破伤风毒素C片段在乳链菌内的表达

目的：构建破伤风毒素C片段(TETC)乳链菌表达载体,并验证其生物活性。方法: 将采用基因拼接方法获得的TETC基因从测序正确的质粒pBS-TETC上以Sal I、Hind Ⅲ切下,分别定向连接到以Xho I、 Hind Ⅲ酶切的质粒分泌表达的乳链菌表达载体pNBC1000和膜锚定表达的乳链菌表达载体pNBC2000。电穿孔转化乳链菌,分别提取分泌蛋白及膜锚定蛋白,通过蛋白电泳及Western-blot检测蛋白定位表达情况。结果：构建了分泌表达及锚定表达TETC的乳链菌表达载体pNBCL1002与pNBCL2002,电穿孔转化乳链菌获得了分泌表达及膜锚定表达TETC的乳链菌,SDS-PAGE分析显示分泌表达的TETC大小约为57.8kDa,表达量占总体蛋白的8.06%、上清蛋白的9.82%,锚定表达的TETC大小约为73.5 kDa的表达蛋白,表达量占总体蛋白的10.7%,膜蛋白的17.9%; Western-blot检测显示所表达的TETC均可与破伤风抗毒素血清发生免疫印迹。结论：成功构建了TETC乳链菌表达载体,并在乳链菌内表达了TETC,并初步验证了表达的TETC的免疫反应性,这一结果可能为进一步研究生物佐剂及防治破伤风疫苗奠定了基础。     

艰难梭菌毒素A羧基端基因原核表达载体的构建及生物信息学分析

目的构建表达艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区功能基因的原核表达载体。方法PCR扩增艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区功能基因（CDTAR），并将其克隆到表达载体pET-22b（＋），重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3），重组载体经EcoRⅠ，XhoⅠ双酶切鉴定及测序进行分析，并以生物信息学软件分析其生物活性。结果构建了含CDTAR的重组质粒pET—CDTAR，生物信息学分析示该序列具有良好的抗原性及疏水性。结论艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区功能基因原核表达载体的构建为艰难梭菌疫苗的研究奠定了基础。     

艰难梭菌毒素A羧基端基因的克隆与表达

目的:克隆并表达艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区 (CDTAR)基因.方法:PCR扩增CDTAR基因并将其克隆到表达载体pET-22b( ),重组质粒转化到E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对表达产物进行分析.结果:构建了含CDTAR基因的重组质粒pET-CDTAR,IPTG诱导后SDS-PAGE显示表达出Mr约为35.7 ku的重组蛋白,占菌体总蛋白的36.1%,可溶性表达占上清的22.2%,包涵体中约占24.9%.结论:成功克隆了CDTAR基因,并构建表达了CDTAR重组蛋白,为进一步研究CDTAR功能及研制艰难梭菌疫苗奠定了基础.     

艰难梭茵毒素基因3''''末端重复区域基因片段的PCR克隆

目的探寻一种简单、快速、灵敏的检测艰难梭菌的方法.方法以艰难梭菌毒素A和毒素B基因3'末端高度保守重复区分别设计一对引物,进行PCR反应,同时在同一体系相同反应条件下使用相同引物分别以大肠杆菌和乳杆菌DNA为模板进行扩增,比较二者结果.结果从艰难梭菌成功克隆了毒素A基因3'端重复区域960 bp的基因片段及毒素B基因3'端重复区域1851 bp的基因片段,不同来源的菌株出现了相同的2条电泳带,并通过测序鉴定;而对照的大肠杆菌和乳杆菌株无特异电泳带出现.结论从艰难梭菌毒素A、毒素B基因3'末端重复区域克隆的基因片段具有保守性,可以作为基因探针在临床上进行艰难梭菌检测,该方法简便、灵敏,可直接用粪便标本进行检测.此外,这些基因编码的多肽具有较高的疏水性并存在着膜受体结合区域,可以此为基础进行基因工程蛋白质疫苗的研究.     

艰难梭菌二元毒素B的克隆及其免疫原性分析

目的将艰难梭菌二元毒素B(cdtB)克隆到pET-28b载体,探索重组His-CdtB蛋白可溶性表达的最佳条件并纯化相应蛋白,分析其免疫原性。方法为了分析艰难梭菌二元毒素B的免疫原性,先以艰难梭菌标准菌株ATCC BAA-1870为模板,PCR扩增cdtB全长基因序列,克隆到质粒pET-28b,转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞以构建pET-28b-cdtB的原核表达载体,诱导E.coli-pET-28b-cdtB大量表达可溶性重组His-CdtB蛋白并利用镍柱亲和层析法纯化,纯化后的His-CdtB蛋白免疫Balb/c小鼠,分析小鼠血清抗体抗CdtB滴度。结果成功构建了pET-28bcdtB原核表达载体,目的蛋白为可溶性表达的最近诱导条件是培养温度为25℃、IPTG浓度为1.5 mmol/L、160 r/min振荡增菌12 h,最佳纯化条件为20 mmol/L的咪唑洗脱杂蛋白后用200 mmol/L的咪唑洗脱目的蛋白,纯化后的HisCdtB蛋白经质谱鉴定成功,该蛋白免疫Balb/c小鼠后产生的抗CdtB抗体滴度达到1∶105。结论纯化后的HisCdtB重组蛋白免疫Balb/c小鼠后产生了高效价抗CdtB抗体,说明其具有免疫原性,为今后进一步进行二元毒素B的诊断及疫苗等研究奠定了实验基础。     

