乳腺良恶性病变组织端粒长度和端粒酶活性检测

目的　比较乳腺良恶性病变端粒长度改变及其在肿瘤发生发展中的意义 ;探讨端粒酶活性与临床病理参数的关系及其在乳腺癌诊断中的价值。方法　Southern印迹杂交检测TRF长度 ,端粒重复扩增分析 (TRAP)方法检测端粒酶活性。结果　乳腺癌组织平均TRF为 (5 2± 2 8)kb ,与正常组织比较明显缩短 (P <0 0 0 1) ,从正常乳腺组织到乳腺良性病变、乳腺原位癌及浸润性癌平均TRF呈递减趋势。 5 8例乳腺癌中 4 9例端粒酶阳性 (84 7% ) ,端粒酶活性与临床病理参数无相关性 ;癌旁组织端粒酶为阴性 ,而 7例乳腺增生症和 6例乳腺纤维腺瘤中分别有 1例端粒酶阳性 ,与乳腺癌比其差异有显著性 (P <0 0 0 1)。结论　端粒长度在肿瘤发生发展过程中渐进性缩短 ,并最终触发端粒酶的激活 ;端粒酶活性检测有望成为乳腺癌诊断的可靠标记物     

端粒相关蛋白TIN2

TIN2(TRF1相互作用核蛋白2)是一重要的端粒相关蛋白。人TIN2蛋白包括N端,TRF1交互作用区(TRF1-Int)和C端3个结构域。它在TRF1复合物、TRF2复合物和Shelterin的功能中扮演关键角色,协同其它端粒蛋白维持端粒长度、结构和功能。TIN2与个体发育、细胞分化和肿瘤发生密切相关。     

端粒长度与卵巢功能的相关性研究

目的探索端粒长度变化与女性卵巢功能的关系及其临床意义。方法在本院2006.3～2008.7住院治疗的各个年龄段的育龄女性及卵巢早衰患者正常卵巢组织标本66例,常规酚一氯仿法提取组织DNA后与端粒寡聚核苷酸探针进行Southern blot杂交、γ-32P检测及光密度扫描法测定端粒平均长度。结果各年龄段TRF值随着年龄的增长,其TRF值有下降的趋势,在20～35岁,36～55岁两年龄段之间无统计学差异,在35岁后其TRF值为6.64+0.21kb,在56岁后其TRF值为4.41+0.09kb,进行统计学分析后有统计学显著性差异。当FSH值小于30U/L时,其TRF值虽有下降趋势,无明显统计学差异,而FSH为31～40U/L时,其TRF值5.76±0.23kb,与前2组相比较有明显统计学差异;卵巢早衰组与正常绝组的TRF相比有明显统计学差异,卵巢早衰组女性的TRF值明显长于正常绝经组。结论对于正常女性来说,卵巢皮质TRF长度可以在一定程度上反映卵巢功能及生育能力,由于导致卵巢早衰的病因复杂及影响端粒长度的因素较多,导致端粒长度变化与卵巢功能相关性的临床意义尚未完全确定。     

端粒及端粒酶活性的调控机制

广义的端粒由帽子、双链的串联重复序列的DNA核心部分及亚端粒构成,其结合蛋白是一个复合体,由TRF1、TRF2、TIN2、Pot1、TPP1、RAP1 6个亚单位组成;另外,还结合组蛋白的特定成分H3K9三甲基聚合体和H4K20三甲基聚合体.端粒酶主要由hTerc、hTert、dyskerin构成.端粒的功能主要受端粒酶的活性调控;而端粒酶活性主要受hTert及hTerc的转录水平和转录后的剪切、hTert的翻译等因素的调控.端粒与端粒酶结构和功能的异常与细胞衰老及肿瘤的发生、发展关系密切.     

