葡萄糖和胰岛素对Colon 26肿瘤细胞TGF-β1 mRNA表达的影响

目的本试验模拟糖尿病病程不同阶段患者体内葡萄糖和胰岛素浓度的变化,研究不同浓度的葡萄糖和胰岛素对Colon 26肿瘤细胞TGF-β1 mRNA表达的影响。方法体外常规培养Colon 26肿瘤细胞。根据所用培养液外加葡萄糖和胰岛素浓度的不同,将实验所用细胞共分12组：A组（对照组）RPMI 1640培养液;B组加5 mmol/L葡萄糖;C组加10 mmol/L葡萄糖;D组加25 mmol/L葡萄糖;E组加5μIU/ml胰岛素;F组加25μIU/ml胰岛素;G组加125μIU/ml胰岛素;H组加5 mmol/L葡萄糖＋5μIU/ml胰岛素;K组加5 mmol/L葡萄糖＋125μIU/ml胰岛素;L组加25 mmol/L葡萄糖＋125μIU/ml胰岛素;M组加25 mmol/L葡萄糖＋5μIU/ml胰岛素;N组加25 mmol/L葡萄糖＋1.25μIU/ml胰岛素。每组设3个复孔,置37℃5%CO2饱和湿度的培养箱培养48 h,收集细胞后抽提总RNA,RT-PCR同时扩增目的片段TGF-β1和内参照β-actin,琼脂糖凝胶电泳,扩增产物在凝胶成像系统上扫描分析,计算TGF-β1 mRNA相对表达量。整个实验过程均重复3次。结果D组TGF-β1 mRNA的表达（0.768±0.017）高于A组（0.540±0.012）,差异有显著性（P〈0.01）;而B、C组TGF-β1 mRNA的表达（0.545±0.033、0.558±0.035）与A组相比均无显著性差别（P〉0.05）。E、F、G组对Colon 26肿瘤细胞TGF-β1 mRNA的表达（分别为0.566±0.039、0.549±0.030、0.531±0.022）与A组相比无显著性差别（P〉0.05）。L、M、N组的TGF-β1 mRNA表达（分别为0.889±0.028、0.764±0.027、0.752±0.035）均高于A组（0.540±0.012）,差异有显著性（P〈0.01）;而H、K组的TGF-β1 mRNA表达（0.550±0.037、0.537±0.025）与A组相比均无显著性差别（P〉0.05）。结论高浓度的葡萄糖能够上调Colon 26肿瘤细胞TGF-β1 mRNA的表达,不同浓度的胰岛素不影响Colon 26肿瘤细胞TGF-β1 mRNA的表达,高浓度的葡萄糖和胰岛素同时作用能够上调Colon 26肿瘤细胞TGF-β1 mRNA的表达     

葡萄糖和胰岛素对SW480肿瘤细胞分泌IGF-1的影响

目的本实验模拟2型糖尿病病程中葡萄糖、胰岛素的浓度改变,研究不同浓度的葡萄糖、胰岛素对SW480肿瘤细胞分泌IGF-1的影响。方法体外培养SW480肿瘤细胞。依据培养液中加入葡萄糖、胰岛素浓度的不同,将实验细胞分为六组：0组（对照组）：RPMI1640细胞培养液;第1组：RPMI1640细胞培养液＋5mmol／L葡萄糖和5uIU／ml胰岛素;第2组：RPMI1640细胞培养液＋5mmol／L葡萄糖和125gIU／ml胰岛素;第3组：RPMI1640细胞培养液＋25mmol／L葡萄糖和125uIU／ml胰岛素;第4组：RPMI1640细胞培养液＋25mmol／L葡萄糖和5uIU／ml胰岛素;第5组：RPMI1640细胞培养液＋25mmol／L葡萄糖和1．25uIU／ml胰岛素。每个组设3个复孔,于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养48h,培养结束后,收集细胞培养上清,用ELISA方法检测IGF-1的浓度。结果在高浓度的胰岛素组（第2组、第3组,培养液中均含有125uIU／ml的胰岛素）IGF-1的浓度[（286．85±23．51）ug／L、（293．43±30．57）ug／L]高于对照组0组[（197．99±22．50）ug／L],差异有统计学意义（F=9．726,P〈0．01）;而第1、4、5组（培养液中分别含有5uIU／ml、5uIU／ml、1．25uIU／ml的胰岛素）IGF-1的浓度[（203．22±28．89）ug／L、（209．47±25．77）ug/L、（195．33±20．88ug/L）]与对照组0组相比较,差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论高浓度的胰岛素能够上调SW480肿瘤细胞IGF-1的表达。     

