铜绿假单胞菌LasI基因反义核酸载体的构建及生物学作用研究

目的构建LasI基因反义核酸原核表达载体pUCP18／lasI^antisenae转化入铜绿假单胞菌并分析其生物学作用。方法PCR扩增LasI基因序列，反向克隆法构建LasI基因的反义核酸原核表达载体pUCP18／lasI^antisenae，并转化铜绿假单胞菌。通过检测转化菌的LasB和LasR基因表达，测定外毒素的活性和绿脓菌素的表达等指标，分析pucP18／lasI^antisenae的生物学作用。结果成功构建pUCP18／lasI^antisenae并转化铜绿假单胞菌，且有效表达，转化菌的毒力因子弹性蛋白酶、外毒素和绿脓菌素表达水平均降低。结论pUCP18／las I^antisenae可以降低铜绿假单胞菌毒力因子表达，提示LasI基因可作为医院内铜绿假单胞菌感染治疗的一个新的靶点。     

铜绿假单胞菌LasⅠ基因反义核酸载体的构建及生物学作用研究

目的 构建LasⅠ基因反义核酸原核表达载体pUCP18/lasⅠantisense,转化入铜绿假单胞菌并分析其生物学作用.方法 PCR扩增LasⅠ基因序列,反向克隆法构建LasⅠ基因的反义核酸原核表达载体pUCP18/lasⅠantisense,并转化铜绿假单胞菌.通过检测转化菌的LasB和LasR基因表达,测定外毒素的活性和绿脓菌素的表达等指标,分析pUCP18/lasⅠantisense的生物学作用.结果 成功构建pUCP18/lasⅠantisense并转化铜绿假单胞菌,且有效表达,转化菌的毒力因子弹性蛋白酶、外毒素和绿脓菌素表达水平均降低.结论 pUCP18/lasⅠantisense可以降低铜绿假单胞菌毒力因子表达,提示LasⅠ基因可作为医院内铜绿假单胞菌感染治疗的一个新的靶点.     

氨溴索对铜绿假单胞菌生物膜密度感应系统信号分子及相关基因的影响

目的 探讨氨溴索对铜绿假单胞菌生物膜(biofilm,BF)密度感应(quorum-sensing,QS)系统信号分子酰化高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserinelactone,AHL)以及AHL合成酶编码基因表达的影响.方法 通过平板培养法培养铜绿假单胞菌建立成熟的体外BF模型,用扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)鉴定生物膜的形成情况.不同浓度氨溴索干预后,应用实时荧光定量PCR(real-time PCR)和AHL感应菌株根癌土壤杆菌(WCF47)分别检测其对铜绿假单胞菌AHL合成酶编码基因rhlI和lasI mRNA及AHL表达的影响.结果 通过实时荧光定量PER检测,结果显示氨溴索3.75 mg/ml作用组基因lasI和rhlI与对照组相比表达量均显著减少(P<0.05).氨溴索1.875 mg/ml干预后,有同样趋势,但效应不如高浓度明显(P<0.05).氨溴索3.75 mg/ml作用后AHL的表达量较对照组明显减少(P<0.05),氨溴索1.875 mg/ml作用后亦有减少(P<0.05).结论 氨溴索可以通过下调信号分子AHL合成酶编码基因以及AHL的表达来抑制BF.     

乳铁蛋白多肽嵌合体对泛耐药铜绿假单胞菌毒力因子表达的影响

目的：研究乳铁蛋白多肽嵌合体对泛耐药铜绿假单胞菌绿脓菌素、弹性蛋白酶表达的影响.方法：在泛耐药铜绿假单胞菌培养基（D600 =0.05）中分别加入乳铁蛋白多肽（LFampin、LFcin）以及乳铁蛋白多肽嵌合体（LFchimera）溶液干预,通过氯仿萃取法定量检测绿脓菌素水平,用刚果红弹性蛋白检测法检测弹性蛋白酶活性.结果：LFampin、LFcin以及LFchimer均对泛耐药铜绿假单胞菌有杀菌活性,且能显著抑制绿脓菌素、弹性蛋白酶的表达,其作用与浓度呈正相关,其中,LFchimera的作用强于LFampin及LFcin,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：乳铁蛋白多肽,尤其是乳铁蛋白多肽嵌合体对泛耐药铜绿假单胞菌具有良好的抗菌活性,能显著抑制其绿脓菌素、弹性蛋白酶的表达.     

铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因的扩增与克隆

目的PCR扩增及克隆铜绿假单胞菌的弹性蛋白酶基因.方法从铜绿假单胞菌培养物中提取染色体DNA,PCR扩增弹性蛋白酶基因成熟蛋白编码区,A-T克隆于pMD 18-T载体中,对重组质粒进行酶切与测序鉴定.结果从高GC含量的铜绿假单胞菌染色体DNA中扩增到弹性蛋白酶基因并进行了克隆与鉴定.结论本研究成功克隆到铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,为实现活性弹性蛋白酶的高效表达奠定了基础.     

