幽门螺杆菌多表位重组原核表达工程菌的构建及表达特性研究

目的 构建含有幽门螺杆菌尿素酶（UreI、UreB）及粘附素（HpaA）的多表位原核表达质粒pET28a(+)/ureI-ureB-hpaA〔pET28a(+)/IBA〕及相应的原核表达工程菌,研究其表达特性。 方法 通过生物信息学方法从ureI 、ureB和 hpaA基因中筛选T细胞和B细胞优势表位基因序列,人工合成并构建原核重组表达质粒pET28a(+)/IBA。经限制性内切酶（Nde Ⅰ,Xho Ⅰ）酶切鉴定及DNA测序鉴定后导入大肠杆菌BL21 (DE3) 。该工程菌经IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测重组蛋白（rIBA）的表达情况,以抗幽门螺杆菌悉尼株（SS1株）特异卵黄抗体采用Western blot检测rIBA的抗原性。 结果 构建的多表位原核表达质粒pET28a(+)/IBA双酶切和测序鉴定与设计序列100%一致。工程菌经 IPTG 诱导后SDS-PAGE电泳显示在相对分子质量40×10 ³左右有一条明显蛋白条带,Western blot显示有相应位置特异反应条带。 结论 成功构建幽门螺杆菌多表位重组原核表达质粒pET28a(+)/IBA及相应原核表达工程菌,该工程菌表达的rIBA具有抗原性,表明该重组蛋白与幽门螺杆菌有高度相关性。     

幽门螺杆菌双基因多表位重组原核表达工程菌的构建及其表达特性的研究

目的构建含幽门螺杆菌尿素酶保守基因序列ureI和ureB的双基因（简称IB）多表位原核表达质粒以及原核表达T程菌,并研究其微生物学特性。方法通过生物信息学方法从ureI和ureB基凶中筛选T细胞和B细胞优势表位基因序列,人工合成所选择的表位基因序列并构建原核重组表达质粒pET28a（＋）／IB。经限制性内切酶（EcoR I,XhoI）鉴定及DNA测序鉴定后,将重组质粒导人大肠杆菌BL21（DE3）。该工程菌经IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测重组蛋白（riB）的表达情况,用Westernblot检测riB的免疫反应性。结果构建的双基因多表位基因序列与所设计的一致;工程菌经IPTG诱导后做SDS-PAGE电泳显示,在28kD左右有一条明显蛋白条带,Westernblot结果显示在28kD左右出现特异反应条带。结论成功构建含ureI和ureB双基因序列的原核表达质粒pET28a（＋）／IB及工程菌,该工程菌表达的重组蛋白riB能被抗幽门螺杆菌悉尼株（H．pylori SSl）的特异抗体所识别,表明该新重组蛋白与幽门螺杆菌有高度相关性。     

幽门螺杆菌BIB原核表达工程菌的构建及微生物学特性分析

目的构建融合了幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白（Ure I）、尿素酶B亚单位（UreB）的表位基因及霍乱毒素B亚单位（CTB）的原核表达质粒pET28a（＋）／ct B／ure I-B（简称BIB）及其原核表达工程菌,并研究其生物学特性。方法参考基因库中ure l、ure B、ct B的基因序列,合成不舍信号肽的ct B基因及ure I、ure B优势表位基因,串联融合,形成多靶点重组ct B／ure I-B基因（简称BIB基因）,并构建pET28a（＋）／BIB原核表达质粒,经限制性内切酶Nco I、Xho I酶切以及DNA测序鉴定正确后,将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）中,构建含BIB基因的原核表达工程菌。经乳糖诱导后,SDS-PAOE电泳检测重组蛋白（rBIB）,Western blot及肌注BALB／c小鼠实验检测rBIB的免疫反应性和免疫原型。结果构建的原核表达质粒pET28a（＋）／BIB,经双酶切和测序分析显示,构建的BIB基因与设计序列100％一致。乳糖诱导后,SDS-PAGE电泳显示在33kD左右出现一条明显蛋白条带,Western blot检测在33kD左右出现特异反应条带,肌注免疫BALB／c小鼠产生了较高的抗体水平。结论成功构建了pET28a（＋）／BIB原核表达质粒及BIB原核表达工程菌,该工程菌可表达重组蛋白rBIB,且该重组蛋白具有良好的免疫反应性及免疫原性。     

