副溶血弧菌单克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法:用灭活的副溶血弧菌免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备副溶血弧菌mAb。用间接ELISA法对mAb的效价进行测定。结果:获得4株能稳定分泌副溶血弧菌mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1E3、5F12、5D8、6H9。经测定杂交瘤细胞腹水mAb效价分别为1×10-4～1×10-7。4株杂交瘤细胞系所分泌的mAb亚类分别是:IgG2b,IgG2a,IgG2b,IgG3。交叉反应试验显示,mAb 5D8与弧菌属其他几种细菌均不起反应,特异性强。副溶血弧菌生长抑制及动物保护实验结果表明4株mAb均能不同程度地抑制副溶血弧菌的生长并对动物具有保护作用,其中5F12保护效果最强。结论:成功地制备能稳定分泌副溶血弧菌mAb的杂交瘤细胞株,为建立该病的免疫学诊断及防治的奠定了基础。     

珠江河口外环境及海（水）产品副溶血弧菌研究

目的了解广州珠江河口地区不同生态环境中副溶血弧菌（Vp）的分布情况,为Vp型污染防控提供可靠的依据。方法根据广州珠江河口地区水网主要特征进行监测,定量分析按照GB/T4789-2003中的方法进行;阳性菌株采用荧光定量PCR法进行毒力基因的检测。结果外环境及海水产品Vp总阳性率为34.10%（671/1968）;水产品的阳性率为47.50%（114/240）,水体总阳性率为27.27%（373/1368）,淤泥和水草等环境样本的阳性率为51.11%（184/360）,大部分（118/120）不携带毒力基因。外环境Vp检出率与水体深度、潮汐、水温、pH、盐度等有关。结论广州珠江河口地区海（水）产品、海水等外环境中Vp污染严重,其中以贝壳类海产品最高,海水中污染率高于其他环境水体。     

副溶血弧菌TDH单克隆抗体的研制与性质鉴定

目的:制备副溶血弧菌耐热直接溶血毒素TDH单克隆抗体,并分析其免疫学特性。方法:用纯化的TDH毒素蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法进行阳性细胞筛选,有限稀释法进行亚克隆。并对该单克隆抗体进行了分子量大小、效价、亚类、特异性和亲和力分析。结果:筛选出一株能够稳定分泌TDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为T9H4,其免疫球蛋白亚型鉴定为IgG1,亲和力常数可达2.19×109L/mol,并表现出较强的特异性。抗体纯化后效价达1∶1 024 000,SDS-PAGE电泳结果显示单抗蛋白重链分子量约为50 kD和轻链23 kD。结论:成功获得一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,为开发免疫学快速检测方法提供重要实验基础。     

2000年-2004年杭州地区副溶血弧菌分离株的PFGE和RAPD分型

应用脉冲场凝胶电泳（pulse field gel electrophoresis,PFGE）及随机放大多态性DNA分析（random amplified polymorphicDNA analysis,RAPD）方法对2000年-2004年在杭州地区分离的03：K6型和O4：K8型致病性副溶血弧菌菌株进行分子分型,探讨近年杭州地区分离的O3：K6型和O4：K8型副溶血弧菌菌株与国际“大流行”O3：K6型菌株间的关系.     

检测副溶血弧菌TDH斑点免疫胶体金渗滤法的研究

目的:制备特异性检测副溶血弧菌TDH的斑点免疫胶体金渗滤测试盒(Dot immunogold filtration assay,DIG-FA)。方法:T6D4和T9H4两株抗体分别标记于金颗粒和点样于硝酸纤维素膜,通过双抗体夹心法来开发斑点免疫胶体金渗滤测试盒,并对测试盒的特异性、重复性、稳定性做了分析。结果:研制的斑点免疫胶体金渗滤测试盒能够特异性检测副溶血弧菌TDH,其最低检测限达到250 ng/ml TDH,该测试盒在4℃恒温条件下保存12周后仍表现出准确和稳定的检测结果。结论:成功制备了检测副溶血弧菌TDH的斑点免疫胶体金渗滤测试盒,对现场快速检测TDH提供了可靠的测试工具。     