葡萄糖和胰岛素对4T1肿瘤细胞VEGF mRNA表达的影响

目的研究不同浓度的葡萄糖和胰岛素对4T1肿瘤细胞血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达的影响。方法体外常规培养4T1肿瘤细胞,根据细胞培养液RPMI1640培养基中所含葡萄糖和胰岛素浓度的不同将4T1肿瘤细胞分为15组。每组设双复孔,置于37℃、5％C02的细胞培养箱培养,48h后收集细胞,提取总RNA,RT—PCR同时扩增目的片段VEGF和内参照B—actin,琼脂糖凝胶电泳,扩增产物在凝胶成像系统上扫描分析,计算VEGFmRNA相对表达量。整个实验过程重复3次。结果培养液中含有不同浓度葡萄糖的B、c、D、E组VEGFmRNA的表达与A组相比变化不明显（P〉0．05）。F组、G组和J组VEGFmRNA的表达与A组相比差异均无统计学意义（P〉0．05）;在含有高浓度胰岛素的H组、I组VEGFmRNA的表达水平与A组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。L组和M组的VEGFmRNA的表达水平与A组相比差异有统计学意义（P〈0．05）;而K组、N组和O组与A组相比差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论高浓度的胰岛素能够使4T1肿瘤细胞VEGFmRNA的表达上调,葡萄糖浓度的变化对4T1肿瘤细胞VEGFmRNA的表达无明显影响。     

铁超负荷对胰岛β细胞分泌胰岛素功能的影响

目的 建立胰岛细胞表面灌注系统,并检测次氮基三醋酸铁（FeNTA）溶液对正常大鼠离体胰岛细胞一相分泌的影响。方法 分离正常大鼠的胰岛细胞,将其分为3组：A组、B组和C组,每组合50个胰岛,分别用不同的刺激液进行灌注,检测40min内胰岛素的分泌量。其中,A组为对照组,灌注液为16．7mmol／L葡萄糖液;B组为舍铁的高糖液灌注,包括B1组（高糖液舍有0．05mmol／LFeNTA）和B2组（高糖液舍有O．1mmol／LFeNTA）;C组为经过FeNTA孵育5h后用高糖液灌注,包括C1组（孵育液中含FeNTA0．05mmol／L）和C2组（孵育液中舍FeNTA0．1mmol／L）;实验过程重复3次。结果 ①正常大鼠的胰岛细胞在16．7mmol／L葡萄糖刺激下胰岛素分泌具有典型的早相分泌;②无论是在含一定浓度的（0．05mmol／L或0．1mmol／L）FeNTA的葡萄糖的刺激液灌注,还是经过合FeNTA（0．05mmol／L或0．1mmol／L）孵育液孵育5h后再用高糖刺激液灌注,大鼠胰岛细胞的胰岛素分泌均完全缺乏一相分泌,仅有不断出现的微小波动,分泌峰值仅仅较基础状态略有增加。结论 铁含量增加会损害胰岛细胞分泌胰岛素,这对阐明铁与糖尿病的关系具有一定的意义。     

