胎儿骨髓来源的Flkl^＋CD34^—细胞的血液血管干细胞特性

目的:研究骨髓基质中是否具有血液血管干细胞的特征。方法：分离并培养人胎儿骨骨基质细胞（hfMSCs),FACS检测细胞的免疫表现。将此细胞接种在基底膜胶中，由血管内皮细胞生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)诱导，免疫组化和透射电镜检测轿管和造血的分化形成。结果：此细胞群体的典型特征是CD34阴性的成纤维样细胞99％表达Flkl(即血管内皮细胞生长因子受体2），并能形成血管样结构，而在管样结构形成的过程中诱导的CD34阳性的圆形细胞。结论：Flk^ CD34^-的hfMSC能向血管内皮细胞和造血细胞分化，提示其具有血液血管干细胞的特征表型。     

血管内皮生长因子C诱导骨髓间充质干细胞分化为淋巴管内皮细胞的研究

目的 研究骨髓间充质干细胞向淋巴管内皮细胞分化的潜能及条件,为淋巴管再生和重建提供理想的细胞来源。方法 分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原CD31、CD14、CD29和CD90。将纯化的骨髓间充质干细胞加血管内皮生长因子C(VEGF-C)50ng/mL诱导培养10d,Western-blot法与免疫荧光染色法检测细胞中淋巴管内皮细胞标记物Prox-1和LYVE-1的表达。结果 骨髓间充质干细胞呈现典型的梭形和旋涡状排列;经VEGF-C诱导后,细胞变短、呈多边形。流式细胞学显示,分离培养的骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD90呈阳性表达,CD31、CD14呈阴性表达;Western-blot检测显示,经VEGF-C培养诱导后,细胞明显表达淋巴管内皮特异性标记物Prox-1和LYVE-1;免疫荧光染色显示,诱导后细胞均明显表达Prox-1和LYVE-1,而未分化的骨髓间充质干细胞Prox-1和LYVE-1均不表达。结论 VEGF-C可以诱导骨髓间充质干细胞表达淋巴内皮细胞特异性标记物,促进其向淋巴管内皮转化。     

小鼠骨髓间充质干细胞定向诱导分化血管内皮细胞的实验研究

目的探讨体外小鼠骨髓间充质干细胞(mBMMSCs)的分离培养对其定向诱导分化为血管内皮细胞(VECs)的可行性。方法采用全骨髓贴壁法,分离骨髓间充质干细胞(MSCs)体外纯化培养并传代,倒置显微镜观察原代细胞形态变化,采用生长曲线法及3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法观察传代细胞生长特性。采用第3代mBMMSCs在内皮细胞生长培养基(EBM-2)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)进行定向诱导,观察细胞形态学变化;流式细胞仪分析比较第3代mBMMSCs及诱导后细胞DNA周期、细胞免疫表型的变化;免疫细胞荧光技术分别检测CD31、vWF和CD34表达及摄取Di-lac-LDL结合FITC-UEA-1的功能特点;体外血管形成实验检测血管内皮细胞的功能。结果 mBMMSCs原代培养呈长梭形、漩涡状排列生长,P1、P2、P3细胞生长曲线及MTT法显示呈潜伏期、对数生长期及平台期生长。诱导后的部分细胞形态可见类似血管内皮样改变,呈多角形、短梭形、铺路石样排列生长;细胞周期分析显示,第3代mBMMSCs G0/G1期为86%,诱导分化后的细胞G0/G1期为92%,细胞DNA周期无明显差异;第3代mBMMSCs免疫表型结果显示为CD105、CD90、CD73、CD44阳性表达,而CD34、CD45、VEGF(CD309)、CD14阴性表达;诱导分化后的细胞VEGF(CD309)、CD34弱阳性表达,而CD105、CD90、CD73、CD44、CD45、CD14阴性表达;细胞免疫荧光技术检测第3代mBMMSCs表面CD31、vWF和CD34阴性表达,不具有摄取Dil-ac-LDL、结合FITC-UEA-1的功能特点及形成血管管腔样结构;诱导后的细胞表达VECs特异性表面标志CD31、vWF和CD34,具有摄取Di-lac-LDL、结合FITC-UEA-1的功能特点及体外可形成血管管腔样结构。结论采用全骨髓贴壁法培养的mBMMSCs在体外具有定向诱导分化为VECs的潜能,成为血管组织工程理想的细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的实验研究