口虾蛄提取物对人鼻咽癌细胞端粒酶活性的影响

目的:研究口虾蛄提取物(EOS)对人低分化鼻咽癌细胞系(CNE-2Z)端粒酶活性的抑制作用及其可能机制。方法:MTT法检测不同浓度的EOS对CNE-2Z细胞增殖能力的影响;端粒酶重复序列扩增-酶联免疫吸附法(TRAP-ELISA)检测各组细胞端粒酶活性,RT-PCR法检测端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达,Western blotting检测c-Myc蛋白表达。结果:EOS对CNE-2Z细胞增殖具有抑制作用,且呈剂量依赖性(P0.01);EOS处理组CNE-2Z细胞端粒酶的活性、hTERT mRNA和c-Myc蛋白的表达水平均低于对照组(P0.01),也呈剂量依赖性,并且hTERT mRNA的下调与c-Myc的抑制存在相关性(P0.05)。结论:EOS可能通过下调细胞c-Myc表达而抑制了hTERT mRNA的转录,以致端粒酶的活性降低而抑制CNE-2Z细胞增殖。     

利用人外周血白细胞端粒长度推断年龄

目的：探讨人外周咀白细胞端粒长度与供体年龄的关系,为法医学通过微量软组织推断年龄提供依据。方法：选取105例0～81岁健康人外周血样本,采用Southern印迹法检测其端粒限制性片段(terminal restriction fragment,TRF)平均长度,并作相关及回归分析。结果：外周血白细胞TRF长度随年龄增长逐渐缩短,并呈不均衡趋势;端粒DNA平均每年缩短51bp;得到推断年龄回归方程：Y=-16．539X 236．287±9．832。结论：人外周血白细胞TRF长度与年龄呈负相关,此规律为通过端粒DNA长度推断个体年龄提供了可能。     

原发性胃癌组织中的端粒及端粒酶表达

目的观察端粒（ＴＲＦ）及端粒酶在胃癌形成及发展中的作用。方法采用ＤＮＡ琼脂糖凝胶杂交技术及端粒重复扩增ＰＣＲ方法检测１７例早期胃癌、８９例进展期胃癌组织及邻近正常组织中的平均ＴＲＦ长度及端粒酶活性。结果早期、进展期胃癌的ＴＲＦ长度及端粒酶活性表达均显著短于或高于邻近胃组织（Ｐ＜０．０５～０．０１），且端粒酶活性的表达主要表现在ＴＲＦ缩短或延长的胃癌组织中，而ＴＲＦ缩短与胃癌的分化程度相一致。结论端粒及端粒酶的异常状态可能与胃癌的发生发展密切相关，端粒酶活性及端粒缩短可以作为胃癌的诊断标志     

端粒重复因子2与p53的体外结合

目的 通过分析端粒主要结合蛋白端粒重复因子2(TRF2)与p53的体外结合,探讨p53通过端粒途径调节细胞增殖、衰老和凋亡的分子机制。方法 4种不同的p53-谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase,GST)融合蛋白和GST经大肠杆菌表达、谷胱甘肽-Sepharose^TM 4B纯化,其中的人重组p53包括野生型(1～393)、C端缺失体p53 N5(2～293)、N端缺失体p53 N5(95～393)、第175位氨基酸突变体(R→H)。将各纯化蛋白和人乳腺癌细胞MCF-7的细胞蛋白进行体外结合反应(pull down),Western blot检测反应物中p53和TRF2的结合。结果 纯化的GST和p53-GST融合蛋白纯度均在90％以上,且相对分子质量与预计的完全一致。TRF2的Western blot显示：野生型p53和p53-R 175H均能沉淀MCF-7中的TRF2,且结合力相似,而单独的GST则无沉淀TRF2的作用。与野生型p53和p53 R175H相比,p53 2C与TRF2的结合力相对增加,p53 N5与TRF2的结合力相对大大减弱。结论 p53和TRF2可以进行直接而特异的体外结合,且其结合部位在p53的C端(293～393)。p53和TRF2的C端依赖性结合可能与端粒动态变化所诱导的细胞活动有关。     

