犬骨髓间叶干细胞的分离培养和生物学特性

目的 建立犬骨髓间叶干细胞的体外分离、培养、扩增与鉴定方法，了解其生物学特性，为心肌梗死、心力衰竭及缓慢性心律失常的干细胞移植提供细胞材料。方法 抽取犬骨髓液10ml，以DMEM1：1稀释，用1.063g／ml percoll密度分离液，以600g离心力、30min分离骨髓单个核细胞；以LG-DMEM及10% FBS添加100U／ml青霉素，100μg／ml链霉素，25μg／ml两性霉素B培养骨髓干细胞；利用细胞贴壁筛选法分离、培养、扩增骨髓间叶干细胞；应用干细胞表面标志蛋白检测，诱导剂诱导分化间叶组织细胞等方法进行犬骨髓间叶干细胞的鉴定。结果 分离出的犬骨髓单个核细胞约占细胞总数的10^-4～10^-6，在LG-DMEM与选择性血清培养基上生长良好。犬骨髓间叶干细胞孵育24h即可见细胞贴壁生长，贴壁细胞约占接种单个核细胞总数的10^-6。犬骨髓间叶干细胞增殖分裂迅速，38～48h内增殖多个细胞，约72h即可增殖形成大的细胞克隆，7～1Od即可布满瓶底。细胞融合时类似成纤维细胞，呈纺锤状，细胞小而密集，螺旋梳状排列。连续培育10代以上，未见细胞形态、增殖特性发生改变。未见骨髓间叶干细胞自发分化其它类型细胞，仍维持原代培养细胞的增殖特性。犬骨髓间叶干细胞的表面标志SH2阳性，CD45则阴性。在化学诱导液的作用下，犬骨髓间叶干细胞能定向分化为心肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞等多种间叶组织类型细胞。结论 密度梯度分离法与贴壁筛选法能较好地进行犬骨髓间叶干细胞的体外分离、培养与扩增，犬骨髓间叶干细胞具备易于分离培养，巨大增殖潜力，独特细胞表型，多系分组能力等细胞生物学特性。为心肌梗死、心力衰竭与心律失常的细胞移植修复治疗提供了理想细胞材料。     

老龄兔骨髓间充质干细胞体外培养影响因素的研究

目的研究体外培养老龄兔骨髓间充质干细胞(MSCs)的影响因素。方法以密度梯度离心技术及贴壁筛选法相结合,在体外分离检测MSCs表面CD29、CD34、CD44、CD45的表达;诱导分化反向证明部分细胞可分化为成骨细胞及脂肪细胞,具有分化潜能,鉴定该细胞群为干细胞。细胞记数法计算MSCs倍增时间;观察供体自然老龄情况下,不同换液时间、不同血清浓度、不同种植密度等因素对MSCs生长的影响。结果MSCs CD29和CD44表达阳性,不表达造血干细胞标志CD34和CD45。高密度接种(3×106~4×106个/cm2),低浓度(8%~10%)血清的低糖DMEM培养,在体外可保持MSCs未分化增殖状态,并获得纯度较高同源性较好的干细胞群,高浓度血清(20%)并不加速细胞生长,而促进分化。结论MSCs具有体外多分化潜能,老龄供体骨髓中MSCs的生长、增殖特性受不同换液时间、不同血清浓度及不同种植密度等因素的影响。     

脱钙小牛骨与兔骨髓基质干细胞移植诱导兔脊柱融合的作用研究

目的探讨脱钙小牛骨(异种骨)与兔骨髓基质干细胞(BMSCs)的成骨作用。方法将36只兔随机分为3组各12只,分别进行兔椎体间融合。A组植入自体髂骨;B组单纯植入脱钙小牛骨(异种骨);C组预先取BM-SCs培养,植入脱钙小牛骨(异种骨)+BMSCs复合物。于术后4、8、16周行X线检查,观察骨缺损修复及骨塑形情况,骨痂标本行HE染色组织学观察,参照Lane-Sandhu X线评分标准及组织学评分标准,对各组椎间融合程度进行评分。结果术后16周,X线检查显示3组椎间骨痂连续,均获得椎间融合基本完成,放射学检查结果无统计学差异。术后4、8、16周时,A、C组与B组相比,各时间点上Lane-Sandhu组织学评分均有统计学差异(P均<0.05)。结论脱钙小牛骨本身缺乏成骨和骨诱导作用,单独进行椎体间融合作用有限。     