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向血管内皮细胞（ECs）诱导分化的可行性。方法：用贴壁法从成人骨髓中分离出间充质干细胞,培养扩增后,加入10ng／ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和人血管内皮生长因子（hVEGF）向ECs诱导分化,分别于0、24d流式细胞术检测细胞表型及荧光染色鉴定细胞。结果：hMSCs向ECs诱导分化24d,细胞CD34、KDR转为阳性,CD54、CD106、vWF表达增加。可摄取ac—LDL,并可结合UEA。结论：hMSCs经bFGF和VEGF作用,分化为具有ECs的表型和部分功能的细胞。     

体外诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化的实验研究

目的：探讨成体骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为内皮细胞的可行性，为心血管组织工程提供新的种子细胞来源。方法：骨髓穿刺抽取绵羊骨髓液，密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，通过贴壁培养纯化骨髓基质干细胞。以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养原代细胞，并以VEGF诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化。通过CD34、CD31流式细胞仪分析，免疫组化CD34、CD31、Ⅷ因子相关抗原染色鉴定内皮细胞，UEA结合实验及NO含量测定评价内皮细胞功能。结果：骨髓基质干细胞表达α-SMA，不表达CD34和CD31。体外定向诱导2周后分化为内皮细胞。呈梭形，表达CD34和CD31及Ⅷ因子相关抗原，UEA结合试验阳性，并具有分泌NO的功能。结论：体外培养条件下骨髓基质干细胞能够分化为内皮细胞，并具有成熟内皮细胞的生物学特性和功能。     

间充质干细胞定向诱导为内皮细胞的体外研究

目的:为寻找心血管组织工程新的种子细胞来源,探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力.方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,并体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)的诱导分化培养液定向诱导传代使其向血管内皮细胞方向分化,观察细胞形态的变化,检测内皮细胞特异性标志物的表达.结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后细胞具有内皮细胞的形态学特征,并表达内皮细胞特异性标志物CD31.结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化.     

体外定向诱导大鼠骨髓基质干细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的：研究骨髓基质干细胞体外向心肌细胞分化的能力。方法：通过密度梯度离心和贴壁培养法分离大鼠骨髓基质干细胞,首先将第3代细胞用5-氮胞苷诱导24h,传至4代时再次诱导24h,当培养细胞汇合并形成肌管时传代;出现跳动细胞时用免疫细胞化学方法检测心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达。结果：原代细胞首先形成细胞集落,10d后集落间接近汇合,传代细胞体积变大,5—7d传代1次,两次诱导后细胞呈梭形,约15d后细胞汇合并出现肌管,再传代时,细胞出现跳动。免疫细胞化学显示细胞表达cTnT。结论：骨髓基质干细胞在体外能够诱导分化为心肌细胞。     

胎儿骨髓来源的Flk1+CD34-细胞的血液血管干细胞特性

目的研究骨髓基质中是否具有血液血管干细胞的特征。方法分离并培养人胎儿骨髓基质细胞(hfMSCs),FACS检测细胞的免疫表型。将此细胞接种在基底膜胶中,由血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导,免疫组化和透射电镜检测血管和造血的分化形成。结果此细胞群体的典型特征是CD34阴性的成纤维样细胞99%表达Flk1(即血管内皮细胞生长因子受体2),并能形成血管样结构,而在管样结构形成的过程中诱导出CD34阳性的圆形细胞。结论Flk1 CD34-的hfMSC能向血管内皮细胞和造血细胞分化,提示其具有血液血管干细胞的特征表型。     