肺癌染色体端粒行为异常与癌变的关系

端粒是真核生物染色体的物理末端结构 ,由富含 G的寡核苷酸 DNA重复序列组成[1 ] 。人类染色体端粒平均长度为 8～14kb,核心序列是 5′TTAGGG3′[2 ,3 ] 。它和相邻的端粒结合蛋白一起具有维持染色体稳定的功能 [4] 。研究表明 ,在结肠癌、Wilms癌、乳腺癌等实体瘤及慢性粒细胞白血病中端粒长度明显缩短 [5 ] ,提示端粒长度异常与癌变之间可能存在一定相关性。我们对人肺癌染色体端粒行为异常与癌变的关系进行了一些探讨。1　对象和方法1.1　对象　人肺癌组织和癌旁组织标本来源于华西医科大学附属第一医院胸心外科病理诊断为肺癌的术…     

人骨髓间质干细胞中的端粒调控机制

目的：〖HT5"SS〗研究人骨髓来源间充质干细胞(MSCs)端粒长度的调控机制。方法：以贴壁培养法从人骨髓中分离MSCs并用MSCs及造血干细胞相关表面抗体作表型鉴定,用Southern blotting检测MSCs的端粒长度;应用免疫荧光染色技术检测端粒重复序列结合因子1（TRF1）和早幼粒细胞白血病蛋白小体（PML）的定位;以端粒重复序列扩增法（TRAP）和/或Western blotting法检测传代及分化成脂肪细胞的MSCs和经同步化处理被阻断在S期的MSCs的端粒酶表达。结果：与端粒酶阴性ALT细胞株WI-38-2RA细胞相比,MSCs的端粒长度较短并且端粒长度变异度不大;端粒调控相关蛋白TRF1和PML在MSCs中的定位则与端粒酶阳性细胞HeLa细胞相同,两者呈非共定位,而在端粒酶阴性WI-38-2RA细胞中两者呈共定位状态。MSCs中不存在有染色体外端粒重复序列DNA（ECTR DNA）。TRAP法检测传代培养的MSCs端粒酶呈阴性表达,但分化成脂肪的MSCs端粒酶呈阳性表达。Western blotting 检测同步化处理前MSCs端粒酶呈微弱表达,经同步化处理被阻断在S期时,MSCs的端粒酶表达明显增高,并且与S期的细胞比例呈正相关。结论：MSCs中不存在ALT相关的早幼粒细胞白血病蛋白小体(APBs)、染色体外端粒重复序列DNA(ECTR DNA)和端粒长度较长、端粒长度变异度大等ALT机制相关分子特征;非同步化在S期处理的MSCs,端粒酶呈微弱表达,但诱导向脂肪细胞分化或处在S期时,MSCs的端粒酶表达明显增高,并且与S期的细胞比例呈正相关。本研究提示MSCs是通过端粒酶机制而不是端粒延长旁路途径（ALT）机制调控其端粒末端。     

端粒、端粒酶与妇科肿瘤

端粒是染色体末端的特殊结构，其长度随细胞分裂而进行性缩短，端粒酶是一种核糖核蛋白酶，能够逆转录合成端粒，维持其长度。端粒酶活性在几乎所有恶性肿瘤中被检测到，并且在妇科卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌及滋养细胞疾病的发生、发展过程中有重要作用，作为一种新的肿瘤标记物及抗癌靶点，日益受到重视。     

端粒、端粒酶与肿瘤

瑞粒、端粒酶与肿瘤之间的密切关系提示攻克肿瘤的可能性,因此越来越引起人们的重视。本文就端粒、端粒酶与肿瘤的关系研究进展予以阐述。l端粒（Telomere）瑞拉是真核生物线形染色体3’末端一段重复DNA序列与结合蛋白的复合体l’］。在人类细胞中,这段重复DNA序列以（TTAGGG）n的形式存在,而在其他真核生物细胞,重复的端粒DNA单位的长度多为5到8个碱基对,亦富含鸟瞟吟（G）I’］。瑞拉结合蛋白是与端粒重复DNA序列结合的特异性蛋白。它能使端粒DNA避免被化学修饰和降解,还能参与瑞粒长度和瑞粒酶活性的调节［’］。瑞拉结…     