兔骨髓间充质干细胞体外成内皮细胞能力的研究

目的　探讨骨髓间充质干细胞体外扩增及其向内皮细胞定向分化能力。方法　无菌条件下采集兔骨髓 ,肝素抗凝 ,经淋巴细胞分层液密度梯度离心分离骨髓单个核细胞 ,通过贴壁培养法获得MSC ,然后在内皮细胞生长环境中进行诱导分化 ,最后对扩增的细胞特征进行鉴定 ,同时初步研究其体外成血管特性。结果　MSC每扩增一代 ,细胞数量增加 5～ 8倍 ,7.6 5× 10 3 个原代MSCs体外扩增 3代即获得 1.2 6× 10 8个细胞。在 70 %～80 %融合时呈现“铺路石”样形态 ,细胞免疫组化证实扩增细胞表达CD31和vonWillebrandfactor(vWF) ,具有吞噬ac LDL的功能 ,且扩增细胞在体外参与网状血管样结构形成。结论　MSC扩增能力强 ,在体外能诱导其向内皮细胞方向分化。     

兔外周血与骨髓源性内皮祖细胞培养鉴定及生物学特性的研究

目的:探索并建立兔内皮祖细胞(EPCs)的体外培养、鉴定方法。方法:采用密度梯度分离法分别从兔外周血和骨髓中分离出单个核细胞,接种于预包被明胶的培养瓶,并应用培养基(EBM-2)诱导培养,诱导分化为EPCs;在倒置显微镜下观察两种源性细胞生长过程;台盼蓝法测定细胞传代成活率;通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测比较两种源性获得的EPCs增殖情况;采用免疫荧光染色观察EPCs相关抗原CD34、CD31、CD133及vWF因子的表达。结果:两种源性EPCs均于培养3～4d完全贴壁,呈克隆样生长,7～9d形成类似成熟血管内皮细胞形态,细胞数量逐渐增多,细胞成活率均为95%。两种源性获得的第2代细胞生长曲线近似"s"形、MTT法显示3～5d细胞增殖较明显,外周血源性EPCs G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为96.48%和3.52%,骨髓源性EPCs G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为97.11%和1.84%。第2代EPCs进行免疫荧光鉴定结果显示:两种源性内皮祖细胞均阳性表达CD34、CD133、vWF因子,CD31弱阳性表达。结论:两种源性的EPCs均可高效获得且在体外稳定培养。与传统的骨髓源性EPCs相比较,从外周血源获得的EPCs是一种可靠、简便的培养方法,为组织工程学提供理想的细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及其生物学特性分析

目的探讨人骨髓间充质干细胞（MSC）的体外分离培养方法,并分析其生物学特性。方法无菌条件下抽取健康志愿者骨髓,采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中,用贴壁筛选法纯化获得MSC。相差显微镜下观察细胞形态学变化,细胞计数法绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面抗原及细胞周期。结果原代和传代培养的细胞呈梭形,具有较强的生长增殖能力。细胞表面CD90、CD105表达阳性,CD34、CD11b阴性。第1、3、5代MSC生长曲线呈S形,均经历潜伏期、对数生长期和平台期。第3代MSC中,G0/G1期细胞约占77.42%,S＋G2/M期细胞约占22.58%。结论采用密度梯度离心结合贴壁筛选培养法可获得纯度较高的MSC,且该细胞增殖活性较强。密度梯度离心结合贴壁筛选培养法是一种简单、有效的分离纯化MSC的方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及生物学特性

