大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养纯化及冻存

目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养及冻存的方法。方法:用密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs,并对其形态学特征进行观察,比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况。大鼠MSCs在12.5%二甲亚砜(DMSO)保护下放入液氮冻存,6个月后复苏,测其成活率及观察生长增殖情况。结果:用密度梯度离心法及贴壁培养法均能有效地分离大鼠骨髓MSCs,细胞活力好,增殖能力强。大鼠MSCs可用液氮保存,且复苏后细胞生长增殖旺盛,形态无明显的变化。结论:采用密度梯度离心法及贴壁培养法成功地建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系;采用液氮冻存大鼠MSCs的方法十分有效可行。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景：目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法。目的：联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2007-10／2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成。材料：2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养，1．073kg／L的Percoll分离液。方法：实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞，在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后，经贴壁培养及反复换液纯化骨髓间充质干细胞。分别取第3，5，7，9代骨髓间充质干细胞，行细胞计数，绘制细胞生长曲线。主要观察指标：倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况。采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。CD44染色呈阳性，CD34染色呈阴性，说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞。结果：增殖传代的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。随传代次数的增加，细胞增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论：在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞。     

全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞:与密度梯度离心法的比较

背景:目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法;密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想.目的:在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法.方法:全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度.结果与结论:全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高.     

不同冻存时间与温度对兔骨髓基质干细胞存活率的影响

目的：以二甲基亚砜作为保护剂，采用慢冻快融法观察不同温度及不同时间冻存的免骨髓基质干细胞复苏后存活率的变化。 方法：实验于2003-09／2005—06在浙江省医学科学院生物工程所完成。①选取清洁级3月龄新西兰大白兔5只，抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液，密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化出兔骨髓基质干细胞，并进行增殖。②取第3代骨髓基质干细胞，经消化后离心重悬，用完全培养液调整细胞浓度为6&;#215;10^9L^-1。将质量浓度为250g／L的二甲基亚砜缓慢滴入同体积含骨髓基质干细胞的上述培养液中，混匀，二甲基亚砜的终浓度为125g／L，骨髓基质干细胞的终密度为3&;#215;10^9 L^-1，1mL／安瓿冻存。③4℃冻存直接将安瓿置4℃冰箱中；-20℃及-60℃冻存，则将安瓿置于有脱脂棉的聚丙烯泡沫盒中，壁厚1．5cm，扎紧密封，各置-20℃及-60℃冰箱过夜，取出后分别直接放于-20℃及—60℃冰箱保存；-196℃液氮冻存，则将置有安瓿的泡沫盒于-60℃冰箱过夜后，取出冻存安瓿直接放于液氮中保存。骨髓基质干细胞分别于4℃、-20℃、-60℃、-196℃条件下进行3d，10d，1，3，8个月以及1年的冻存。④经不同温度及不同时间冻存后，给予复苏。复苏时将冻存安瓿从液氮或冰箱中取出，立即置37℃水浴并轻轻摇动，约1min迅速解冻。含骨髓基质干细胞的冻存液经5倍于冻存液量的完全培养液稀释后，离心重悬，进行骨髓基质干细胞存活率测定。复苏后的骨髓基质干细胞以1&;#215;10^4／cm^2用完全培养液再培养，观察骨髓基质干细胞的形态变化及生长活性情况。结果：实验选取3月龄新西兰大白兔5只，全部进入结果分析。①兔骨髓基质干细胞原代培养情况：培养3d时，骨髓基质干细胞数量较少，散在分布，呈短梭形形态。培养1周时细胞形成大量的小集落，细胞变长。此后集落细胞迅速增多，逐渐汇合成片，形态为均一的长梭形，呈旋涡状排列，2周时细胞长成单层。②兔骨髓基质干细胞传代培养情况：刚传代的骨髓基质干细胞呈圆形，数小时后迅速贴壁，重新成为梭形。之后细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养更均一，细胞生长旺盛、增殖迅速。连续传代22代无明显变化。但随传代次数增多，细胞形态出现多样性，逐渐呈老化现象。③不同温度不同冻存时间下复苏后的兔骨髓基质干细胞存活率的比较：兔骨髓基质干细胞液氮保存1年，存活率为79％；-60℃保存1，3，8个月的存活率分别为67％，38％和0％；不宜于4℃及-20℃保存。（少复苏后的骨髓基质干细胞再培养情况：复苏后的骨髓基质干细胞细胞形态及生长状况与冻存前无明显差异，呈长梭形生长，增殖旺盛。 结论：分离纯化的兔骨髓基质干细胞生长增殖能力强，短期保存可用-60℃冻存，长期需液氮保存，为择期进行骨髓基质干细胞实验和应用提供实验依据。     