端粒,端粒酶的结构功能与肿瘤研究新进展

从ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白质三方面，综合分析以往关于端粒和端粒酶的结构和功能的研究进展，及今年以来多项关于端粒结合蛋白及端粒酶结构蛋白的研究新突破，阐明了端粒长度及端粒酶活性与细胞凋亡、肿瘤发生和进展具有十分密切的关系。另外还注意到，随着“克隆羊”的诞生，以往关于端粒、端粒酶的理论势必面临新的挑战。     

6A8α-甘露糖甘酶表达抑制使Jurkat细胞间的黏附性增强

目的 探讨6A8α-甘露糖苷酶表达抑制对人T淋巴母细胞Judua生物学行为的影响。方法 采用反义核酸技术抑制细胞中6A8α-甘露糖苷酶的表达。用PCR检测转导基因在基因组中的整合。用单抗6A8作探针，Westem印迹和免疫荧光染色流式细胞术检测细胞中6A8α-甘露糖苷酶的表达状况。用Con A结合试验检测细胞蛋白质的糖基化改变。普通光学显微镜观察细胞的形态。用DNA芯片技术分析AS细胞和M细胞mRNA表达的差异。用RT-PCR和免疫荧光染色流式细胞术验证基因芯片结果的可靠性。结果 制备了6A8α-甘露糖苷酶表达抑制的Jurkat细胞(AS)。与对照细胞(野生型细胞W和转导空载体的细胞M)相比，AS细胞在培养中黏附成大团块。DNA芯片分析见与M细胞相比，AS细胞中有19个基因的表达上调，加个基因的表达下调。上调的基因中有一些与细胞间黏附相关，如CD54、CD11a、CD24、CD82、整合紊αX、整合紊α7、整合素αE、IL-1R、IL-2Rγ和TNFSF9。RT-PCR肯定了DNA芯片分析的可靠性。免疫荧光染色流式细胞术进一步肯定了CD54和CD11a在AS细胞表达的上调。结论 6A8α-甘露糖苷酶表达抑制使Judua细胞间黏附增强，CD54和CD11a等黏附分子表达的增高可能与此相关。     

星形细胞肿瘤中端粒酶与PTEN的表达及相关性

目的：研究星形细胞肿瘤中的端粒酶活性和PTEN表达,探讨其在星形细胞肿瘤发生发展过程中的相关性,方法：收集手术切除经病理证实的星形细胞肿瘤110例,8例正常脑组织作对照。用端粒酶原位杂交检测盒检测组织标本端粒酶活性,用LSAB法检测PTEN表达。结果：星形细胞肿瘤端粒酶活性和PTEN的阳性检出率分别为50％（55／110）和39．1％（43／110）,且随着肿瘤恶性程度的增加,端粒酶活性程度升高（P＜0．01）,端粒酶活性与PTEN表达有相关性（P＜0．01）,结论：端粒酶活性与星形细胞肿瘤的分化程度有关,提示端粒酶活性可能是星形细胞肿瘤恶性程度的重要标记物,PTEN蛋白可能对端粒酶的活性有调节作用。     

自身免疫性疾病中的短端粒

端粒，是近几年研究的热点，最近有研究表明I型糖尿病和类风湿关节炎病人的外周血白细胞端粒明显变短，一般认为这种变化与自身免疫有关，目前公认，细胞凋亡在自身免疫疾病发病中起重要作用，而端粒变短可触发P53和ATM途径，引起T细胞凋亡，近来发现的一种与端粒结合蛋白TRF2高度同源的自身抗体，进一步证实了端粒与自身免疫间的密切联系。本文就自身免疫与端粒研究中的最新进展作一综述，提出一种可能参与自身免疫性疾病的机制。     

染色体端粒改变与细胞程序化死亡

端粒是真核生物染色体的天然末端。它对染色体的稳定以及染色体的完全复制有着十分重要的作用。许多资料研究表明：端粒ＤＮＡ长度变化与细胞的衰老及肿瘤的发生有关。近年来在对细胞程序化死亡研究中有人提出染色体的端粒改变可作为程序化死亡早期的生物学标记。     