红霉素、左氧氟沙星对铜绿假单胞菌生物被膜作用的体外研究

目的：建立铜绿假单胞菌生物被膜（BF）的体外模型,研究红霉素（EM）对细菌BF的影响及对左氧氟沙星（LFX）的增效作用。方法：采用生理盐水-吸痰管系统进行BF的培养,建立铜绿假单胞菌BF体外模型,银染法快速鉴定,扫描电子显微镜观察BF的变化。将头孢他啶（CAZ）、LFX单独或分别与EM联合作用于早期BF和成熟BF,连续稀释法进行各组几个作用时间的存活菌菌落计数,用试管二倍稀释法测定药物的最低抑菌浓度（MIC）。结果：小剂量的EM即可以抑制铜绿假单胞菌对吸痰管载体的黏附和抑制BF的形成（P〈0．01）。无论是对早期BF或成熟BF,LFX对BF内细菌的杀菌活性均强于CAZ（P〈0．01）,LFX与EM联合应用后效果优于LFX单独应用（P〈0．01）。结论：相对于CAZ,LFX对BF有较强的通透性,对BF内细菌有较强的清除作用。EM可以减少细菌的黏附,抑制铜绿假单胞菌BF的形成,增加抗菌药物对BF的渗透性,从而增强抗菌药物对铜绿假单胞菌的杀菌作用。LFX和EM联合应用效果更佳,是治疗细菌生物被膜相关感染的良好选择。     

密度感知信号系统在铜绿假单胞菌致大鼠肺部感染中的作用

【论文特点介绍】本实验比较了PAO1和PAO—JP2的弹性蛋白酶活性、外毒素A的含量，结果显示：PAO—JP2株显示了弹性蛋白酶活性、外毒素A表达的完全缺失。结合体内实验结果，证实了密度感知信号系统通过控制铜绿假单孢菌细胞外重要毒性因子，如弹性蛋白酶活性、外毒素A的表达，在铜绿假单孢菌致病作用中扮演重要的角色。使用特定合成的AI或QS抑制剂，来达到抑制铜绿假单孢菌毒性因子的表达，减低其致病作用，是颇有前景的一种抗菌疗法。     

原白头翁素对铜绿假单胞菌群体感应系统调控的毒力因子表达量的影响

目的 研究原白头翁素对铜绿假单胞菌（PA）的生长及群体感应系统（QS系统）调控的毒力因子表达的影响。方法 测定原白头翁素对PA的最低抑菌浓度和生长曲线,以40 μmol/L的呋喃酮C-30作为阳性对照,测定原白头翁素（40、80 μmol/L）对铜绿假单胞菌标准株PAO1生长曲线的影响以及QS系统调控的毒力因子中胞外3种毒力因子（绿脓菌素、蛋白水解酶和弹性蛋白酶）表达量的影响。结果 在实验所采用的浓度下,原白头翁素对铜绿假单胞菌的生长未表现出明显的抑制作用,但对PAO1的3种毒力因子均有抑制作用,并呈现出剂量相关性。结论 原白头翁素抗感染的机制可能是作用于铜绿假单胞菌的QS系统,抑制毒力因子表达,从而降低该菌的毒力。     

低浓度乙醇对铜绿假单胞菌生长及相关毒力因子影响的研究

目的：研究低浓度乙醇对铜绿假单胞菌磷脂酶C基因（PLCH）表达的影响。方法：观察不同浓度乙醇对铜绿假单胞菌生长曲线影响,荧光定量实时PCR检测不同乙醇浓度培养的铜绿假单胞菌PA01的PLCH表达量变化。、结果：工程株PA01在0．1％、0．5％、1％乙醇浓度下,其生长曲线与对照基本一致,在孵育18h都达到最高生长密度;在2％～5％的乙醇浓度下,细菌生长极其缓慢,6％以上的乙醇浓度下几乎不生长．．与对照相比,在0．1％、0．5％和1％乙醇诱导下．PLCH的表达量的分别比对照组上升了44倍、30倍和8倍．在2％乙醇浓度下,PLCH表达量略为下降。结论：低浓度乙醇有助于铜绿假单胞菌相关毒力因子表达上调,增加生存力．在感控消毒中,保持足够的酒精浓度对清除铜绿假单胞菌至关重要。     