用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),体外培养传代扩增,观察细胞生长特性,对细胞进行免疫组化染色鉴定,电镜观察细胞形态。动态观察示培养细胞具有不断增殖的干细胞特性,并保持细胞活性。证实密度梯度离心结合贴壁法以及消化传代能有效分离纯化和扩增骨髓MSCs,培养的细胞具有骨髓MSCs的基本表型和特性。本研究可为临床进行细胞移植奠定基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的建立大鼠骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）体外分离、纯化及扩增的方法及对大鼠MSCs的生物学特性进行研究。方法采用贴壁筛选法分离大鼠MSCs，并通过不断传代进行纯化和扩增培养，检测大鼠MSCs生长周期，绘制细胞生长曲线。结果大鼠MSCs在体外分离培养扩增，大鼠MSCs形态呈长梭形，细胞周期显示第3代MSCs约有81．48％的细胞处于G0／G1期，细胞生长曲线呈S形。结论所建立的分离和培养方法获取的大鼠MSCs具有生物学特性。     

用单层培养法诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

骨髓间充质干细胞(MSCs)因其具有多向分化潜能，易于分离，且体外扩增能力强，便于自体移植的特点，近年来被认为是最有希望的种子细胞来源。2000年以来，我们在体外培养条件下采用单层培养方式分阶段研究MSCs这一分化机制，研究骨髓间充质干细胞向成软骨诱导的条件、分化模型及其相互关系，从而为气管、甲状软骨等组织工程重建提供种子细胞的可能性。     

兔骨髓间充质干细胞体外可定向诱导分化内皮祖细胞

以内皮前体细胞为代表的干细胞移植可促进血管新生、改善心肌灌注,但干细胞中内皮祖细胞(endothelial progentiorcell,EPC)含量极低,一定程度上影响其疗效。本文旨在通过观察骨髓间充质干细胞(m ensenchym al stem cell,MSC)在适当诱导条件下向EPC分化并进行体外扩增情况,为EPC移植进行基础研究。1材料和方法1.1材料3~5月龄日本大耳白兔10只(武汉大学医学院实验动物中心提供),体质量2.0~2.5 kg,雌雄不限。特级胎牛血清和DMEM培养基(Hyc lone公司),Percoll分离液、内皮细胞添加剂(ECGS)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞…     

Production of hematopoietic stem cell-chemotactic factor by bone marrow stromal cells

Chemotactic factors produced by stromal cells in the bone marrow are characterized. Two kinds of factors produced by stromal cell lines are identified using blind-well Boyden's Chambers; one is a neutrophil- chemotactic factor and the other a hematopoietic stem cell (HSC)- chemotactic factor. The latter attracts blastic cells in a low-density fraction, which are Thy1lo, wheat germ agglutinin (WGA)hi, H-2Khi, Ly-1- , Ly-2-, L3T4-, Ly5-, and slg-. The molecular weight of this HSC- chemotactic factor is estimated to be more than 200 kD. Putative cytokines and growth factors, such as granulocyte colony-stimulating factor (CSF), macrophage CSF, granulocyte-macrophage CSF, stem cell factor (SCF), interleukin (IL)-6, and IL-3, do not possess HSC- chemotactic activity. These findings strongly suggest that bone marrow stromal cells produce a new factor that attracts HSCs.     

脑瘫患者骨髓间充质干细胞体外培养特性分析

目的分析不同年龄脑瘫患者骨髓间充质干细胞(Human mesenchymal stem cells,hMSCs)体外增长速率及细胞的传代时间,为其临床应用提供参考。方法选取38例脑瘫患者,其中1～3岁11例(婴幼儿组)、4～6岁9例(学龄前组)、7～19岁10例(学龄组),20～35岁8例(成人组),使用离心贴壁法分离各组骨髓hMSCs,体外培养,保留贴壁细胞传代。观察各组hMSCs的P0及P1、P2、P3、P4代细胞传代时间;计算P0及P1、P2、P3、P4代细胞的增长速率。结果各组P0～P1、P1～P2传代时间相近,成人组P2～P3和P4～P5传代时间明显长于其余三组,各组P4～P5传代时间均明显长于P1～P2传代时间;成人组P0代和P1代细胞增长速率明显慢于其他三组,婴幼儿组和学龄前组P4代细胞增长速率明显慢于P1代细胞;各年龄组P4代细胞增长速率相近。结论脑瘫患者自体hMSCs是理想的种子细胞,且<20岁患者的hMSCs培养速度快,生长效率高。     