双重实时PCR快速同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌

目的建立改良分子信标双重实时PCR同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌的快速方法,应用于霍乱监测、副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验。方法根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctxA)和副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因(TDH)的保守序列,分别设计引物和改良分子信标探针,以10种细菌作对照,建立双重实时PCR改良分子信标检测体系,应用于副溶血弧菌食物中毒快速诊断和霍乱监测。结果改良分子信标双重实时PCR反应体系DNA灵敏度为102.4～166.6fgμl,菌液灵敏度为32～64CFUml或3～6CFUPCR反应体系,无交叉反应。此反应体系同时检测40株副溶血弧菌和50株霍乱弧菌,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰。对3起细菌性食物中毒共48份样品和100份海产品进行检测,9份副溶血弧菌实时PCR阳性,其中7份副溶血弧菌细菌培养阳性,其余样品都为阴性。从样品处理到检测结果仅需1天时间。结论改良分子信标双重实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于霍乱和副溶血弧菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

2005—2007年广州地区腹泻儿童感染轮状病毒情况分析

目的了解近3年来广州地区儿童肠道轮状病毒感染情况。方法收集2005年1月至2007年12月收治的包括门诊和住院的急性腹泻患儿的大便标本,采用免疫胶体金技术对标本进行轮状病毒抗原检测。结果轮状病毒2005、2006和2007年平均感染率分别为44．70％、38．22％和39．99％;与2006、2007年相比,2005年轮状病毒感染高峰和波谷均向后推延1个月。抗原检测阳性例数在6～24个月婴幼儿最高,全年感染率在性别上差异无统计学意义。结论轮状病毒是引起婴幼儿病毒感染性腹泻的主要病原体,气候可能对广州地区轮状病毒感染有较大影响。     

无锡市2009年副溶血性弧菌脉冲场凝胶电泳分型研究

目的分析无锡市2009年副溶血性弧菌分子特征,以及细菌性食物中毒分离的菌株与菌株之间、食源性疾病监测分离的副溶血性弧菌之间的遗传相关性,建立无锡地区副溶血性弧菌分子分型数据库,为无锡市进行食源性疾病的快速反应和预警、监测和控制提供科学依据。方法脉冲场凝胶电泳（PFGE）对菌株进行分子分型,所得结果以BioNumericsV4.0软件UPGMA方法进行聚类分析。结果 21株菌以SfiⅠ酶切后可分为9个PFGE型别,各群间相似性系数〉60%。其中有两起食物中毒菌株DNA指纹图谱完全相同,食源性疾病监测分离株分属7个型别。3型和6型为全年的优势型别。结论 3型和6型为无锡市2009年副溶血性弧菌优势型别,需加强防范。     

2007-2010年河北省卢龙县婴幼儿腹泻患者A组轮状病毒感染监测

目的 了解河北省婴幼儿腹泻患者轮状病毒的感染特点及基因型别的变迁情况.方法 2007 -2010年在河北卢龙县医院和卢龙县妇幼保健院收集5岁以下腹泻住院病例1643例的粪便标本,采用酶联免疫吸附试验( ELISA)检测轮状病毒抗原,阳性标本用多重反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进行基因分型.结果 1643例标本中8...     

2007—2010年河北省卢龙县婴幼儿腹泻患者A组轮状病毒感染监测

目的了解河北省婴幼儿腹泻患者轮状病毒的感染特点及基因型别的变迁情况。方法2007—2010年在河北卢龙县医院和卢龙县妇幼保健院收集5岁以下腹泻住院病例1643例的粪便标本，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测轮状病毒抗原，阳性标本用多重反转录．聚合酶链反应（RT-PCR）进行基因分型。结果1643例标本中801例轮状病毒抗原阳性，阳性率为48．75％。对轮状病毒抗原阳性标本进行G／P分型，2007—2010年G3型所占比例波动于48．59％-69．92％，G1型由2007年的10．59％下降至2010年的5．79％，G9型则由2007年的2．12％上升至2010年的19．74％。P分型以P[8]最为常见，G／P组合以G3P[8]为主。结论轮状病毒是婴幼儿腹泻的主要病原，G3P[8]为河北省主要流行株，G9型有上升趋势。     

