沙门菌属LAMP检测方法在食品卫生检验中的应用评价

目的探讨沙门菌属环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法在食品卫生检验中的应用价值。方法利用文献报道的LAMP检测方法和分离培养法分别对135份食品标本进行沙门菌检测,评价LAMP法和分离培养法的一致性。结果 LAMP方法检出14份食品标本沙门菌阳性,阳性率为10.4%,电泳和加荧光染料染色后均能判断结果;分离培养法检出6份食品标本沙门菌阳性,阳性率为4.4%。LAMP法检出阳性率高于培养法(P=0.021)。LAMP方法可在24 h内从食品中检测出沙门菌,而分离培养法检出沙门菌需要4~7 d,LAMP检测方法更快速。结论沙门菌属LAMP方法检测阳性率高于分离培养法,LAMP方法可用于食品中沙门菌的核酸检测。     

环介导技术在感染性腹泻沙门菌检测中的应用与研究

目的建立并应用环介导等温扩增法(LAMP)检测肠道门诊感染性腹泻中的沙门菌。方法通过在线软件Primer Explorer V5设计针对沙门菌的保守区引物,建立LAMP检测方法,采用荧光定量PCR法、LAMP法和分离培养法,对本院2015年肠道门诊137例患者的粪便标本进行检测。对建立的方法进行特异度、灵敏度试验,与荧光定量PCR法和培养法进行比对。结果 137份标本中,荧光定量PCR法检出28份阳性,LAMP法检出28份阳性,分离培养法检出23份阳性。3种方法的检测结果差异无统计学意义(P0.05)。LAMP对6株沙门菌属扩增的结果均为阳性,而对志贺菌等5株致病菌株扩增的结果均为阴性。LAMP检测方法具有良好的灵敏度和特异度。结论 LAMP检测方法灵敏特异,简单快速,比荧光定量PCR法更适用于基层疾病预防控制机构,有着较为广泛的发展前景。     

实时荧光PCR技术在预防性健康检查沙门菌与志贺菌检测中的应用

目的将实时荧光PCR技术应用于食品及公共场所从业人员肛拭标本的沙门菌与志贺菌检测,评价其作为快速检测方法的适用性。方法采集肠道门诊粪便与肛拭标本分别利用实时荧光PCR法与传统培养法进行平行对照实验,验证实时荧光PCR法的灵敏度与特异度;然后将此法与列联表结合应用于从业人员肛拭标本的检测。结果 515份肠道门诊标本的检测结果表明,实时荧光PCR法阳性率高于培养法(P0.05),沙门菌与志贺菌的灵敏度均为100.00%,特异度分别为98.98%、97.02%。检测2013年采集的从业人员肛拭标本21 590份,检出沙门菌18株,阳性率为0.83‰;未检出志贺菌。实时荧光PCR法检出率高于2014年同期传统培养法检出率。结论实时荧光PCR技术有助于提升预防性健康检查中沙门菌与志贺菌的检出率,而且特异度强、灵敏度高,兼具时效性与客观性,适合基层实验室对从业人员进行沙门菌与志贺菌的快速筛查。     

实时荧光PCR快速同时检测从业人员沙门菌和志贺菌结果分析

目的 了解双重实时荧光PCR快速同时检测从业人员沙门菌和志贺菌的效果.方法 采集从业人员肛拭子样本,用双重实时荧光PCR法检测沙门菌和志贺菌,检出的疑似阳性样本按国标法进行培养鉴定.结果 采用双重实时荧光PCR反应体系共检测从业人员39 974人次,荧光PCR检测出沙门菌阳性41份,阳性率1.22‰,培养法检测出31份,阳性率为0.78‰,沙门菌荧光PCR检测法的灵敏度为100％,特异性为99.95％.荧光PCR检测出志贺菌10份,阳性率为0.25‰,培养法检测出3份,阳性率为0.08‰,志贺菌荧光PCR法的灵敏度为100％,特异性为99.98％.从样品处理到检测结果仅需要时间2h～ld.结论 双重实时荧光PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于从业人员体检的快速诊断和肠道传染病的初筛,为肠道传染病的分子流行病学调查提供新的检测手段.     