微量水溶性维生素对胰岛素分泌的影响

目的研究各种微量水溶性维生素对胰岛素分泌的影响。方法每种水溶性维生素和混合的B族维生素配制成浓度为0、0、05、0．25、0．5和1μmol／L的不同维生素溶液,将维生素溶液添加于含葡萄糖0、8．3和16．7mmol／L的大鼠胰岛培养液中,孵化90min后测定胰岛素分泌量。结果维生素B1和维生素B6在0．25～1μmol／L浓度范嘲内埘秧岛索分泌没有影响;生物素和泛酸在16．7mmol／L的葡萄糖浓度条件下能刺激胰岛素的分泌;炯酸在16．7mmlol／L葡萄糖浓度条件下对胰岛素分泌有刺激作用,在8．3mmol／L葡萄糖浓度条件下则抑制胰岛素的分泌;叶酸、维生素C、维生素B2以及混合B族维生素在16．7mmol／L葡萄糖浓度条件下抑制胰岛素的分泌。结论水溶性维生素对胰岛素分泌的作用各不相同,胰岛素分泌量依赖于葡萄糖和维牛素的浓度。糖尿病患者应该注意食物中水溶性维生素的摄入。     

LRP16基因通过上调GLUT-2促进MIN6细胞胰岛素分泌

目的：探讨LRP16基因对MIN6细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响及其可能机制。方法：用Super-Fect脂质体转染法建立稳定过表达LRP16基因的MIN6细胞株,以转染空质粒的MIN6细胞株作为对照。检测两组细胞的增殖、胰岛素分泌及GLUT-2蛋白的表达情况。结果：过表达组的增殖与对照组相比无显著差别（P〉0．05）;在0mmol／L、3mmol／L、30mmol／L葡萄糖刺激下,过表达组的胰岛素分泌量分别为对照组的2．26倍、2．19倍和2．16倍（P〈0．05）;westernblot显示过表达组GLUT-2蛋白量比对照组显著上调（P〈0．05）。结论：过表达LRP16基因不能促进MIN6细胞增殖,但可以通过上调GLUT-2促进胰岛素分泌。表明LRP16基因促进胰岛素分泌的作用不依赖细胞增殖,而依赖细胞对葡萄糖摄取的增加。     

葡萄糖浓度波动对INS-1细胞胰岛素分泌的影响

目的初探葡萄糖浓度波动对大鼠胰岛素瘤INS-1细胞胰岛素分泌功能影响机制。方法将INS-1细胞随机分为正常糖组（5.5 mmol/L葡萄糖培养液培养）、持续高糖组（16.7 mmol/L葡萄糖培养液培养）、波动组（用16.7 mmol/L葡萄糖培养液培养2 h,再换5.5 mmol/L培养3 h,每天重复3次,夜间9 h维持在5.5 mmol/L的培养液中）、N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）＋正常糖组、NAC＋持续高糖组、NAC＋波动组,后3组的培养基中均预先负载终浓度为1.0 mmol/L的NAC,余干预措施相同,均干预72 h。荧光素酶方法检测细胞内三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate,ATP）含量,放射免疫分析法测定胰岛素分泌水平。结果 INS-1细胞ATP含量及胰岛素分泌水平在持续高糖组及波动组均较正常糖组显著下降,且波动组下降更明显,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。NAC＋波动组及NAC＋持续高糖组细胞ATP含量及胰岛素分泌水平分别较波动组及持续高糖组显著增加,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论持续性高糖及波动性高糖损伤INS-1细胞的胰岛素分泌可能与减少细胞ATP含量有关,且波动性高糖较前者更严重,氧化应激可能是波动性高糖及持续性高糖导致INS-1细胞ATP减少的机制。     

