MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。[方法] 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出MPT64基因(687bp)，并克隆到T载体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转化大肠杆菌E．coil DH5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。[结果] 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与文献报道一致，证实符合表达框架。[结论] 成功地克隆并构建了MPT64基因的重组表达质粒pGEX-MPT64。     

结核分枝杆菌Rv0444c基因的克隆、表达及ELISA检测

目的：探索结核分枝杆菌Rv0444c基因编码的蛋白作为结核检测抗原的可行性。方法：首先克隆了结核分枝杆菌Rv0444c蛋白的编码基因，构建了pET30a—Rv0444c重组质粒，并将其成功的转化到大肠杆菌JF1125克隆载体中，测序鉴定结果正确。将pET30a—Rv0444c重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，表达纯化目的蛋白并做质谱分析。制备Rv0444c蛋白的多克隆抗体，纯化的重组蛋白通过间接ELISA实验进行抗原性的初步检测．结果：重组抗原在检测耐药肺结核病人中的检出率为41．6％（25／60），特异性为90％。结论：为后续深入研究Rv0444c蛋白的生物功能、研究其作为诊断靶标、药靶候选蛋白的可行性提供了基础．     

结核分枝杆菌Rv3671c基因的克隆表达及免疫印迹检测

摘要：目的:构建结核分枝杆菌Rv3671c蛋白的重组质粒,在大肠埃希菌中表达并纯化重组蛋白Rv3671c,并评价结核分枝杆菌Rv3671c结构域多肽的免疫学特性。 方法：将编码结核分枝杆菌Rv3671c蛋白的基因克隆到pET-28a载体,并在大肠埃希菌中表达,镍亲和层析和离子层析法纯化重组Rv3671c蛋白,透析复性和Lowry法测定蛋白质浓度。对蛋白质悬液进行SDS-PAGE分析并进行免疫印迹检测。 结果：结核分枝杆菌Rv3671c蛋白在大肠埃希菌中成功表达,层析纯化获得纯度为95.0％的重组Rv3671c蛋白,免疫印迹检测显示重组表达蛋白与结核病患者混合血清具有良好亲和性。 结论：Rv3671c结构域多肽可作为新的结核病血清学检测方法的候选抗原肽组分。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与表达

目的　对结核分枝杆菌的ESAT - 6基因进行克隆、鉴定与表达 ,为结核病的诊断、重组疫苗的应用打下基础。方法 　 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用聚合酶链反应 (PCR)对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物连接于测序载体 pGEM T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR产物与原核表达载体pET4 2b(+)构建表达ESAT - 6的重组质粒 ,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒 ,经酶切鉴定后 ,再转化入表达宿主大肠杆菌BL2 1菌株内 ,对转化菌株进行诱导后 ,破菌 ,进行SDS -PAGE电泳。结果 　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,其表达的蛋白质相对分子质量为 990 0。结论 　 目的基因克隆到菌株内 ,重组结核分枝杆菌ESAT - 6的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测等奠定了基础     

结核分枝杆菌抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868的克隆表达及血清诊断学初步评价

目的 评价结核分枝杆菌蛋白抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868的血清诊断价值和潜在应用前景。方法 以结核分枝杆菌H37Rv标准株全基因组DNA为模板扩增得到Rv2654c、Rv1985c和Rv3868基因的完整序列, 并与表达载体pET-32a构建重组质粒。原核表达Rv2654c、Rv1985c和Rv3868蛋白, 利用亲和层析的方法进行纯化。采用棋盘滴定的方法, 确定各抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)最佳反应条件, 并应用190份血清进行血清IgG抗体检测, 结合受试者工作特征曲线(ROC)对其诊断效能进行分析和评价。通过ROC计算各抗原组合的诊断效能, 确定最佳组合方案。结果 成功构建了重组蛋白, 对重组后的片段进行测序, 经BLAST比对与目的基因完全一致, 且能够稳定表达。对经纯化后的3种蛋白进行ELISA检测, 经统计学分析, Rv2654c、Rv1985c和Rv3868抗原的诊断效能分别达到73.16%、56.84%和71.05%。结合ROC得到最佳的抗原组合方案为Rv2654c+Rv3868, 其敏感性、特异性和诊断效能分别达到78.95%、72.63%和75.79%。结论 结核分枝杆菌重组抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868具有作为结核病诊断抗原的潜力, 可以作为结核病免疫学快速诊断的候选蛋白。抗原组合Rv2654c+Rv3868具有较高的诊断效能, 有较好的潜在应用价值。     