不同冻存时间与温度对兔骨髓基质干细胞存活率的影响

目的:以二甲基亚砜作为保护剂,采用慢冻快融法观察不同温度及不同时间冻存的兔骨髓基质干细胞复苏后存活率的变化。方法:实验于2003-09/2005-06在浙江省医学科学院生物工程所完成。①选取清洁级3月龄新西兰大白兔5只,抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液,密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化出兔骨髓基质干细胞,并进行增殖。②取第3代骨髓基质干细胞,经消化后离心重悬,用完全培养液调整细胞浓度为6×109L-1。将质量浓度为250g/L的二甲基亚砜缓慢滴入同体积含骨髓基质干细胞的上述培养液中,混匀,二甲基亚砜的终浓度为125g/L,骨髓基质干细胞的终密度为3×109L-1,1mL/安瓿冻存。③4℃冻存直接将安瓿置4℃冰箱中;-20℃及-60℃冻存,则将安瓿置于有脱脂棉的聚丙烯泡沫盒中,壁厚1.5cm,扎紧密封,各置-20℃及-60℃冰箱过夜,取出后分别直接放于-20℃及-60℃冰箱保存;-196℃液氮冻存,则将置有安瓿的泡沫盒于-60℃冰箱过夜后,取出冻存安瓿直接放于液氮中保存。骨髓基质干细胞分别于4℃、-20℃、-60℃、-196℃条件下进行3d,10d,1,3,8个月以及1年的冻存。④经不同温度及不同时间冻存后,给予复苏。复苏时将冻存安瓿从液氮或冰箱中取出,立即置37℃水浴并轻轻摇动,约1min迅速解冻。含骨髓基质干细胞的冻存液经5倍于冻存液量的完全培养液稀释后,离心重悬,进行骨髓基质干细胞存活率测定。复苏后的骨髓基质干细胞以1×104/cm2用完全培养液再培养,观察骨髓基质干细胞的形态变化及生长活性情况。结果:实验选取3月龄新西兰大白兔5只,全部进入结果分析。①兔骨髓基质干细胞原代培养情况:培养3d时,骨髓基质干细胞数量较少,散在分布,呈短梭形形态。培养1周时细胞形成大量的小集落,细胞变长。此后集落细胞迅速增多,逐渐汇合成片,形态为均一的长梭形,呈旋涡状排列,2周时细胞长成单层。②兔骨髓基质干细胞传代培养情况:刚传代的骨髓基质干细胞呈圆形,数小时后迅速贴壁,重新成为梭形。之后细胞呈长梭形均匀分布生长,形态比原代培养更均一,细胞生长旺盛、增殖迅速。连续传代22代无明显变化。但随传代次数增多,细胞形态出现多样性,逐渐呈老化现象。③不同温度不同冻存时间下复苏后的兔骨髓基质干细胞存活率的比较:兔骨髓基质干细胞液氮保存1年,存活率为79%;-60℃保存1,3,8个月的存活率分别为67%,38%和0%;不宜于4℃及-20℃保存。④复苏后的骨髓基质干细胞再培养情况:复苏后的骨髓基质干细胞细胞形态及生长状况与冻存前无明显差异,呈长梭形生长,增殖旺盛。结论:分离纯化的兔骨髓基质干细胞生长增殖能力强,短期保存可用-60℃冻存,长期需液氮保存,为择期进行骨髓基质干细胞实验和应用提供实验依据。     