多重实时PCR快速同时检测沙门菌和志贺菌

目的 建立改良分子信标，多重实时PCR同时检测沙门菌和志贺菌的快速方法，应用于食源性致病菌的快速诊断。方法 根据GenBank公布的沙门菌侵袭性基因invA和ssaR基因，分别设计一对引物和改良分子信标探针，用同色荧光标记，用于同体系检测沙门菌。志贺菌根据ipaH基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，加入沙门菌检测体系中，建立三重实时PCR一改良分子信标检测体系，应用于同时对沙门菌、志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。结果 改良分子信标一多重实时PCR反应体系DNA灵敏度为69～93fg/μl。菌液灵敏度为32～64CFU／ml或1～2CFu／PCR反应体系，无交叉反应。该反应体系同时检测134株沙门菌和67株志贺菌，均出现特异的荧光信号，两种细菌检测互不干扰。对细菌性食物中毒样本等共1100份同时进行沙门菌和志贺菌检测，569份沙门菌实时PCR阳性，其中551份沙门菌培养阳性；42份志贺菌实时PCR阳性，其中41份志贺菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需时间2h至1d。结论 改良分子信标-多重实时PCR检测体系快速、灵敏度高，特异性强，可用于沙门菌和志贺菌食物中毒的快速诊断，伤寒、痢疾等肠道传染病的初筛及预防医学门诊的健康人群体检，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

实时荧光PCR法快速分离食源性致病菌

目的建立快速的食源性沙门菌和志贺菌检测方法,以提高对该菌的检验速度和准确性,为公共卫生,食源性致病菌监测,突发性群体性食物中毒事件提供技术支持。方法采用实时荧光PCR法和培养法对40份不同类食品进行沙门菌和志贺菌的检测,并对分离的菌株进行血清分型和定量检测,比较两种方法的特异性,灵敏度,准确性。结果采用实时荧光PCR法检测40份样本,其中8份沙门菌核酸阳性,阳性率20%;采用培养法检测这40份样本,4份样品分离出沙门菌,阳性率10%,且4份样品经核酸检测均为阳性,32份核酸阴性样本采用培养法检测,均未分离到沙门菌和志贺菌。结论实时荧光PCR法结合传统分离培养法适宜食品中沙门菌,志贺菌的快速筛查鉴定及食物中毒等突发事件的快速诊断。     

多重荧光定量PCR检测沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌

目的基于SYBR Green I染料建立沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的多重荧光定量PCR检测方法。方法针对沙门菌invA基因、志贺菌ipaH基因和virA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因和femA基因片段设计引物,根据Tm值的差异分析确定荧光定量PCR扩增的靶基因和特异性引物,通过优化PCR反应体系,建立了用SYBR GreenⅠ多重荧光定量PCR熔解曲线来检测多种致病菌的方法。结果该方法检测的菌液灵敏度分别是沙门菌168 CFU/ml,志贺菌136CFU/ml,金黄色葡萄球菌1240CFU/ml,特异性强,整个过程只需要2h。结论该方法能快速、灵敏、特异检出沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌。     

荧光PCR法与细菌培养法检测从业人员沙门菌和志贺菌的对比研究

目的比较荧光PCR法与细菌培养法对从业人员肠道携带沙门菌和志贺菌的检出率。方法收集2015年7月24日-2015年11月13日4 620份从业人员肛拭子,分别用荧光PCR法和培养法进行肠道沙门菌和志贺菌的检测,比较2种方法的检出率。结果培养法检出沙门菌54株、志贺菌0株,总检出率为1.17%;荧光PCR法检出沙门菌81株、志贺菌1株,总检出率为1.78%。荧光PCR法检测的灵敏度高于培养法检测,差异有统计学意义(χ~2=5.85,P0.05)。荧光PCR法与培养法对比,其灵敏度为100.00%,特异度为99.39%。结论荧光PCR方法操作简便、快速、灵敏度高、特异性强,可降低工作强度,适合在实验室进行常规推广;本区从业人员肠道沙门菌携带率明显偏高,相关部门需加强公共卫生监督。     

多重实时PCR检测沙门菌、志贺菌和致泻性大肠埃希菌

目的 建立多重实时荧光PCR检测沙门菌侵袭蛋白A基因（invA）、肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）不耐热肠毒素基因（elt）、志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌侵袭力基因（ipaH）的方法。方法 优化多重实时荧光PCR的反应条件,检测系列10倍稀释的阳性菌DNA提取物。90份腹泻患者粪便样品经缓冲蛋白胨水（buffered peptone water,BP）增菌6h后进行多重实时荧光PCR检测,并对阳性标本进行菌株分离和鉴定。结果 多重实时PCR方法最低可以检测到10CFU／μl的福氏2aF301株、10。CFU／μl的鼠伤寒沙门菌和ETEC44815株。检测腹泻患者粪便样品,elt基因阳性率为14．4％（13／90）,ipaH基因阳性率为5．6％（5／90）;并从阳性样品中分离到3株elt基因阳性大肠埃希菌和4株ipaH基因阳性大肠埃希菌。整个检测过程可在10h内完成,其中包括BP增菌6h。结论 建立了同时检测invA、elt、ipaH毒力基因的多重实时荧光PCR方法,具有高度的特异性,可用于沙门菌、肠产毒性大肠埃希菌、志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌菌株的毒力基因鉴定及临床腹泻粪便标本的快速筛检。     