2种不同成牙本质诱导液对大鼠脂肪干细胞增殖凋亡的影响

目的：探索2种不同的成牙本质诱导液———牙胚条件培养液（TGC-CM）和牙本质非胶原蛋白（DNCPM）对大鼠脂肪干细胞增殖和凋亡的影响。方法（1）取出生4 d 的 SD 乳鼠4只，分别取腹股沟脂肪组织，用酶消化法进行脂肪干细胞分离和培养，免疫细胞化学法对细胞进行鉴定。（2）2种诱导液作用细胞后，倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，MTT 法检测细胞增殖情况，Annexin／PI 双染后流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。结果（1）细胞培养至第2代时表型分子 CD44和 CD105表达呈阳性。（2）经 TGC-CM 及 DNCPM 培养3 d 后形态上发生极性改变。培养6 d 后，TGC-CM 培养的细胞数量未见明显改变，而DNCPM 培养的细胞密度明显降低。（3）MTT 结果显示 DNCPM 组 OD 值低于对照组及 TGC-CM 组（P ＜0．05），流式细胞凋亡检测仪检测 DNCPM 组细胞凋亡率高于 TGC-CM 组和对照组（P ＜0．05）。结论作为大鼠脂肪干细胞向成牙本质样细胞方向分化的诱导液，TGC-CM 可能更具优势。     

骨髓间充质干细胞体外可定向诱导为内皮细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力。方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含VEGF、bFGF的诱导分化培养液定向诱导传代使细胞向血管内皮细胞分化,免疫荧光及免疫组化检测内皮细胞特异性标志物鉴定。结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后的细胞具有内皮细胞的形态学特征可表达CD31及Ⅷ因子。结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化。     

血管内皮细胞生长因子基因转染诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为内皮细胞

目的：评价经腺病毒介导的血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染后的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导成内皮细胞的可行性。方法：从大鼠骨髓中分离培养获取BMSCs，分别经Adv-VEGF、Adv-GFP转染，Western印迹分析检测VEGF蛋白的表达情况．细胞生长曲线测定BMSCs增殖特性．同时进行免疫表型鉴定．并与未转染细胞组比较。结果：Adv-VEGF转染组BMSCs可分泌VEGF蛋白，而其杂两组不分泌VEGF蛋白。转染VEGF基因后,BMSCs生长速度变快．向内皮细胞分化。与Adv-VEGF转染组BMSCs相比．Adv-GFP转集细胞组、未转染细胞组的BMSCs生长速度较慢．未有向内皮细胞分化的证据。结论：腺病毒介导的VEGF基因转繁可诱导BMSCs分化成内皮细胞。     

内皮祖细胞外泌体抑制紫杉醇诱导的血管内皮细胞焦亡

目的：探索内皮祖细胞外泌体（EPCs-Exo）对紫杉醇诱导的内皮细胞焦亡的影响及其可能机制。方法：培养原代骨髓间充质干细胞（BMSCs）和内皮祖细胞（EPCs）并鉴定。提取BMSCs和EPCs培养液中的外泌体,使用透射电镜观察外泌体形态并检测CD63和CD9的表达鉴定外泌体。分别用BMSCs-Exo和EPCs-Exo干预经紫杉醇诱导的内皮细胞焦亡模型,光镜下观察细胞形态;Western blot检测外泌体标志蛋白CD63、CD9和细胞焦亡相关蛋白NLRP-3、IL-18、GSDMD-N的表达情况;电镜下观察细胞超微结构的变化。基因芯片检测两组外泌体中差异的非编码RNA,RT-qPCR检测lncRNA FGD5-AS1表达情况。结果：大鼠骨髓细胞中分离培养分化出BMSCs和EPCs,免疫荧光法证实BMSCs中CD90 和CD44阳性,EPCs中CD34 和VEGFR2阳性。相比于对照组,紫杉醇组细胞膜被破坏,细胞内线粒体间距离增加,细胞内纤维排列紊乱,细胞中NLRP-3、IL-18、GSDMD-N等细胞焦亡蛋白表达增加（P ＜0.05）;相比于紫杉醇组,紫杉醇+EPCs-Exo组内皮细胞中细胞膜较完整,细胞系损伤较轻,NLRP-3、IL-18、GSDMD-N表达减少（P ＜0.05）;紫杉醇组与紫杉醇+BMSCs-Exo组内皮细胞形态和焦亡蛋白的表达差异无统计学意义。芯片及RT-PCR结果显示相比于BMSCs-Exo,lncRNA FGD5-AS1在EPCs-Exo中表达增加（P ＜0.05）。结论：EPCs外泌体抑制紫杉醇诱导的血管内皮细胞焦亡。     