两种不同分离方法对羊骨髓间充质干细胞生物活性的影响

背景：近几年关于鼠、兔等小型动物骨髓间充质干细胞的研究较多,如何获得大型动物羊的骨髓间充质干细胞的报道还较少。目的：观察全骨髓培养法和密度梯度离心法对羊的骨髓间充质干细胞生物活性的影响。方法：取健康2月龄的阿勒泰大尾羊,麻醉后于髂后上棘穿刺抽取骨髓,分别采用全骨髓培养法和密度梯度离心法提取羊骨髓间充质干细胞,倒置荧光显微镜观察原代骨髓间充质干细胞的细胞形态及贴壁情况,记录两组细胞首次传代时间,流式细胞仪检测CD44抗原表达,MTT法测定细胞的生长曲线,VonKossa’s染色检测成骨诱导的分化潜能。结果与结论：两种分离方法均能得到较均一的梭形,三角形和多边形的BMSCs,胞核大胞浆丰富,CD44抗原表达阳性。全骨髓培养法较密度梯度离心法的细胞数量较多,传代时间略早。骨髓间充质干细胞诱导培养至第14～21天,两组的VoKossa染色均阳性。其中首次传代全骨髓贴壁法的传代细胞较密度梯度离心法的细胞贴壁较快,活力较好。提示全骨髓培养法是一种简单有效的提取方法。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及冻存研究

目的:寻求体外培养、冻存、复苏兔骨髓间充质干细胞(mensechymalstemcells,MSCs)的方法,为兔MSCs进一步的实验研究打下基础。方法:取新西兰白兔胫骨穿刺获取骨髓液,以贴壁筛选法分离、纯化、培养和扩增获得MSCs,并行液氮冻存,通过倒置显微镜观察其生物学表现。结果:MSCs为贴壁生长,形态为均匀成纤维细胞样,增殖能力强,传代及冻存后细胞仍然保持其生物学特性。结论:MSCs可采取贴壁筛选法进行较好的纯化和扩增,并可长期保存于液氮中,在一定的条件下可复苏存活。     

兔骨髓间充质干细胞生物学特性的实验研究

目的:体外优化获取兔骨髓间充质干细胞并对其进行纯化、扩增,同时对其生物学特性进行研究,获得足量细胞用于材料细胞的相容性研究.方法:抽取新西兰大白兔骨髓,采用密度梯度离心法和贴壁筛选法相结合进行分离培养,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线,测定贴壁率.结果:经密度梯度离心法和贴壁筛选法相结合得到的骨髓间充质干细胞纯度高,性状稳定,生长曲线相似,传代后第12小时贴壁率高达90%;Giemsa染色光镜观察免骨髓间充质干细胞为单核细胞,呈梭形或不规则长多边形.结论:建立兔骨髓间充质干细胞体外分离培养的最适条件,骨髓间充质干细胞增殖能力强,可作为材料细胞相容性研究的受试细胞,并可作为组织工程的种子细胞.     

组织工程化心肌组织构建的研究与问答

1 骨髓间充质干细胞分离培养方法的选择? 用于骨髓间充质干细胞分离的方法主要有4种:贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪法和免疫磁珠法.目前最常用的分离培养骨髓间充质干细胞的方法是密度梯度离心后贴壁培养.根据骨髓间充质干细胞与其他细胞的密度不同,将骨髓抽提物采用密度梯度离心,分离出处于1.073 g/mL密度界面上的细胞进行瓶皿接种,细胞贴壁生长,类似成纤维细胞,通过换培养基的方式除去悬浮生长细胞,可获得纯度高达95%的间充质干细胞.这种方法常与贴壁筛选法结合,操作简单,目前被认为是最理想的分离培养骨髓间充质干细胞的方法.     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学特性