葡萄糖和胰岛素对SW480肿瘤细胞分泌IGF-1、TGF-β-1的影响

目的研究葡萄糖和胰岛素对SW480肿瘤细胞分泌IGF-1、TGF-β1的影响,对糖尿病与结直肠癌之间的关系及机制进行探讨。方法对SW480肿瘤细胞进行常规体外培养。以培养液溶葡萄糖浓度的不同为划分依据,将实验细胞分为六组:对照组为RPMI1640培养液;Ⅰ组为RPMI1640培养液+5mmol/L葡萄糖+5μIU/ml胰岛素;Ⅱ组为RPMI1640+10mmol/L葡萄糖+125μIU/ml,以此类推,每一组在培养液不变的基础上增加5mmol/L葡萄糖,胰岛素量则分别为125、5、1.25μIU/ml,直至第Ⅴ组;此外以培养液胰岛素浓度的不同为划分依据,将实验细胞分为六组:对照组为RPMI1640培养液;1组为RPMI1640培养液+5μIU/ml胰岛素;2组为RPMI1640+125μIU/ml,余下三组的胰岛素量则分别为125、5、1.25μIU/ml。每组设三个复孔,放在温度为37℃、二氧化碳浓度5%、湿度饱和的培养箱内持续培养48小时,成功培养后收集SW480肿瘤细胞上清,然后对IGF-1、TGF-β1的浓度进行ELISA法检测。结果高浓度胰岛素IGF-1表达明显高于对照组,存在显著差异,P0.05,具有统计学意义,而低浓度胰岛素组则相反;4、5组的TGF-β1浓度明显高于对照组,存在显著差异,P0.05,具有统计学意义。结论葡萄糖对SW480肿瘤细胞IGF-1的分泌不存在影响,但高浓度的葡萄糖能够促进SW480肿瘤细胞TGF-β1的分泌;高浓度的胰岛素能够上调SW480肿瘤细胞IGF-1的表达。     

游离脂肪酸对大鼠胰岛分泌功能和胰岛细胞凋亡的影响研究

目的：研究游离脂肪酸对体外培养SD大鼠胰岛功能和胰岛细胞凋亡的影响并探讨可能机制。方法：取健康雄性SD大鼠胰岛原代分离培养,分为6组,培养1d：NC1组（5．6mmol／L葡萄糖）、FFA1组（0．25mmol／L）、FFA2组（0．5mmol／L）;培养3d：NC2组（5．6mmol／L葡萄糖）、FFA3组（0．25mmol／L）、FFA4组（0．5mmol／L）;每组6个样本,每个样本20个胰岛。采用RT—PCR扩增胰岛素、PDX-1、Bax、Caspase-3基因mRNA表达,TUNEL法检测胰岛细胞凋亡率,放射免疫法检测胰岛素水平。结果：①FFA1、FFA2组Insulin、PDX-1基因表达量、胰岛素分泌较NC1组明显下降,FFA1、FFA2组凋亡基因Bax、Caspase-3表达量及胰岛细胞凋亡率较NC1组明显升高,差异有统计学意义（P〈0．05）;②FFA3、FFA4组Insulin、PDX-1基因表达量、胰岛素分泌较NC2组明显下降,FFA3、FFA4组凋亡基因Bax、Caspase-3表达量及胰岛细胞凋亡率较NC2组明显升高,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：游离脂肪酸抑制体外培养SD大鼠胰岛细胞的胰岛素分泌功能,其可能机制是FFA抑制胰岛素基因、PDX-1基因的合成,刺激胰岛细胞凋亡基因Bax、Caspase-3表达,并导致胰岛细胞凋亡,最终导致胰岛细胞分泌功能下降。     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导为胰岛样细胞体外实验

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）在不同葡萄糖浓度培养基中诱导效果的差异.方法：采用电镜观察细胞形态学变化、双硫腙（DTZ）染色鉴定胰岛素分泌细胞的存在;放射免疫分析法观察诱导后BMSCs细胞对葡萄糖刺激试验的反应;免疫细胞化学分析鉴定细胞内胰岛素分泌以及Real-timePCR鉴定胰岛β细胞相关基因mRNA表达水平.结果：电镜观察可见诱导后的细胞具备典型分泌细胞特点,DTZ染色显示各诱导组细胞团为棕红色,细胞浆中富含锌离子,而对照组则无染色,表明胰岛素分泌样细胞的存在.经不同浓度葡萄糖诱导后其吸光度值A值：低糖5.5mmol/L诱导组（4.75±1.87）,中糖11.1mmol/L诱导组（10.96±2.06）,高糖25mmol/L诱导组（12.53±2.04）,且各诱导组吸光度值A值随着培养基葡萄糖浓度的不断增加,A值也在不断增高.Real-timePCR定量分析结果显示,诱导后胰岛β细胞相关基因GK,PDX-1,ngn3,GLP-1mRNA的表达水平变化显著,差异具有统计学意义（P〈0.01）.胰岛素分泌量高糖25mmol/L诱导组（6.64±0.46）IU/L高于其他各组,差异具显著性（P〈0.01）.结论：培养基葡萄糖浓度对大鼠BMSCs诱导为胰岛样细胞具有一定影响,以高糖培养基的诱导效果较好.     