永生化骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的:探讨永生化骨髓问充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells.BMSCs)的生物学特性.方法:通过质粒pCMVSV40T/PUR导入大鼠BMSCs,建立永生化BMSCs.在倒置显微镜下观察细胞形态;采用检测碱性磷酸酶的活性,了解永生化BMSCs是否可分化为成骨细胞;采用裸鼠皮下接种实验检测细胞的致瘤性;应用不同血清浓度进行细胞培养及冻存,描绘其生长曲线及复苏后的活性.结果:未导入质粒的BMSCs培养至15代后细胞不能继续传代,呈明显衰老迹象,而永生化BMSCs培养至5代后仍可保持较好的活性,但具有明显接触抑制;永生化BMSCs具有分化为成骨细胞的能力:裸鼠接种后无致瘤性;与其他血清浓度相比,20%血清培养组的细胞生长速度较快;50%及90%血清组其复苏后较20%血清组活性高(P<0.05).结论:在体外,pCMVSV40T/PUR构建的永生化BMSCs具有活性较好等特性,且无成瘤性.可为BMSCs的研究及应用提供大量的细胞来源.     

白血病干细胞和骨髓基质细胞共培养的方法学探讨

目的 探讨白血病干细胞和骨髓基质细胞共培养的可行方法及扩增白血病干细胞的特点.方法 体外用两种方法共培养急性髓系白血病（AML）患者的骨髓单个核细胞（MNCs）：一种方法是将MNCs中的贴壁基质细胞单独培养,第2代或第3代基质细胞用丝裂霉素处理后做饲养层,再同悬浮造血细胞共培养;另一种方法是将MNCs持续培养即原代共培养.观察MNCs形态学特征、长期存活情况及增殖特性,用流式细胞仪检测分析细胞表面标志.结果 两种方法共培养的细胞部分可以长期存活,在共培养中有卵石样区域细胞及悬浮细胞团的形成.原代共培养的细胞所形成的卵石样区域数目多,排列规律.结论 两种方法都可以起到扩增白血病干细胞的作用.同经过丝裂霉素处理之后的饲养层相比,没有经过处理的骨髓基质细胞在共培养时能够更有效地扩增白血病干细胞.     

Human marrow stromal cells in short-term semi-solid bone marrow culture in aplastic anaemia

A short-term methylcellulose technique was used to study the proliferation of marrow-derived stromal, erythroid and myeloid colonies from normal controls and from patients with aplastic anaemia. There was a significant reduction in all colony types in patients with aplastic anaemia when compared with normal controls. In 4 patients who achieved remission following treatment with ATG + oxymetholone or with oxymetholone alone there was a return to normal range of stromal colonies and also of CFU-E. There was no change in the numbers of BFU-E's and only a slight increase in the numbers of CFU-C's.     