广东地区副溶血性弧菌暴发分离优势血清型菌株的分子特征

目的 研究广东地区多宗副溶血性弧菌暴发分离的优势血清型(O3:K6、O1:Kut、O4:K8)株的毒素基因携带情况、“大流行群”株分布特征以及不同血清型株之间的相关性.方法 对2008-2010年23起副溶血性弧菌暴发患者临床样本和当餐食品分离的62株优势血清型进行tdh、trh基因检测及“大流行群”鉴定(GS-PCR...     

Isolation and characterization of pathogenic Vibrio parahaemolyticus from diseased post-larvae of abalone Haliotis diversicolor supertexta

Mass mortality among the post-larvae of cultured abalone Haliotis diversicolor supertexta has occurred on the south coast of China since 2002. The diseased abalone are generally 10 to 30 days old, and typical signs of the disease include them turning white in colour and falling off the diatom films on which they were cultured. Among sixteen different motile bacteria isolated from the diseased post-larvae, four were identified as Vibrio parahaemolyticus on the basis of biochemical characteristics when compared with those of a V. parahaemolyticus type strain ATCC 17802(T). Isolate 25, a representative isolate of V. parahaemolyticus recovered from diseased abalone, was virulent for the post-larvae with an LD(50) value of 3.5 x 10(5) CFU (colony forming units)/ml. All moribund post-larvae artificially infected with the bacterium turned white and fell off the diatom films on which they were cultured as seen to occur during natural outbreaks of the disease, and it was possible to recover the bacterium from artificially infected post-larvae. The results of the study indicate that V. parahaemolyticus is a pathogenic bacterium to abalone post-larvae.     

副溶血性弧菌直接溶血毒素基因的原核表达及产物的性质

目的 实现副溶血性弧菌直接溶血毒素tdh基因在大肠杆菌中的表达,鉴定表达产物在生物学活性和免疫原性。方法 构建tdh基因的原核表达系统NWⅡ（tdh/Trc99A/JM109),并在30℃条件下,用0.8mmol/L IPTG诱导表达。用SDS－PAGE分析蛋白表达;溶血试验检测表达蛋白的溶血活性。将表达产物腹腔注射免疫兔,用试管凝集反应试验检测特异性抗体。用溶血抑制试验检测该抗体体外对TDH溶血活性的抑制作用。结果 NWⅡ在上述条件下诱导后,TDH呈可溶性、融合性表达。SDS－PAGE表明,表达蛋白的相对分子质量（Mr)约23000。薄层扫描显示,细菌的周质腔中的蛋白量最高,占总蛋白的13．4％。溶血试验表明,表达的蛋白具有溶血活性。用表达蛋白免疫兔产生的相应抗体,在体外具有抑制TDH溶血活性的作用。结论 tdh基因在原核表达系统Trc99A/JM109中获得成功表达,为基因工程大规模制备TDH抗原,制备抗TDH的多克隆和／或单克隆抗体,构建基因工程菌苗,阐明该菌的致病机制打下了基础。     

食物中毒中分离的副溶血性弧菌的分子分型研究

目的运用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术研究深圳市罗湖区2005-2007年食物中毒事件中分离获得的49株副溶血性弧菌的分子流行情况。方法样品采用荧光PCR与传统分离培养同时检测,对分离获得的副溶血性弧菌阳性菌株进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）,BioNumerics软件对图谱进行聚类分析。结果 49株副溶血性弧菌中,有12株不能分型,其余36株副溶血性弧菌分离株大致可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个群,相同血清型的菌株其PFGE型大致相同,同一起食物中毒的菌株间有较高的相关性。结论罗湖区副溶血性弧菌食物中毒存在流行克隆株,PFGE分子分型技术在食物中毒追踪溯源方面有重要提示性作用。