源于人躯干皮肤真皮的成纤维样细胞的间充质干细胞分化潜能

目的: 研究从人皮肤真皮组织中分离培养的成纤维样细胞向中胚层细胞分化的潜能,初步探讨其替代自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)用于组织损伤和缺损修复的可行性。方法: 将一定大小的成人腹部全层皮肤组织分别用分散酶和Ⅰ型胶原酶消化,分离获得真皮来源总细胞。单层培养扩增的细胞在含有一定浓度N2、B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养液中进行悬浮培养,并收集培养液中悬浮存在的球状细胞聚集体(SDDSs),用含胎牛血清的培养液进一步单层扩增细胞。以免疫细胞荧光法分析细胞和鉴定细胞的分化特性。结果: 真皮中分离的一些单个细胞在无血清培养液中分裂增殖形成SDDSs;在含血清的单层培养条件下,从SDDSs分离培养的细胞增殖活跃,细胞表达间充质干细胞标志物CD90、CD105和波形蛋白;分别向骨细胞、软骨细胞以及脂肪细胞诱导分化后,呈现类似于BMSCs分化特点,分化的细胞呈茜素红、番红O和油红O特殊染色阳性反应,但真皮细胞分化形成的软骨细胞番红O染色弱于骨髓干细胞来源的软骨细胞。结论: 结合无血清培养和有血清培养法,可从人真皮组织中分离培养具有向软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞分化潜能的细胞,此细胞将有望替代BMSCs用于临床组织损伤修复的再生治疗。     

EphrinB2基因工程的骨髓间质干细胞对分化成血管内皮细胞的影响

目的 观察研究ephrinB2基因转染对体外诱导环境大鼠骨髓问质干细胞(BMSCs)分化成血管内皮细胞的促进作用.方法 采用密度梯度离心-贴壁培养法从Wistar大鼠骨髓中得到BMSCs.采用lenti-virus载体装载人ephrinB2基因转染大鼠BMSCs.采用流式细胞计数测定CD105、CD73、CD44、八因子(VWF)和血管内皮生长因子受体(KDR)等标志物在ephrinB2-BMSCs中的表达,并探讨其向成骨细胞及脂肪细胞体外分化的多向分化潜能.以2％FBS和50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)的培养条件,体外诱导ephrinB2-BMSCs向血管内皮细胞分化,并测定相应标志物的表达.结果 未经诱导分化的ephrinB2-BMSCs表达CD105、CD73和CD44,不表达血管内皮细胞特异性标志物VWF和KDR.转染后的ephrinB2-BMSCs依然具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的多向分化潜能.经诱导,ephrinB2-BMSCs表达VWF与KDR,并且其生成血管内皮细胞的比率及在Matrix基质上形成毛细血管样结构的比率均显著高于未转染ephrinB2的BMSCs.结论 ephrinB2基因工程的BMSCs具有极高的向血管内皮细胞分化的潜能.这种基因工程细胞为建立冠心病患者的临床治疗新方法提供了有意义的资源.     

骨髓基质细胞培养基对体外脊髓运动神经元的影响

目的:体外检测骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的条件培养基对脊髓运动神经元的影响。方法:体外培养SD大鼠的BMSCs,并收集其条件培养基。实验组脊髓运动神经元用条件培养基培养,对照组用NB培养液。观察两组运动神经元形态学指标,测量细胞突起长度。MTT法检测两组细胞活力。结果:实验组运动神经元的细胞活力、突起长度与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:BMSCs合成和分泌神经营养活性物质对脊髓运动神经元有维持存活和促进突起生长的作用。     