白藜芦醇对高糖高脂处理的原代人脐静脉血管内皮细胞E-选择素表达及NO分泌的影响

目的：探讨白藜芦醇对高糖、高脂培养人原代脐静脉血管内皮细胞E-选择素mRNA表达及胰岛素刺激的一氧化氮（NO）分泌的影响。方法：原代培养人脐静脉内皮细胞,以0．1μmol／L白藜芦醇预处理4h后,以高糖（33．3mmol／L葡萄糖）＋高脂（棕榈酸0．5mmol／L）DMEM培养基培养24h,以RT—PCR法检测培养细胞E-选择素的表达。部分细胞经100nmol／L胰岛素刺激25min后,以硝酸还原酶法检测培养上清NO的含量。结果：与正常对照组相比．高糖高脂培养使内皮细胞E-选择素的表达升高,同时胰岛素刺激的NO分泌降低。而白藜芦醇预处理可以明显降低E-选择素的表达,并明显促进胰岛素对内皮细胞NO分泌的刺激作用。结论：白藜芦醇可以改善高糖、高脂诱导的血管内皮细胞胰岛素刺激的NO分泌作用,并可降低E-选择素表达,保护内皮细胞的功能,从而可能在糖尿病动脉粥样硬化的防治中具有广阔的前景。     

银杏叶提取物对大鼠高糖高胰岛素下视网膜Muller 细胞的保护作用

目的：观察银杏叶提取物（extract of ginkgo bilobaleaf ,EGB761）在高糖高胰岛素作用下对视网膜Muller细胞活性的改变及其保护作用。方法用30mmol/L葡萄糖和（或）200U/L的胰岛素处理大鼠视网膜Muller细胞48小时,分为高糖高胰岛素组：200U/L胰岛素＋30mmol/L葡萄糖;高胰岛素组：200U/L 胰岛素;对照组：普通低糖型DMEM培养（含葡萄糖5mmol/L ）。提前0.5小时加入60μg/mL、120μg/mL的EGB761,观察对各组细胞的保护作用,48小时后用MTT 法测定视网膜Muller细胞的活性。结果高糖高浓度胰岛素处理后Muller细胞活性降低,与对照组相比差异有统计学意义（ P＜0.05）。而60或120μg/mL的EGB761能上调高浓度葡萄糖和高胰岛素处理后的视网膜Muller细胞的活力,且在单纯高胰岛素组中更佳,与无EGB761处理组相比差异有统计学意义（ P＜0.05）。结论高浓度葡萄糖和高胰岛素在短期内可使视网膜Muller细胞的活性降低,一定浓度的EGB761可减轻高糖高胰岛素对视网膜Muller细胞的损伤。     

高葡萄糖钳夹技术应用初探

目的 初步研究高葡萄糖钳夹技术的建立.方法 应用高葡萄糖钳夹技术对12例正常人进行方法 学的研究,评估胰岛β细胞功能.结果 （1）正常受试者在高糖钳夹开始后14 min内达到高糖目标值,并维持此水平至试验结束.（2）钳夹过程中血糖变异系数为4.6%.（3）观察到胰岛素双相分泌状态,1Ph为（256±17.89）mU/L,2Ph为（90.52 4±7.1）mU/L,最大Ins分泌量为（116.27±11.34）mU/L.结论 成功建立了高葡萄糖钳夹技术.     