幽门螺杆菌尿素膜通道基因的克隆和表达

目的 克隆幽门螺杆菌(Hp)尿素膜通道基因(ureI)和构建能表达UreI蛋白的原核表达工程菌,并初步研究产物的表达特性和免疫特性.方法 用PCR方法从Hp基因组中克隆ureI基因,构建原核表达重组质粒pET32a/ureI,双酶切和测序鉴定正确后,重组质粒转染大肠杆菌BL21 (DE3),构建高效表达UreI的工程菌BL21 /UreI.不同温度条件下用1.0 mmol/LIPTG诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Gel-Pro Analyzer 4分析重组蛋白的表达,并用Western blotting对其免疫原性进行分析.结果 克隆到约650 bp的基因片段,测序结果与GENBANK中对应菌株的ureI序列100%同源,与其他Hp的序列同源性不低于98.5%.工程菌BL21 /UreI含完整的ureI基因.在37℃、1.0 mmo1/LIPTG诱导14 h后,重组蛋白表达量可达菌体总蛋白的20.2%.分析表明重组蛋白主要以包涵体形式表达,经免疫印迹证实该重组蛋白有一定的免疫反应性和特异性.结论 成功构建了Hp ureI基因的原核表达载体,该载体可高表达有免疫特性的重组蛋白,为进一步研究Hp在胃的定植机制和抗Hp新药奠定了基础.     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI基因真核表达载体的构建及表达

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(ureI)的真核表达重组载体,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的研制奠定基础。方法以H.pyloriSS1株基因组为模板,PCR扩增ureI目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;通过酶切、PCR及测序鉴定,筛选阳性重组载体;脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,Western blot检测其在HeLa细胞中的表达。结果以H.pyloriSS1株基因组DNA为模板扩增出特异的ureI基因片段,大小约585 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论成功构建了真核重组载体pcDNA3.1(+)/ureI,并能在HeLa细胞中表达。     

脑源性神经营养因子原核表达载体的构建及其生物学活性分析

目的：构建含有脑源性神经营养因子（BDNF）的原核表达质粒pET28a（＋）／BDNF及相应的原核表达菌,经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后研究其生物学活性。方法按照大肠杆菌BL21（DE3）的密码子偏好性进行密码子优化,人工合成大鼠BDNF的基因序列并构建原核表达质粒pET28a（＋）／BDNF。经限制性内切酶（Bam HI ,Hind Ⅲ）酶切鉴定及DNA测序鉴定后导入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,用SDS‐PAGE检测重组蛋白的表达情况,以BDNF特异性抗体采用Western blot法鉴定BDNF蛋白抗原性,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测BDNF蛋白对 PC12细胞活力的影响。结果构建的pET28a（＋）／BDNF经双酶切和测序鉴定与设计序列100％一致;工程菌经IPTG诱导后在相对分子质量17×103左右有1条明显蛋白条带,Western blot显示目的蛋白能够与特异性BDNF抗体反应;不同浓度BDNF蛋白处理组与对照组比较细胞活力均有不同程度的增加,其中50 ng／mL BDNF处理组效果最优。结论成功构建原核表达质粒pET28a（＋）／BDNF及相应的原核表达菌,该工程菌表达的BDNF蛋白具有良好的生物学活性。     

重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位及其生物学性质

目的 基因重组人幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)并分析重组蛋白的生物学性质。方法 采用PCR从我国临床分离的Hp菌株中克隆UreB基因，并通过DNA重组技术构建非融合表达UreB的重组质粒pET-11C-UreB，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达。结果 重组UreB在大肠杆菌中表达，相对分子质量约62000，表达率26％。N端15个氨基酸序列为MKKISRKEYVSMYGP，肽图及氨基酸组成成分分析结果与理论预测值吻合。以重组UreB免疫BalB／c小鼠，能产生抗UreB抗体。ELISA及Western blotting分析显示，重组UreB具有良好的免疫原性和反应性，表现出与天然Hp UrcB相似的生物学功能。结论 为重组UreB作为Hp亚单位疫苗成分奠定了免疫学基础。     