鹿茸多肽联合GDNF基因修饰的雪旺细胞对人骨髓间质干细胞体外增殖的影响

目的：探讨鹿茸多肽（PAP）联合胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）基因修饰的雪旺细胞对人骨髓间质干细胞（BMSCs）体外增殖的影响。方法：按常规方法抽取10 mL健康志愿者骨髓,接种于培养瓶中进行培养,原代培养细胞完全融合前进行传代,传至第3代时收获BMSCs,调整细胞浓度为5×10⁶ mL^-1备用。加入4 μL GDNF基因修饰的雪旺细胞为GDNF组,加入4 μL （10 mg·L^-1） PAP联合GDNF基因修饰的雪旺细胞作为联合组,对照组未加入任何药物仅加入等量的培养基。采用酶联免疫检测法检测各组细胞细胞增殖活力,ELISA法检测各组BMSCs中增殖细胞核抗原（PCNA）水平,AnnexinⅤ-FIFC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。结果：原代培养48 h后大部分细胞贴壁,形态转变为多角形,少数呈梭形。传代细胞几乎呈梭形,为BMSCs,且均为非造血干细胞。与对照组比较,GDNF组和联合组细胞增殖活力和BMSCs中PCNA水平升高（P<0.05）,细胞凋亡率降低（P<0.05）;与GDNF组比较,联合组细胞增殖活力和BMSCs中PCNA水平升高（P<0.05）,细胞凋亡率降低（P<0.05）。结论：PAP联合GDNF基因修饰的雪旺细胞对人BMSCs体外增殖具有明显的促进作用。     

血管生长素基因转染5-氮胞苷诱导后的骨髓基质细胞移植于缺血心肌的实验研究

目的　利用编码血管生长素基因的腺病毒 (Ad .ANG)转染 5 氮胞苷 (5 aza)诱导骨髓基质细胞 (BMSC) ,移植于大鼠缺血心肌后对心功能的保护和促血管新生作用。方法　体外培养Lewis大鼠的骨髓基质细胞 ,使用 3μmol/L的 5 aza体外强化诱导 2 4h ;然后在 5 0倍的转染倍数 (病毒数 /靶细胞 )下 ,用Ad .ANG转染诱导BMSC。通过ELISA方法检测其对ANG的表达和分泌。然后将其移植于结扎了冠状动脉前降支的Lewis大鼠缺血心肌内 (组Ⅰ )。同时设置单纯细胞移植组 (组Ⅱ )和基因治疗组 (组Ⅲ ) ,以注射无血清培养基的实验动物为对照组 (组Ⅳ )。通过心脏射血分数 (EF)、左室舒张末期容积等超声指标研究其对心功能的保护作用 ;另外通过免疫组化、电镜研究细胞存活、分化和血管新生情况。结果　Ad ANG转染BMSC后 ,在培养上清中ANG大量出现 ,4～ 7d时达到表达高峰 ,15d后仍可检测到蛋白质表达。移植于缺血心肌 4周后 ,组Ⅰ和组Ⅱ缺血区的移植细胞大部分分化为心肌样细胞 ,组ⅠEF改善程度明显好于组Ⅱ (P <0 0 5 )、组Ⅲ (P <0 0 1)和组Ⅳ (P <0 0 1) ,在促血管新生方面 ,组Ⅰ也明显优于以上 3组 (组Ⅰ 36 3个 /HPF ;组Ⅱ 10 5个 /HPF ;组Ⅲ 2 3 1个 /HPF ;组Ⅳ 0 9个 /HPF)。结论　转染Ad ANG后的BMSC移植于缺     

心肌细胞体外微环境中骨髓间质干细胞向心肌样细胞的分化

目的：分析心肌组织内何种细胞对骨髓间质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的定向分化起决定作用。方法：利用BMSCs与心肌细胞（cardiomyocytes,CM)、内皮细胞（endothelial cells,EC)共培养和单独培养，分析形态和结构蛋白表达等方面的变化。结果：与CM共培养后，相邻的BMSCs之间融合成肌管样结构，并与相邻胎鼠CM初步形成闫盘样结构。心肌肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC)抗体染色呈阳性。在与EC共培养以及BMSCs单独培养时，BMSCs均未出现肌管样结构，MHC染色呈阴性。结论：CM对BMSCs的定向分化具有一定作用。