实时PCR筛查、培养法确认方案在从业人员肠道致病菌检测的研究

目的:了解与培养法相结合的实时PCR方案在食品及公共场所从业人员肠道致病菌检测中的应用价值。方法:19818份从业人员肛拭子标本用荧光PCR检测,同时用经典分离培养方法进行确认。结果:在19818份标本中,荧光PCR检测出沙门菌阳性6份,阳性率为0.30‰,培养法检测出5份,阳性率为0.25‰,沙门菌荧光PCR检测法的灵敏度为100%,特异性为99.99%。荧光PCR检测出志贺菌20份,阳性率为1.01‰,培养法检测出5份,阳性率为0.25‰,志贺菌荧光PCR法的灵敏度为100%,特异性为99.94%。结论:在基层应用此方案可提高从业人员带菌检出率及检测准确性并大大降低工作强度,且为从采样到出报告全过程的实验室间比对提供良好基础。     

LAMP技术快速检测沙门氏菌方法的建立及其应用

目的 建立和评价一种适合国境口岸及基层检验部门使用的沙门氏菌快速检测方法,在2010年上海世博会保障期间开展应用研究.方法针对沙门氏菌agfA基因,运用环介导等温扩增技术(loop mediated isothermalamplification,LAMP),设计引物进行检测,在65℃恒温条件下、60 min特异性扩增...     

荧光定量PCR技术在食源性疾病病原菌快速检测上的应用与评估

目的:应用荧光定量PCR技术,实现对食源性疾病病原菌的快速检测。方法:选取食源性疾病常见的四种病原菌,沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌,根据它们的基因保守区设计特异性引物和Taqman探针,建立荧光定量PCR技术,同时验证方法的敏感性和特异性,并与普通PCR、常规培养法进行比较。结果:用荧光定量PCR技术检测沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌的检测灵敏度可达4 CFU/ml～8 CFU/ml,其敏感性比普通PCR高10倍,比常规培养法高1000倍。且快速简便,特异性强,从核酸提取至完成检测最快能在2 h～3 h内完成,而常规培养需3 d～4 d。通过对282件样品的检测,证实该方法可以使阳性检出率从常规法的8.51%提高至14.18%。结论:建立的荧光定量PCR技术特异性强,敏感性高,操作简便快速,适用于食源性疾病病原菌的快速检测。     

LAMP法和PCR法快速检测阪崎肠杆菌的比较

[目的]建立阪崎肠杆菌环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测技术,并与PCR检测方法进行比较,为阪岐肠杆菌感染的快速诊断提供实验依据。[方法]根据阪崎肠杆菌外膜蛋白OmpA基因,设计特异性引物,建立LAMP和PCR检测技术体系,并对2种方法检测的灵敏度、特异性和实际样品的检测结果进行比较。[结果]建立了优化的LAMP和PCR检测体系,灵敏度检测结果显示,LAMP检测限为101cfu/ml,PCR检测限为102cfu/ml,LAMP检测灵敏度高于PCR;对36株近源菌进行特异性检测,结果显示,LAMP仅8株阪崎肠杆菌得到阳性结果,PCR产物则出现非特异性条带,LAMP特异性比PCR高。应用于46份奶粉样品的检测,LAMP和PCR均有清晰、特异的预期条带和结果产生,并与常规检测结果一致。[结论]LAMP检测技术作为一种快速检测阪崎肠杆菌的方法具有简便、灵敏快速,与PCR方法比较,特异性强、操作简便、检测成本低,耗时短,更有望发展成为快速检测阪岐肠杆菌的有效手段。     

环介导等温扩增技术在呼吸道感染病原体检测中的应用

目的 应用环介导等温扩增法(LAMP)对肺炎患者下呼吸道分泌物进行11种常见致病菌的核酸检测,探讨其临床应用价值.方法 收集福建省立医院2009-2010年呼吸科诊断为下呼吸道感染患者的合格痰标本289例,行LAMP方法检测,与痰培养结果比较,分析其灵敏性和特异性.结果 LAMP检测时间仅需2～3 h,明显短于痰培养;...     