转化生长因子-β对大鼠胰岛素基因表达的调节作用

目的：研究不同浓度转化生长因子-β（TGF-β）对大鼠胰岛细胞胰岛素基因表达的影响,探讨TGF-β在2型糖尿病治疗中的作用。方法：大鼠胰岛细胞与不同刺激浓度的TGF-β（0ng／mL、1ng／mL、2ng／mL、5ng／／mL、10ng／mL、20ng／mL）和葡萄糖浓度分别为2．2mmol／L、5．5mmol／L、11．1mmol／L的RPMI1640营养液共培养24h后,提取细胞总RNA.运用RT-PCR技术检测胰岛素基因表达的变化。结果：葡萄糖浓度为2．2mmol／L时,随TGF-β浓度逐渐升高,胰岛素基因表达量无明显变化;葡萄糖浓度为5．5mmol／L时,TGF-β浓度由0ng／mL升至2ng／mL时,胰岛素基因表达量无变化,而当TGF-β浓度进一步升高,胰岛素基因表达量呈剂量依赖性升高;葡萄糖浓度为11．1mmol／L时,随TGF-β浓度升高,胰岛素基因表达量呈浓度依赖性升高。结论：TGF-β以葡萄糖依赖和浓度依赖方式促进胰岛素基因的表达：     

熊果酸对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型CAP表达的影响

目的：观察熊果酸对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗、摄取及细胞分化的影响,并探讨其作用机制。方法：将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞,用高糖、高胰岛素联合诱导胰岛素抵抗模型。使用葡萄糖氧化酶法检测3T3-L1细胞葡萄糖消耗量,氚标葡萄糖法检测其葡萄糖摄取量,以评价模型建立情况。用四唑盐（methylthiazolyltetrazolium,MTT）比色法检测不同浓度熊果酸对3T3-L1脂肪细胞活力的影响以确定实验药物浓度。加入不同浓度熊果酸分组干预,用氚标葡萄糖法检测脂肪细胞葡萄糖摄取量;用油红O色法检测3T3-L1脂肪细胞分化情况;用实时荧光定量聚合酶链反应法、蛋白质印迹法分别观察熊果酸对3T3-L1细胞胰岛素抵抗模型细胞分化相关蛋白脂肪细胞脂类结合蛋白、基质金属蛋白酶1和原癌基因Cbl相关蛋白（c-Cbl-associatedprotein,CAP）表达的影响。结果：在成功建立胰岛素抵抗模型的基础上,使用MTT法检测细胞活力。确定熊果酸的作用浓度在4～20μmol／L。与模型组相比,低、高剂量熊果酸组（10、20μmol／L）及罗格列酮组（5μmol／L．）葡萄糖摄取均明显升高（P〈0．01）;低、高剂量熊果酸组3T3-L1脂肪细胞分化程度低于对照组和罗格列酮组。熊果酸可明显上调3T3-I,1细胞胰岛素抵抗模型CAPmRNA及蛋白的表达（P〈0．01）。结论：熊果酸改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型糖代谢的同时可抑制其分化,这一机制可能与熊果酸上调脂肪细胞CAP的表达有关。     

晚期糖基化终产物对高糖诱导NRK-52E细胞的转分化作用

目的：探讨晚期糖基化终产物（AGEs）对高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E的转分化干预作用。方法：大鼠肾小管导管上皮细胞株设空白组（不给葡萄糖）、高糖组（25mmol/L葡萄糖）、AGEs干预组（100mg/LAGEs）、高糖AGEs干预组（100mg/LAGEs＋25mmol/L葡萄糖）,培养72h后,用Westernbolt检测转化因子β1（TGF-β1）、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶2（MMP2）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及甲状旁腺素相关肽（PTHrP）在NRK-52E细胞的表达,活性氧（ROS）含量应用CM2H2DCFDA试剂盒检测。结果：高浓度葡萄糖上调TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达,AGEs显著上调高浓度葡萄糖状态下TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA和PTHrP表达,提高ROS含量。结论：AGEs可以促进高浓度葡萄糖诱导肾小管导管上皮细胞转分化。