目的:观察成人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法及其生物学特性,为骨髓间充质干细胞的临床应用奠定技术基础。方法:实验于2005-12在吉林省四平市中心医院中心实验室进行。实验材料:人骨髓间充质干细胞,Ficoll淋巴细胞分离液,胎牛血清,牛血清白蛋白,α-MEM培养基,胰蛋白酶,FITC标记的CD44和CD90。实验方法:①人骨髓间充质干细胞的分离与培养:采集成人骨髓,密度梯度法分离单个核细胞,条件培养基培养和扩增,倒置光学显微镜下观察细胞形态及生长情况。②人骨髓间充质干细胞生长曲线的测定:取生长良好的P1,P5,P10细胞,用胰酶消化,接种于24孔板培养,每天各取3孔消化计数细胞,取平均值,连续培养7d,绘制生长曲线。③人骨髓间充质干细胞表面标志的测定:取生长良好P5细胞进行免疫荧光染色鉴定(CD44,CD90并设同型对照)。④人骨髓间充质干细胞的冻存及复苏:收集生长良好细胞,计数细胞密度及冻前存活率。将细胞加入到细胞冻存液中液氮冷冻保存。30d后复苏细胞,每日倒置光学显微镜下观察细胞生长状况。结果:①倒置显微镜下观察细胞形态:倒置显微镜下观察细胞呈纤维形,漩涡状生长。②人骨髓间充质干细胞的生长曲线分析:传代的细胞生长较原代要快,从第10代开始细胞生长开始出现缓慢征象。③细胞表面标记检测结果:免疫荧光染色后细胞膜着色明显,CD44,CD90阳性率均大于90%。④细胞冻存及复苏生长特性分析:椎虫蓝计数细胞存活率90%以上,增殖能力强,和未冻存过的传代细胞具有同样的生长特性。结论:应用密度梯度法分离法能获得较高纯度的骨髓间充质干细胞,能在体外长期培养,在传代培养5代内生长旺盛且生物学特性稳定。     

Prevalence and severity of nausea and vomiting of pregnancy and effect of vitamin supplementation.

OBJECTIVE: Although nausea and vomiting of pregnancy is the most common medical condition during pregnancy, there are many unanswered questions regarding its cause, epidemiologic features and optimal management. The objectives of this study were to ascertain the prevalence of nausea and vomiting in a sample of Canadian women, to characterize the distribution of their severity and to investigate the role of vitamin B6 deficiency in their etiology. DESIGN: Prospective study. SETTING: Antenatal counselling service for pregnant women. PATIENTS: Three cohorts of women: a prospective, population-based cohort of 193 women, to estimate the rate and severity of nausea and vomiting (cohort A); a cohort of 555 women who sought advice for nausea with or without vomiting, to study the correlation between the maximal daily number of episodes of vomiting and maximal weight loss (cohort B); and a prospective cohort of 301 women who reported vomiting, to correlate vitamin supplementation with vomiting (cohort C). INTERVENTIONS: All 3 cohorts were interviewed during the counselling session, and cohort B was followed up prospectively. OUTCOME MEASURES: Frequency of nausea and vomiting, weight loss, maximal number of daily episodes of vomiting, rate of multivitamin supplementation. RESULTS: Overall, 67% of the women in cohort A reported experiencing nausea or vomiting, or both; 22% reported vomiting, and 9% experienced weight loss. In cohort B there was a significant correlation between the maximal number of daily episodes of vomiting and maximal weight loss, although there was wide variation (r2 = 0.25, p < 0.001). There was a highly significant correlation between the number of daily vomiting episodes and mean weight loss (r2 = 0.99). In cohort C, vomiting was significantly associated with lack of supplementation with multivitamins before 6 weeks' gestation (p = 0.002). CONCLUSIONS: The relation between number of daily vomiting episodes and mean weight loss may serve as a clinical tool to assess the severity of nausea and vomiting in pregnancy and the success of anti-emetics and rehydration regimens. Further study is needed to elucidate the biologic basis of the observed association between vomiting and lack of multivitamin supplementation in early pregnancy.     

城乡居民高血压与饮食习惯的调查分析

心血管疾病是我国的多发病和人群的主要死亡原因之一,而高血压已成为中老年人的常见病,是冠心病、脑卒中最主要的危险因素,已成为世界性公共卫生问题[1].随着我国经济的发展及人们生活水平的日益提高,我国在1958年、1979年、1991年分别进行了全国性的高血压普查,结果表明,我国高血压患病率在持续上升,且上升速度逐年加快[2].由于文化程度、生活习惯以及信息来源不足的差异也是导致城居民高血压患病率持续上升的重要原因,因此指导城乡居民进行合理的饮食,对预防高血压的发生、发展有着重要的意义.     