RANTES和elastin在肝细胞癌中的表达及意义

目的研究肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）组织中趋化因子受激活调节正常T细胞表达和分泌因子（regulated—upon activation normal T expressed and secreted,RANTES）和弹性蛋白（elastin）的表达水平,并探讨其临床病理意义。方法选择42例手术切除的HCC癌组织和癌旁组织标本,常规石蜡包埋切片后ABC免疫组化法检测RAN—TES和elastin的表达情况。结果42例HCC癌组织中RANTES和elastin的表达阳性率和表达评分均显著高于癌旁组织：RANTES,54．8％VS19．0％（P〈0．01）．1．88±1．78VS0．69±1．28（P〈0．01）：elastin,45．2％vs19．0％（P〈0．05）,1．64±1．85VS0．66±1．28（P〈0．01）;RANTES和elastin的表达情况与HCC的主要临床病理特征无明显关系;相关性分析显示HCC癌组织中RANTES和elastin的表达评分呈正相关（r=0．445,P〈0．05）。结论RANTES和elastin的表达与HCC的发生、发展可能关系密切;elastin与趋化因子RANTES密切相关。     

氨溴索联合左氧氟沙星对粘液型铜绿假单胞菌生物被膜的体外干预作用研究

目的探讨盐酸氨溴索（Ambroxol Hydrochloride,Amb）联合左氧氟沙星（Levofloxacin,LFX）对粘液型铜绿假单胞菌生物被膜（biofilm,BF）的影响。方法以铜绿假单胞菌粘液型菌株PDO300为实验菌株,构建体外BF模型。分为生理盐水对照组、Amb组、LFX组、Amb与LFX联合作用组,二倍稀释法测定LFX最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration,MBC）,结晶紫染色法定量测定BF形成量。结果 PDO300培养7d后可形成稳定的BF。与单独应用LFX相对比,Amb与LFX联合作用后测定载体表面BF值显著降低（P〈0.01）,且载体表面BF随着LFX浓度增高而减少。结论 Amb可显著增强LFX对BF的破坏作用。     

百肤青抗铜绿假单胞菌生物膜的作用

目的:观察百肤青体外抗铜绿假单胞菌生物膜的作用.方法:通过琼脂稀释法测定铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC),用改良平板法建立体外铜绿假单胞菌生物膜并检定不同MIC浓度的抗铜绿假单胞菌生物膜的作用,扫描电镜确认. 结果:4种不同MIC的百肤青都有抗铜绿假单胞菌生物膜的作用.结论:中药复方百肤青由于其有抗铜绿假单胞菌生物膜的作用,不仅可用于治疗细菌性阴道病(bacterial vaginosis,BV),还有预防BV的作用.     

黄芪对铜绿假单胞菌毒力因子调控表达及菌体运动的影响

[目的] 观察黄芪对铜绿假单胞菌相关毒力因子表达及菌体运动的影响,探讨黄芪对铜绿假单胞菌的作用机制。[方法] 不同浓度黄芪与对数生长期铜绿假单胞菌共培养,弹性蛋白-刚果红降解实验检测细菌分泌的弹性蛋白酶活性,紫外分光光度法测定绿脓菌素分泌量,结晶紫染色法观察生物被膜形成量,在含黄芪琼脂平板中检测菌体集群运动与泳动能力。[结果] 黄芪在终浓度25、12.5、6.25 g/L条件下对弹性蛋白酶、绿脓菌素表达有显着抑制,并能抑制生物被膜形成。在低于12.5 g/L时对细菌增殖无显着影响。细菌在12.5 g/L条件下泳动能力与集群运动均受到显着影响。[结论] 黄芪对铜绿假单胞菌增殖和毒力因子表达的抑制程度不一致,提示黄芪抑菌可能通过多种途径发挥抑菌功能,并可能在低浓度下便对密度感应系统造成显着抑制。     

抗藻酸盐血清与加替沙星联合对铜绿假单胞菌生物被膜形态的影响

目的　探讨抗藻酸盐血清对黏液型铜绿假单胞菌生物被膜中细菌形态上的影响。方法采用改良的组织培养平板法建立黏液型铜绿假单胞菌生物被膜模型 ,经不同稀释度的抗藻酸盐血清与不同浓度的加替沙星联合应用处理后 ,以银染法快速鉴定 ,扫描电镜 (SEM)确认细菌生物被膜形态 ,并采用计算机图像处理系统进行图像分析。结果　计算机图像分析系统显示 ,空白组生物被膜的平均光密度为 0 82± 0 0 6 ;加入抗藻酸盐血清后 ,抗藻酸盐血清组、抗藻酸盐血清与加替沙星联合用药组生物被膜的平均光密度值分别为 0 79± 0 0 6和 0 70± 0 0 4 ,加替沙星单独用药组生物被膜平均光密度值为 0 76± 0 0 7的 ;光镜和电镜图像可见黏液样物变稀疏 ,细菌数减少 ,形态不甚规则。结论抗藻酸盐血清能够影响黏液型铜绿假单胞菌生物被膜构建和形态 ,与加替沙星联用后可以使黏液型铜绿假单胞菌生物被膜结构发生不同程度破坏。     