Study on Identification of Salmonella in Textiles with LAMP-MALDI TOF MS

Objectives To establish a rapid analytical procedure for salmonella in textiles by LAMP in combination with MALDI TOF MS. The gene sequence invA of salmonella is specific to pathogenic strains. Based on its characteristic,a set of LAMP primer for salmonella is designed. If the amplification result is suspicious or positive,the strains are separated and the determination is rapidly performed through MALDI TOF MS technique. Methods About 70 reference strains closely related to the textiles and public health are selected to perform the specificity study(Salmonella enterica,Salmonella tyhimurium,Salmonella choleraesuis,Salmonella paratyphi A etc.); The bacterium solution of salmonella is diluted to different gradients for the sensitivity study. Results The results show this method is appropriately specific and sensitive,the limit of detection up to 4.6 CFU/mL. Conclusions The procedure is a new technique to detect salmonella in textiles.     

水体污染中常见致病菌的多重PCR分子检测研究

[目的]建立同时检测沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌、肠出血型大肠杆菌和副溶血弧菌等5种水体常见致病菌的多重PCR检测技术,为这些致病菌感染的快速诊断提供实验依据。[方法]筛选设计5对特异引物,建立优化的多重PCR扩增体系和条件。[结果]对5种致病菌的检测,多重PCR灵敏度分别为：肠出血型大肠杆菌O157102 cfu、志贺氏菌102 cfu、副溶血弧菌102 cfu、绿脓杆菌101 cfu、沙门氏菌102 cfu。应用于人工污染水样及天然水样的检测,均有清晰、特异的预期条带产生,并与传统检测结果一致,每个样品所需时间为6～8 h,相对于传统检测方法,极大地缩短了检测时间,提高了检测灵敏度。[结论]该方法适用于大通量样品的检测研究,可推广应用于食品检测、环境监测等领域。     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测沙门菌属方法的建立

建立一种检测沙门菌属快速敏感的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测方法。针对沙门菌属侵袭蛋白（invA）基因序列的六个区域设计四条LAMP引物，65℃保温约60min，完成对沙门菌属的扩增，扩增产物经电泳和酶切鉴定。利用LAMP和普通PCR方法同时检测4株沙门菌和9株非沙门菌（对照组）来验证LAMP方法的特异性；将肠炎沙门菌菌液做一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法进行检测来比较两者敏感性。4株沙门菌扩增出LAMP特征性梯状条带，9株非沙门菌没有出现LAMP扩增，LAMP产物的特异性通过限制性内切酶得到了证实；LAMP检测沙门菌属的特异性与普通PCR相同，但其敏感性比普通PCR高10倍，LAMP检测沙门菌属的检测下限为10cfu／ml，PCR检测下限为100cfu／ml。LAMP检测速度相比PCR更快速，在60min内即可完成扩增反应。建立了一个快速、特异、敏感的沙门菌属LAMP检测方法。     

增菌-PCR法与传统方法检测禽肉中沙门菌的比较研究

目的比较增菌-PCR法与传统方法检测禽肉中沙门菌的敏感性、特异性和时效性。方法以沙门菌invA基因为基础,选择特异性引物,采用30株沙门氏菌和18株非沙门菌建立并验证PCR法的特异性。选用肠炎沙门菌CMCC50041,参照GB4789.4—2010进行人工染菌实验,染菌量分别为每25g样本1、10、102、103、104、105和106 CFU。分别在增菌0、4、8、12和18h取1ml培养液,提取DNA进行PCR检测,并同时划线接种选择性平板,用传统方法进行分离鉴定,比较两种方法检测的敏感性和特异性。采集16份市售整鸡样本,用这两种方法进行检测,进一步比较两者的阳性检出率。结果 30株沙门菌都检出阳性,而非沙门菌都检测为阴性,说明本研究建立的PCR法特异性好。人工染菌的样本在增菌12h后,PCR法检出限可达每25g禽肉样本1CFU,传统方法检出限为每25g禽肉样本10CFU。增菌-PCR法整个流程只需要1天,比传统方法需时提前4～6天。16份市售样本,增菌-PCR法的阳性率为43.75%(7/16),高于传统方法31.25%(5/16)。结论增菌-PCR法具有快速简便、敏感特异等优点,较传统方法大大缩短了检出时限,提高了沙门菌的检出率。