人类免疫缺陷病毒与结核分枝杆菌共感染的危险因素研究进展

2021年全球估计新发结核病(tuberculosis,TB)患者1060万,我国新发TB患者居全球第3位,约有78万新发患者^[1],然而,已报道的TB患者数却只是冰山一角,目前全球估算有17亿人为结核潜伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)人群,占全球总人口的23%^[2],有5%~10%LTBI人群在一生中会发展为活动性TB,且通常发生在初次感染结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)后的前5年内^[3],这将成为庞大的传染源。     

结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因的克隆表达及其促生长作用的研究

目的 构建结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rvl884c和Rv0867c基因的表达蛋白,并初步研究其促生长作用.方法 制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用PCR技术扩增目的 基因片段;将2个片段分别克隆入克隆载体pGEx-4T-1和pUC19,再分别克隆入原核表达载体pGEX-4T-1和pPRO-EXHT,经序列测定证实正确后,再经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST标记的Rv1884c融合蛋白和His标记的Rv0867c融合蛋白;用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式.结果 成功扩增出了结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c和pPRO-EXHT-Rv0867c,转化人大肠杆菌DH5α中经诱导产生高水平的表达产物.经SDS分析,在相对分子质量为45 000和80 000处出现新生蛋白带,凝胶薄层扫描检测表达量分别约占菌体蛋白的18.3%和23.7%.用GSTrap FF亲和层析柱和Ni2+-NTA纯化柱进行蛋白纯化,并研究这两种蛋白对藤黄微球菌、BCG和结核分枝杆菌H37Rv的促生长作用.结论 成功克隆了结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究Rv1884c和Rv0867c基因蛋白的活性及其功能,以及研究结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础.     

南京地区HIV/AIDS患者分枝杆菌感染分布及耐药性分析

目的 分析南京地区HIV/艾滋病(AIDS)患者合并结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)和非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacterium,NTM)感染的状况及其耐药性.方法 回顾性选取2017年1月至2020年7月南京市第二医院感染科收治的HIV/AI...     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与表达

目的 对结核分枝杆菌的ESAT-6基因进行克隆、鉴定与表达，为结核病的诊断、重组疫苗的应用打下基础。方法 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用聚合酶链反应(PCR)对ESAT-6基因进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pGEM-T上，经测序反应确定无误后，再将PCR产物与原核表达载体pET42b( )构建表达ESAT-6的重组质粒，将重组质粒先转化人大肠杆菌DH5a内并提取质粒，经酶切鉴定后，再转化入表达宿主大肠杆菌BL21菌株内，对转化菌株进行诱导后，破菌，进行SDS-PAGE电泳。结果 电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白，其表达的蛋白质相对分子质量为9900。结论 目的基因克隆到菌株内，重组结核分枝杆菌ESAT-6的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测等奠定了基础。     

结核分枝杆菌耐药基因与检测方法的研究进展

结核分枝杆菌(MTB)的高耐药问题已成为新世纪结核病控制的三大难题之一[1].近年来,随着分子生物学技术的迅速发展,人们对MTB耐药的分子机制进行了深入研究,并已取得了很大进展.本文就此内容综述于下.     

结核分枝杆菌km基因的突变情况分析

目的探讨结核分枝杆菌km基因突变的情况。方法通过传统梯度药敏试验和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析248株分枝杆菌临床分离株耐药情况和km基因的变化。结果药敏试验耐药率为32.7%(81/248),248株分枝杆菌临床分离株的16S rDNA SSCP电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同。81株耐卡那霉素分离株中,24株(29.6%)km基因SSCP泳动异常。结论其部分耐药原因可能是由于T.M耐KM药物的km基因突变所致。     

变形链球菌thrS基因生物信息学分析及同源重组质粒的构建

背景:变形链球菌是公认的主要致龋菌,细菌的黏附、生物膜形成、产酸、耐酸等各个表型都与细菌的致龋性相关.有研究结果提示,苏氨酰-tRNA合成酶基因(threonyl-tRNA synthetase,thrS)可能与变形链球菌的黏附、产酸、耐酸等致龋性表型相关.目的:对苏氨酰tRNA合成酶基因进行保守性分析,构建用于变形链球菌苏氨酰-tRNA合成酶基因敲除的重组质粒.方法:首先通过生物信息学结合Southern Blot对苏氨酰-tRNA合成酶基因的保守性进行分析,再将变形链球菌苏氨酰-tRNA合成酶基因上下游序列分别克隆至自杀质粒pFW5上的多克隆位点,构建用于基因敲除的重组质粒.观察苏氨酰-tRNA合成酶基因的保守性及重组质粒的构建结果.结果与结论:苏氨酰-tRNA合成酶基因在实验中所列6种变形链球菌中保守存在:经过聚合酶链反应和酶切分析,重组质粒所插入片断无误.表明重组质粒pFW5-thrS构建成功.重组质粒pFW5-thrS的构建可用于今后变形链球菌苏氨酰-tRNA合成酶基因功能的研究.     