骨脂肪瘤及血管脂肪瘤的CT及MRI表现:9例报告并文献复习

目的探讨骨脂肪瘤及血管脂肪瘤的CT及MRI表现。方法收集手术病理证实的9例骨脂肪瘤及血管脂肪瘤的临床及影像学资料,9例术前8例接受CT扫描,3例接受MRI检查。结果9例中骨脂肪瘤6例,骨血管脂肪瘤3例。6例骨脂肪瘤发生于骨内4例,骨旁2例。骨内脂肪瘤跟骨1例,距骨1例,眶骨1例,肱骨1例。骨旁脂肪瘤颅骨1例,股骨1例。骨血管脂肪瘤发生于肋骨1例,颅骨1例,椎骨1例。骨内脂肪瘤CT显示病变骨质呈轻度膨胀性改变,边缘见轻度硬化环,病灶内见脂肪密度及条弧形、结节状钙化,MRI显示病灶T1WI呈高信号,PDWI及T2WI抑脂序列呈低信号。骨旁脂肪瘤CT呈不均匀高密度团块,MRI显示病灶T1WI呈高信号,T1WI及T2WI抑脂序列呈低信号。3例骨血管脂肪瘤CT显示病变骨质呈显著膨胀性改变,骨破坏边缘及内部见多发骨嵴及粗大骨小梁,高密度骨针呈放射状、簇状或不规则排列。结论骨内脂肪瘤及血管脂肪瘤CT及MRI表现均以脂肪成分为主要特征,骨旁脂肪瘤CT以骨化性团块为特征,骨血管脂肪瘤骨质膨胀性改变较骨内脂肪瘤显著,病灶边缘及中心以多发骨嵴及粗大骨小梁为特征。      

城乡居民高血压与饮食习惯的调查分析

心血管疾病是我国的多发病和人群的主要死亡原因之一,而高血压已成为中老年人的常见病,是冠心病、脑卒中最主要的危险因素,已成为世界性公共卫生问题。随着我国经济的发展及人们生活水平的日益提高,我国在1958年、1979年、1991年分别进行了全国性的高血压普查,结果表明,我国高血压患病率在持续上升,且上升速度逐年加快。由于文化程度、生活习惯以及信息来源不足的差异也是导致城居民高血压患病率持续上升的重要原因,因此指导城乡居民进行合理的饮食,对预防高血压的发生、发展有着重要的意义。     

Attitude differences of volunteers and nonvolunteers and of susceptible and nonsusceptible hypnotic subjects

A form of the Semantic Differential, containing 9 concepts related to hypnosis and research, was administered to 96 hypnotically inexperienced male Ss. The Ss were later asked to volunteer for a hypnotic experiment, and the hypnotic susceptibility of all volunteers (N = 51) was then determined. Semantic Differential responses of volunteers and nonvolunteers and of highly susceptible and unhyp-notizable Ss were compared. Differences between groups, in both comparisons, were generally not statistically significant, a finding which suggests that there is no simple relationship between paper-and-pencil measures of attitudes and volunteering for hypnotic experiments or hypnotizability.     

麻疹和风疹临床特征及监测病例定义的敏感度和特异度分析

目的 为了解麻疹和风疹的临床症状特征,并评价不同麻疹疑似病例定义的监测效果。 方法 2010年在北京市昌平区开展发热出疹性病例的流行病学调查,收集病例的一般情况、临床症状和体征、免疫史等信息。 结果 麻疹和风疹在发热程度、皮疹持续时间、发热至出疹时间间隔以及卡他症状、结膜炎、淋巴结肿大和关节疼痛等临床症状和体征有明显差异。北京市和卫生部麻疹疑似病例诊断标准的敏感度和特异度分别为94%、50%和45%、94%。如以"发热≥38℃,发热后第3天或以后出疹,并伴有卡他症状或结膜炎之一者"作为麻疹疑似病例诊断标准,敏感度和特异度分别为81%和92%。 结论 北京市麻疹发病率较低,北京市麻疹疑似病例诊断标准的敏感度较高,对于消除麻疹,及时发现病例有效。在消除麻疹进程中,要视不同发病率选择适宜的监测病例定义,以提高监测效力。