6A8α-甘露糖苷酶表达抑制使Jurkat细胞间的黏附性增强

目的　探讨 6A8α 甘露糖苷酶表达抑制对人T淋巴母细胞Jurkat生物学行为的影响。方法　采用反义核酸技术抑制细胞中 6A8α 甘露糖苷酶的表达。用PCR检测转导基因在基因组中的整合。用单抗 6A8作探针 ,Western印迹和免疫荧光染色流式细胞术检测细胞中 6A8α 甘露糖苷酶的表达状况。用ConA结合试验检测细胞蛋白质的糖基化改变。普通光学显微镜观察细胞的形态。用DNA芯片技术分析AS细胞和M细胞mRNA表达的差异。用RT PCR和免疫荧光染色流式细胞术验证基因芯片结果的可靠性。结果　制备了 6A8α 甘露糖苷酶表达抑制的Jurkat细胞 (AS)。与对照细胞 (野生型细胞W和转导空载体的细胞M)相比 ,AS细胞在培养中黏附成大团块。DNA芯片分析见与M细胞相比 ,AS细胞中有 19个基因的表达上调 ,2 0个基因的表达下调。上调的基因中有一些与细胞间黏附相关 ,如CD5 4、CD11a、CD2 4、CD82、整合素αX、整合素α7、整合素αE、IL 1R、IL 2Rγ和TNFSF9。RT PCR肯定了DNA芯片分析的可靠性。免疫荧光染色流式细胞术进一步肯定了CD5 4和CD11a在AS细胞表达的上调。结论　 6A8α 甘露糖苷酶表达抑制使Jurkat细胞间黏附增强 ,CD5 4和CD11a等黏附分子表达的增高可能与此相关。     

P53对涎腺腺样囊性癌细胞端粒酶活性的抑制作用

目的为了探讨P53基因对腺样囊性癌细胞端粒酶活性的抑制作用及机制。方法构建携带人野生型P53基因的腺病毒表达载体，以脂质体法瞬时转染腺样囊性癌SACC-83细胞，RT-PCR检测转染细胞P53基因mRNA的表达，TRAP-PCR-ELISA法检测转染细胞端粒酶活性的改变。并将P53基因与含有hTERT启动子核心调控区的荧光素酶报告基因pGL2—630共转染SACC-83细胞，测定转染细胞荧光素酶报告基因活性。结果1．瞬时转染含人野生型P53基因的重组腺病毒表达载体p△E1-P53于腺样囊性癌SACC-83细胞后，其P53基因mRNA的表达明显增强；2．基因转染后，SACC-83细胞内源性端粒酶活性显著降低。3．P53基因与含有hTERT启动子核心调控区的荧光素酶报告基因pGL2-630共转染SACC-83细胞后，其荧光素酶活性显著下降。结论外源性表达P53基因可以降低腺样囊性癌细胞SACC-83细胞端粒酶活性，并可能通过抑制端粒酶hTERT基因启动子的转录活性实现。     

三氧化二砷诱导Raji细胞凋亡过程中端粒酶活性和hTERT、bcl-2基因表达的研究

目的：研究三氧化二砷（As2O3）诱导Raji细胞凋亡并初步探讨端粒酶活性、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因及bcl-2基因表达之间的关系。 方法： 通过姬姆萨染色来观察细胞的凋亡；以RT-PCR分析bcl-2、hTERT基因的mRNA表达水平；利用半定量多聚酶链反应-酶联免疫反应(PCR-ELISA)方法检测As2O3处理Raji细胞前后端粒酶活性的改变。 结果： 2 μmol/L As2O3能诱导Raji细胞凋亡，2 μmol/L As2O3作用于Raji细胞8 h、12 h、24 h hTERT mRNA相对表达量分别与对照组比较有显著差异（P＜0.05）， 12 h、24 h bcl-2 mRNA相对表达量分别与对照组比较有显著差异。2 μmol/L As2O3作用48 h后，Raji细胞中端粒酶活性即出现下降，作用72 h、96 h，端粒酶的活性明显受到抑制，吸光度分别为0.829、0.328、0.291，分别与空白对照组比较有显著差异（P＜0.05）。结论： As2O3诱导Raji细胞凋亡过程中，端粒酶活性下调与hTERT、bcl-2基因mRNA表达下降有关。