结核分枝杆菌融合基因Hsp65-Esat6荧光表达载体的构建及表达

背景:Hsp65和Esat6之间的Linker编码一段疏水性多肽,其具有良好的柔顺性和折叠性,有利于翻译成融合蛋白时融合蛋白之间的空间折叠,使融合蛋白保持与两个天然蛋白空间构象的一致性,从而形成正确的构型而提高它们的免疫原性。目的:从结核分枝杆菌(MTB)H37Rv株中克隆目的融合基因Hsp65-Esat6,与报告基因EGFP一起构建真核表达载体pEGHsp65-Esat6,通过免疫组织化学法分别检测细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达。设计:单一样本实验。单位:暨南大学医学院微生物免疫学教研室。材料:质粒pVAE由华南理工大学曹以诚教授惠赠,MTBH37Rv株、大肠杆菌DH5α、表达质粒pEGFP-C1为本实验室保存,Hela细胞由本教研室胡萍博士惠赠。方法:实验于2005-09/2006-06在暨南大学医学院微生物与免疫教研室和中心实验室完成。以MTB全基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因(不含终止子),与pEGFP-C1载体进行重组,构建pEGHsp65(不含终止子)重组质粒。再以pVAE质粒为模板,经PCR扩增出Linker-Esat6基因,与pEGHsp65质粒(不含终止子)进行重组,构建真核表达载体pEGHsp65-Esat6。通过限制性内切酶图谱测定pEGHsp65-Esat6融合质粒大小;对质粒pEGFP-C1的多克隆位点内的DNA序列进行序列分析鉴定;将质粒转染Hela细胞,观察荧光的表达情况及转染效率,通过免疫组织化学法分别检测细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达。主要观察指标:①pEGHsp65-Esat6融合质粒大小。②pEGFP-C1DNA序列分析。③转染后Hela细胞的荧光表达情况。④细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的免疫组织化学结果。结果:①质粒pEGFP-C1的大小约为4.7kb,而pEGHsp65为6.4kb,融合质粒pEGHsp65-Esat6约为6.7kb,在琼脂糖凝胶电泳图上可以分辨出泳动速度的差异。②结果与结核分支杆菌H37Rv株的Hsp65和Esat6的基因序列完全相同。③转染融合质粒24h后,使用共聚焦显微镜可观察到有部分细胞表达荧光蛋白,说明融合质粒转染成功,转染率约为30%。未转染的Hela细胞则无荧光表达。④通过免疫组织化学法证实融合质粒在Hela细胞内能正确表达出具有生物学活性的Hsp65与ESAT-6蛋白。结论:采用Hsp65和Esat6搭配作为免疫原,成功克隆并构建了结核分枝杆菌融合基因Hsp65-Esat6荧光真核表达质粒。     

艾滋病合并播散性非结核分枝杆菌病诊治现状及研究进展

非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria,NTM）作为一种机会性致病菌,一般很少在免疫功能正常的人群中引起疾病,除非宿主免疫防御功能受损。获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome,AIDS）患者由于体内人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）破坏CD4+T淋巴细胞,使得机体免疫功能严重缺陷,当患者感染NTM时,NTM很可能定植,并最终导致患者出现播散性NTM病（disseminated non-tuberculous mycobacterial disease, DNTM）。近年来,全球结核病患者数量呈下降趋势,然而随着AIDS流行、免疫抑制人群数量增加以及实验室NTM检测技术不断进步等因素,AIDS合并NTM的患者数呈上升趋势。与结核病相比,我国公共卫生管理系统未将NTM感染纳入上报系统,而且以往临床重视程度不足,因此系统研究也较少。国内一些地区AIDS合并DNTM患者的5年病死率已高达26.7%,该病极大威胁着患者的生命健康,并消耗了大量医疗资源。我国在N...