重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位及其生物学性质

目的基因重组人幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)并分析重组蛋白的生物学性质。方法采用PCR从我国临床分离的Hp菌株中克隆UreB基因,并通过DNA重组技术构建非融合表达UreB的重组质粒pET-11C-UreB,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。结果重组UreB在大肠杆菌中表达,相对分子质量约62 000,表达率26%,N端15个氨基酸序列为MKKISRKEYVSMYGP,肽图及氨基酸组成成分分析结果与理论预测值吻合。以重组UreB免疫BalB/c小鼠,能产生抗UreB抗体。ELISA及Western blotting分析显示,重组UreB具有良好的免疫原性和反应性,表现出与天然Hp UreB相似的生物学功能。结论为重组UreB作为Hp亚单位疫苗成分奠定了免疫学基础。     

赖氨酰氧化酶基因原核表达克隆的构建

目的 克隆编码人赖氨酰氧化酶(hLOX)的基因片段,并构建含有该基因的重组原核表达质粒,为制备基因工程化的重组hLOX奠定基础.方法 从人皮肤成纤维细胞中抽提RNA,通过RT-PCR扩增LOX编码序列(750bp),所得目的 基因插入原核表达载体质粒pET28a,转化大肠杆菌DH5a.重组质粒pET28a-hLOX经双酶切和核苷酸序列分析鉴定.结果 载体质粒pET28a中插入的基因片段与hLOX基因序列完全相同.结论 成功构建含有人LOX基因的重组表达质粒.     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位融合表达载体的构建及应用

目的 构建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的融合表达载体。方法 PCR扩增LTB基因，并在其3’端去掉终止密码子，引入编码TAPI接头，通过EcoRI和EcoRV酶切位点重组于Pinpoint Xa—I载体上，将幽门螺杆菌尿素酶B亚单位与之融合，转化E．coli JM109，SDS-PAGE及Western blolling分析其表达。结果 成功构建了LTB融合表达质粒，并获得了幽门螺杆菌尿素酶B亚单位与之融合表达。结论 LTB融合表达载体的成功构建为研究分子内佐剂疫苗奠定了实验基础。     

Oral immunization of mice with vaccine of attenuated Salmonella typhimurium expressing Helicobacter pylori urease B subunit

Objective To prepare the live recombinant vaccine of attenuated Salmonella typhimurium SL3261 expressing Helicobacterpylori （H. pylori） B subunit （UreB） and to determine whether it could be used as an oral vaccine against H. pylori infection. Methods Using genomic DNA of H. pylori Sydney strain （SS1） as template, the H. pylori UreB gene fragment was amplified by PCR and subcloned into the expression vector pTC01. The recombinant plasmid pTC01-UreB was then transferred into LBS000 to obtain modified forms, and further conversed into the attenuated Salmonella typhimurium SL3261 to obtain recombinant SL3261/pCT01-UreB as an oral immunization reagent, which was then used to orally immunize Balb/c mice twice at a three-week interval. Twelve weeks later, anti-UreB IgA antibodies in intestinal fluid and IgG antibodies in sera were determined by ELISA. The relating data in control groups （including body weight, gastric inflammation, etc.） were also collected. Results The sequencing analysis showed that the UreB gene fragment amplified by PCR was consistent with the sequence of the H. pylori UreB gene. The restriction enzyme digestion revealed that the correct pTC01-UreB was obtained. SDS-PAGE and Western blot showed that a 61KD protein was expressed in SL3261/pTC01-UreB, which could be recognized by anti-H, pylori UreB antiserum and was absent in the control containing only Salmonella typhimurium SL3261 strain. The multiple oral immunization with SL3261/pTC01-UreB could significantly induce H. pylori specific mucosal IgA response as well as serum IgG responses. IFN-T and IL-10 levels were significantly increased in SL3261/pTC01-UreB group, and no obvious side effect and change in gastric inflammation were observed. Conclusion The attenuated vaccine of Salmonella typhimurium expressing H. pylori UreB can be used as an oral vaccine against H. pylori infection.     