艰难梭菌毒素基因3′末端重复区域基因片段的PCR克隆

目的 探寻一种简单，快速，灵敏的检测艰难梭菌的方法。方法 以艰难梭菌毒素A和毒素B基因3′末端高度保守重复区分别设计一对引物。进行PCR反应，同时在同一体系相同反应条件下使用相同引物分别以大肠杆菌和乳杆菌DNA为模板进行扩增，比较二者结果。结果 从艰难梭菌成功克隆了毒素A基因3′端重复区域960bp的基因片段及毒素B基因3′端重复区域1851bp的基因片段，不同来源的菌株出现了相同的2条电泳带。并通过测序鉴定；而对照的大肠杆菌和乳杆菌株无特异电泳带出现。结论 从艰难梭菌毒素A，毒素B基因3′末端重复区域克隆的基因片段具有保守性，可以作为基因探针在临床上进行艰难梭菌检测，该方法简便，灵敏，可直接用粪便标本进行检测，此外，这些基因编码的多肽具有较高的疏水性并存在着膜受体结合区域，可以此为基础进行基因工程蛋白质疫苗的研究。     

重组hGM-CSF乳酸链球菌的构建及初步验证

目的 运用基因克隆技术将自行合成的人粒-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)转化于乳酸链球菌.并筛选获得高表达重组hGM-CSF的乳酸链球菌稳定株.方法 将经过优化适合在乳链菌表达的hGM-CSF基因克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽、终止密码子的pNBC1000载体,得到重组质粒pNCSF,然后将pNCSF进一步克隆于穿梭载体pTR1001c,获得乳链菌表达载体pTRCSF,通过电穿孔转化于乳链菌,并通过聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳验证hGM-CSF的表达.结果 获得了重组质粒pNCSF并经酶切鉴定和测序证实.酶切鉴定显示构建乳链菌表达载体pTRCSF及重组hGM-CSF乳链菌成功,蛋白电泳初步验证获得了高表达重组hGM-CSF的乳链菌株LL-CSF.结论 运用基因克隆技术成功构建了重组乳酸链球菌LL-CSF,为进一步研究重组hGM-CSF的生物学特性及评价其潜在临床.应用价值打下了基础.     

丙型肝炎NS5A基因多克隆抗体的制备

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）NS5A蛋白原核表达载体,获得高产量的纯化目的蛋白,并制备其多克隆抗体。方法：应用聚合酶链反应技术,PCR扩增获得NS5A基因,将NS5A基因插入至原核表达载体pET-32a（＋）中,转化大肠埃希菌DH5α提取质粒,验证正确后,转化大肠埃希菌BL21中,以IPTG诱导,获得NS5A融合蛋白的可诱导性表达．通过SDS—PAGE电泳、Western blot免疫印迹分析证实融合蛋白表达的特异性。利用Ni^＋亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰兔,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果：NS5A融合蛋白表达成功,成功获得了融合蛋白及兔抗NS5A多克隆抗体。结论：成功表达NS5A基因融合蛋白．获得高特异性、兔抗NS5A多克隆抗体,为研究NS5A基因的生物学功能提供了重要制剂。     

Clostridium difficile in ready-to-eat foods in Isfahan and Shahrekord,Iran

Objective:To determine the prevalence and antimicrobial resistance of Clostridium difficile(C.difficile) isolated from ready-to-eat foods of Iran.Methods:From January to August 2013,a total of 368 unpacked ieady-to-eat food samples were purchased from randomly selected supermarkets,retail stores and restaurants located in Isfahan and Shahrekord,Iran and were evaluated for the presence of C.difficile.Results:C.difficile spores were detected in 5(1.36%) of the 368 samples.The highest prevalence of C.difficile was found in fasl salad(4.29%).followed by yogurt stew(2%),and olovyeh salad(0.93%).All 140 maccaroni salad and I'alafel sandwich samples were negative for C.difficile.One of the five C.difficile isolates(20%) contained tcdA,tcdB and cdtB toxin genes and four strains(80%) contained tcdA.and tcdB toxin genes.Also,among the five C.difficile isolates,only three strains were found to be toxigenic for toxin A and/or B by ELISA.Isolates were susceptible to vancomycin and metronidazole,but variably resistant to other antimicrobial drugs.Conclusions:This study,combined with studies on other food sources,suggests that widespread contamination of food is common.     

基于线粒体功能障碍探讨补肾健脾化湿法对PCOS-IR作用的研究进展

]艰难梭菌是医院感染性腹泻的主要病原菌。艰难梭菌感染严格依赖于艰难梭菌产生的蛋白质毒素。近年来对艰难梭菌毒素的进一步研究有了新的发现,也发展和建立了一些新的艰难梭菌毒素检测方法。本文对艰难梭菌毒素的生物学和艰难梭菌毒素及其基因检测方法的研究进展做一综述,旨在为艰难梭菌感染防治提供参考。