骨髓基质干细胞向肝细胞的定向分化及体内移植

目的:研究骨髓基质干细胞(BMSCs)在体外向肝细胞的定向分化和体内移植后对小鼠受损肝脏的修复作用.方法:在体外培养体系中用肝细胞提取液(HE)模拟体内肝脏微环境,诱导BMSCs向肝细胞定向分化,以免疫细胞化学和吲哚靛青绿(ICG)染色检测其分化程度.将5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的BMSCs移植入小鼠体内,免疫组织化学方法显示BMSCs在肝脏的分布,血清酶学检测肝脏受损小鼠移植后7,14,28d谷草转氨酶(AST,nkat/L)、谷丙转氨酶(ALT,nkat/L)和碱性磷酸酶(AKP,nkat/L)的含量变化.结果:在体外BMSCs可由HE诱导分化成肝细胞,但HE诱导组α1-抗胰蛋白酶(4d:52.5±3.9vs76.8±4.5,P<0.05;14d:60.3±6.1vs85.4±7.6,P<0.05;21d:80.5±8.0vs105.7±8.6,P<0.05)和白蛋白(4d:43.2±6.5vs71.6±7.6,P<0.05;14d:61.5±10.4vs93.6±13.9,P<0.05;21d:80.6±17.1vs128.3±22.2,P<0.05)表达量少于HGF诱导组;体内移植后BMSCs整合于肝实质内;肝脏受损小鼠移植BMSCs后,血清中ALT(7d:493.43±120.02vs696.81±140.03,P<0.01;14d:558.45±130.03vs780.16±151.7,P<0.01;28d:583.45±138.36vs880.18±170.53,P<0.01)、AST(7d:1521.97±186.7vs2342.14±208.38,P<0.01;14d:1590.32±200.04vs2692.21±238.38,P<0.01;28d:1625.33±208.38vs2872.24±281.72,P<0.01)和AKP(7d:1.24±0.22vs1.78±0.18,P<0.01;14d:1.21±0.21vs2±0.19,P<0.01;28d:1.32±0.19vs2.27±0.2,P<0.01)比损伤组小鼠相应值均有下降,但仍高于正常对照组.结论:BMSCs在体外可由HE诱导分化成肝细胞,在体内移植后可促进小鼠受损肝脏的修复.     

基质细胞衍生因子1对骨髓间充质干细胞的趋化作用

骨髓干细胞主要由造血干细胞和间充质干细胞组成,其中骨髓间充质干细胞除具有自我更新和多向分化的潜能外,更具有很强的可塑性,在一定的诱导条件下能向多细胞分化,且其相对容易获得,成为近年来研究的热点.许多体内外试验证实,细胞因子可以影响移植细胞的微环境,进而影响骨髓干细胞的动员、迁移及分化.基质细胞衍生因子1是一类对免疫细胞有趋化作用的小分子蛋白,属于CXC趋化因子之一,具有广泛的生物学活性,对骨髓干细胞亦有趋化作用,现就SDF-1对骨髓间充质干细胞的趋化作用作一综述.     

一种改良大鼠骨髓间充质干细胞培养方法

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离、改良培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法通过改良全骨髓贴壁法对4周龄SD雄性大鼠脱颈处死,无菌条件下分离出骨髓进行原代培养、消化传代培养及纯化。对BMSCs进行形态学观察,收获第四代BMSCs进行流式细胞仪检测其细胞表面标记物CD90、CD29、CD34、CD45的表达率及向成脂方向诱导分化。结果 BMSCs的原代培养形态学观察可见骨髓细胞接种于培养皿后,细胞呈圆型,大小不一,悬浮于培养液中。24 h后部分细胞开始贴壁,呈圆形、梭形或多角形。通过换液去除未贴壁的杂质细胞,可见短梭形、星形细胞分散贴壁生长,四五天可见放射状排列的细胞集落,伸出长短不一、粗细不均的突起,梭形细胞为主,胞浆丰富,胞核大、核仁清晰。7~8 d细胞呈集落生长,融合80%~90%,呈漩涡状,同向排列,9~10 d细胞排列紧密,逐渐融合成片。传代培养可见消化传代后,传代细胞24 h完全贴壁生长。细胞形态均一,呈梭形生长,细胞生长旺盛。四至五天可传代1次。可稳定连续传代7代以上,细胞形态及生长速度未见明显变化。BMSCs表面标记物的表达通过流式细胞仪检测结果显示,培养的第4代大鼠BMSCs均一表达CD90,CD29,阳性率分别为96.9%,96.6%;而CD34,CD45,呈阴性,阳性率分别为0.395%,7.56%。BMSCs加入成脂诱导剂后18 d,诱导而成的脂肪细胞累积脂质,脂滴变大,合并呈串珠状,经油红O染色呈鲜红色。结论与传统全骨髓贴壁法相比,改良后的全骨髓贴壁法操作步骤简单,降低离心对细胞的损害,减少了污染机会,节省经费,且分离的BMSCs细胞活性高,可大量分离、纯化、扩增,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。可为组织器官缺损性疾病、恶性肿瘤等的治疗和组织工程提供充足的种子细胞来源,具有重要的现实意义。