幽门螺杆菌多靶点疫苗工程菌BIB发酵及纯化工艺研究

目的初步建立重组幽门螺杆菌多靶点疫苗工程菌（BIB）的高密度发酵及其蛋白纯化工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,放大工艺至50L发酵罐中,对影响目的蛋白收率的因素如发酵培养基、工作种子接种量、诱导剂浓度、诱导起始时间、诱导持续时间及诱导剂添加方式等进行优化验证;并利用rBIB蛋白高等电点特性（pI=9.05）,在pH 7.0-7.5的磷酸盐缓冲液中目的蛋白带正电荷,采用阳离子交换层析进行纯化,对阳离子交换层析填料及纯化缓冲液的pH进行优化。结果经高密度发酵后BIB菌体产量为70g/L,蛋白表达量为32%;rBIB蛋白经阳离子交换层析纯化后其纯度为91.8%。结论该工艺的初步建立为深入研究rBIB蛋白性质及其规模化生产奠定了基础。     

幽门螺杆菌尿素酶B基因的克隆、表达及其抗原性的鉴定

目的构建含人幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)尿素酶B(UreaseB,UreB)编码基因的重组质粒,测定、分析其核苷酸序列,并在E.coliTop10中表达,研究其抗原性。方法应用PCR技术从HpDNA染色体中扩增UreB编码基因片段,将其T-A克隆和测序,并与GenBank公布的其它Hp菌株基因序列比较,再将目的基因克隆至表达载体pGEX-4T-1中进行表达,用GST亲和层析对其进行纯化,纯化产物用于对29株小鼠抗Hp-全菌单克隆抗体(mAb)的鉴定及与Hp感染患者血清进行Westernblot。结果扩增的UreB基因全长1704bp,并在GenBank上登录(No.DQ141576),与GenBank公布的其它Hp菌株的核酸同源性为97%～99%,表达的UreB融合蛋白的相对分子量为91000。29株小鼠抗Hp-全菌mAb中有6株是针对UreB抗原的,纯化产物可被病人血清和抗UreB的鼠单克隆抗体识别。结论重组UreB具有较好的抗原性,为Hp检测诊断和疫苗的研究奠定了基础。     

霍乱毒素B亚单位基因的克隆和表达

用DNA重组技术构建CT-B表达性质粒pXB1及进一步修饰的pXB2,使CT-B基因在大肠杆菌中得到较高水平的表达(280～350ng/ml),且有71.5％分泌率。表达动力学研究阐明,克隆子培养24h产物收率较高。一定浓度的Mg~(2+)、L-组氨酸和天冬酰胺能刺激CT-B的表达。GM1-ELISA、CHO细胞测毒结合间接免疫荧光检测和家兔肠段结扎试验证实,表达的CT-B能与游离的或活细胞膜上的GM1受体结合,但无细胞和肠段毒性。这种细胞测毒结合免疫荧光序贯试验,为客观证实CT-B的生物学活性开拓了新途径。     

幽门螺杆菌尿素酶B基因的限制性片段长度多态性分型和生物信息学分析

目的：对不同来源野生型幽门螺杆菌（Hp）菌株的尿素酶B基因进行限制性片段长度多态性（RFLP）分型和生物信息学分析。方法：采用HaeⅢ单酶切法对国内临床分离的Hp菌株、动物模型适应株及国际标准Hp菌株尿素酶B（ureB）基因进行RFLP分型，同时进行基因测序和序列同源性对比及进化树分析等生物信息学研究。结果：HaeⅢ单酶切结果显示，14株Hp 1．7kb ureB基因均呈现出2～5种带型，可分为五组，其中两种国际标准株NCTC11637、NCTC11639和三种临床分离野生株拥有相同的RFLP带型，其他国内临床分离株和动物适应株分属于四种不同的RFLP带型组。ureB基因序列同源性比对表明，各种Hp菌株间核苷酸序列同源性均〉96．6％，氨基酸序列同源性均〉98％，其中CCS9801、CCS9806、M3及M10菌株之间的核苷酸和氨基酸序列同源性为100％。核苷酸序列进化树分析显示，2株国际标准株与国内临床分离株及动物适应株分处于不同进化分支，为平行进化关系；而在氨基酸序列进化树中转变为非平行关系。结论：不同Hp菌株尿素酶B在基因和蛋白质水平均高度保守和同源。     