银染法观察铜绿假单胞菌生物被膜变化初探

目的探讨银染法观察细菌生物被膜在药物作用前后变化的可靠性。方法建立细菌生物被膜,分别用银染法和扫描电镜进行观察生物被膜的变化。结果银染后普通光学显微镜观察和扫描电镜观察对生物被膜变化的观察结果完全相符。结论用银染法观察细菌生物膜的变化便捷、可靠。     

两药联合对铜绿假单胞菌生物膜作用研究进展

铜绿假单胞菌（PA）已成为院内感染的一个重要致病菌,其诱发疾病的特点呈慢性并反复急性发作,死亡率高。铜绿假单胞茵生物被膜（BF）的形成是其重要原因之一。细菌的生物膜能保护细菌抵御抗生素的作用形成耐药性,并能逃避机体免疫系统的攻击,从而造成慢性难治性感染。查阅近年有关文献表明,单种药物很难清除细菌生物被膜,药物联合在防治细菌生物膜感染方面具有独特的优势。该文就抗生素联合、中药联合抗生素抗铜绿假单胞菌生物膜的研究进行综述。     

铜绿假单胞菌及其生物被膜影响A549细胞分泌细胞生长因子的实验研究

目的:通过观察经铜绿假单胞菌及其生物被膜作用后,肺泡上皮细胞A549分泌细胞生长因子水平的变化,探讨其在成纤维细胞活化和增殖及分化中的作用。方法:采用体外诱导铜绿假单胞菌形成生物被膜,应用乙醇沉淀法提取细菌被膜并纯化;选用人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549为靶细胞,采用ELISA法分别定量检测经铜绿假单胞浮游茵及其生物被膜藻酸盐作用后上皮细胞分泌生长因子TGF-β1、FGF-2、CTGF、IGF-1表达量。结果:受铜绿假单胞生物被膜藻酸盐作用后,A549细胞表达TGF-β1、FGF-2、CTGF和IGF-1能力明显增强,CTGF在藻酸盐作用后24 h达到高峰后缓慢下降,其余3种生长因子均在在藻酸盐作用后48 h内持续升高,与对照相比较,差异有统计学意义(P<0.05);浮游菌作用后4种生长因子表达量无明显增加。结论:铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐可增强A549细胞对TGF-β1、FGF-2、CTGF和IGF-1分泌能力。     

烟台市铜绿假单胞菌质粒、转座子、整合子遗传标记研究

目的了解烟台市铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PAE）质粒、转座子、Ⅰ类整合子遗传标记存在状况。方法采用K-B法测定临床分离的30株铜绿假单胞菌对16种抗菌药物的敏感性,采用聚合酶链反应法（PCR）对其进行质粒遗传标记（traA、traF）、转座子遗传标记（tnpA、tnpU、merA）、Ⅰ类整合子遗传标记（intⅠ）检测。结果30株铜绿假单胞菌对16种抗菌药物均有不同程度的耐药。30株PAE菌merA阳性14株,阳性率46．7％;intⅠ阳性14株,阳性率46．7％。其中merA与intⅠ基因同时阳性11株,单独merA基因阳性3株,单独intⅠ基因阳性3株;共有17株检出merA和／或intⅠ基因。其它均为阴性。结论临床分离的铜绿假单胞菌转座子遗传标记和Ⅰ类整合子遗传标记检出率较高。本组PAE菌没有检出F质粒和RP4质粒的遗传标记。     

铜绿假单胞菌亚胺培南异质性耐药的机制

目的: 探讨铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa）亚胺培南异质性耐药的机制。方法: 分别采用常规的KB法和MIC法检测310株铜绿假单胞菌对亚胺培南的敏感性,双纸片协同试验检测金属β 内酰胺酶,实时定量PCR实验检测外排泵基因MexAB和MexCD的表达水平,半定量结晶紫染色法检测生物膜的形成量,PCR扩增法检测细菌膜孔蛋白OPRD2基因是否缺失。结果： 在临床分离的310株铜绿假单胞菌中,检出244株亚胺培南敏感菌株和66株非敏感菌株,244株中有36株铜绿假单胞菌对亚胺培南具有异质性耐药,总体检出率为11.6%。36株异质性耐药铜绿假单胞菌均不产生金属β 内酰胺酶,但高表达MexAB外排泵,且生物膜的形成量也较高,其中6株检出膜孔蛋白OPRD２基因缺失。 结论： 临床存在部分异质性耐药的铜绿假单胞菌,它们通过形成生物膜、高表达多重耐药外排泵基因和基因缺失等机制介导耐药。