Humanin抑制NR1亚基表达和NR2B亚基磷酸化的神经保护作用

目的：探讨Humanin （HN）通过抑制N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体NR1亚基的表达和NR2B亚基的磷酸化在兴奋性神经毒中发挥的保护作用,并阐明其可能的作用机制。方法：利用原代培养的Wistar大鼠皮层神经元建立NMDA诱导的兴奋性神经毒模型,将神经元分为对照组、NMDA组、NMDA+MK-801（MK-801）组和NMDA+HN（HN）
组。流式细胞术荧光定量检测各组神经元膜NMDA受体NR1亚基蛋白的表达,Western blotting法检测各组神经元膜NMDA受体NR2B亚基Tyr1472位点的磷酸化水平。结果： 倒置相差显微镜观察,NMDA组中的神经元胞体肿胀,个别细胞变成圆形,胞体周围光晕模糊,神经元突起大部分消失,表现出明显的神经毒性作用。流式细胞术免疫荧光定量检测,与对照组比较,NMDA组NR1亚基蛋白的平均荧光强度值明显增加（P<0.05）;与NMDA组比较,MK-801组和HN组的NR1亚基蛋白的平均荧光强度值明显降低（P<0.05）。Western blotting法检测,各组神经元的NR2B亚基总蛋白的表达水平无改变;与对照组比较,NMDA组NR2B亚基蛋白Tyr1472位点的磷酸化水平明显升高（P<0.05）;与NMDA组比较,MK-801组和HN组均能降低NR2B亚基蛋白Tyr1472位点的磷酸化水平（P<0.05）。 结论： NMDA受体NR1亚基蛋白表达水平的增加和NR2亚基磷酸化可能参与NMDA诱导的兴奋性神经毒作用;HN可能通过抑制NR1亚基的表达和NR2B亚基的磷酸化而发挥对神经元的保护作用。     

小剂量右美托咪定缓解大鼠慢性疼痛相关抑郁样行为及对前额叶皮质N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基的影响

目的 观察小剂量右美托咪定对慢性疼痛大鼠抑郁样行为及前额叶皮质（PFC）N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基（NR2B）的影响。方法 将22只成年大鼠随机分为假手术组（Sham组,n=6）、保留性神经损伤组（SNI组,n=6）、保留性神经损伤+生理盐水组（SNI+NS组,n=5）和保留性神经损伤+右美托咪定组（SNI+DEX组,n=5）。SNI+NS组及SNI+DEX组在建模后第8~14天腹腔注射等体积生理盐水或小剂量DEX（20 μg/kg）。采用von Frey纤维评估大鼠疼痛缩足阈值（PWT）,强迫游泳实验（FST）评估大鼠抑郁样行为,蛋白质印迹法检测大鼠PFC中NR2B蛋白的表达。结果 与Sham组相比,SNI组大鼠术后第1、3、7、14天PWT降低,术后第15天FST中右腿不动时间延长、PFC中NR2B蛋白表达降低,差异均有统计学意义（P<0.01,P<0.01,P<0.05）。与SNI+NS组相比,SNI+DEX组大鼠术后第1~14天PWT无明显变化（P>0.05）,术后第15天FST中右腿不动时间缩短、PFC中NR2B蛋白表达增加（P<0.01、P<0.05）。结论 腹腔内注射小剂量DEX可缓解大鼠慢性疼痛相关的抑郁样行为,其机制可能与PFC中NR2B蛋白的增加有关。     

中枢NMDA受体NR2B亚单位与神经病理性疼痛的研究现状

中枢神经系统N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体在病理性疼痛的发生和发展中起着重要作用。近年来研究发现中枢神经系统中NMDA受体NR2B亚基与神经病理性疼痛的关系尤为密切。NR2B在疼痛的产生、中枢性痛觉敏感化形成和疼痛治疗中有着深刻的意义。本文就NR2B与神经病理性疼痛的研究现状进行综述。