人原发性肝癌中p16基因表达及CpG岛甲基化状态的研究

目的：进一步探讨人原发性肝癌中p16基因mRNA转录水平变化与其基因启动子区CpG岛甲基化的关系，及其在肝癌发生中的意义。方法：采用狭缝印迹杂交检测20例人原发性肝癌及相应的癌旁、远癌组织及2例正常人肝组织中p16基因mRNA表达水平，以甲基化特异性PCR分析各组织中p16基因启动子区CpG岛的甲基化状况，并进行统计分析。结果：20例人原发性肝癌中14例（70％）p16 mRNA水平比远癌组织显著降低；13例（65％）显示p16基因启动子区CpG岛甲基化，其中84．6％（11例）伴p16 mRNA转录水平降低。结论：人原发性肝癌中存在高频率的p16基因表达失活，其主要机制可能是启动子区CpG岛甲基化抑制了基因的转录，在人原发性肝癌的发生发展中有重要作用。其临床诊断和治疗意义有待进一步深入研究。     

胃癌中p16基因甲基化及其与胃癌临床病理特征的关系

目的：检测胃癌(GC)p16基因的启动子CpG岛甲基化状态,探讨p16基因甲基化在胃癌发生发展中的作用及其与胃癌临床病理特征的关系。方法：应用甲基化特异性PCR(MSP)检测胃癌组织和正常胃粘膜组织p16基因的启动子CpG岛的甲基化状态。并对胃癌中p16基因的甲基化与临床病理特征之间的关系进行分析。结果：胃癌组织中p1...     

胃癌患者hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化状态及其与蛋白表达的关系

目的：探讨胃癌组织中hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化及蛋白的表达与胃癌生物学行为的关系,并分析hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化与其蛋白表达的相关性。方法：采用甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR,MSP）技术和免疫组织化学SP法检测45例患者胃癌组织、正常胃组织中hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化情况及蛋白的表达。结果：hMLH1基因启动子区CpG岛在胃癌及正常组织中的甲基化阳性率分别为33.3%和0（P〈0.05）;hMLH1蛋白在胃癌及正常组织中的阳性率分别为57.8%和95.2%（P〈0.05）;hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化及蛋白的表达与胃癌的临床病理参数无关（P〉0.05）;hMLH1基因启动子甲基化与hMLH1蛋白表达呈明显的负相关（P〈0.05）。结论：hMLH1基因启动子区CpG岛的异常甲基化是引起蛋白表达缺失的主要原因,hMLH1蛋白表达缺失与胃癌的发生有关。     

胃癌组织中Caveolin-1基因外显子2甲基化状态检测

目的：应用甲基化特异性PCR（MSP）技术检测胃癌组织中Caveotin-1基因外显子2启动子区域5’端CpG岛甲基化状况,探讨Caveolin-1基因甲基化在胃癌发生发展中的作用．方法：收集30例胃癌组织和6例距肿瘤5cm以上的癌旁正常胃组织,运用标准蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提法提取组织中基因组DNA,采用CpGenome DNA Modification Kit对DNA进行修饰后以甲基化特异性引物及非甲基化引物进行PCR,通过琼脂糖凝胶电泳及产物测序判定结果．结果：6例癌旁正常胃组织Caveolin-1基因外显子2启动子区域5＇端CpG岛均为甲基化阴性．30例胃癌组织中有27例甲基化阳性,甲基化率为90％（27／30）．其中16例胃癌组织（53．3％）仅有甲基化引物扩增出目的条带,表现为完全甲基化;11例胃癌组织（36．7％）甲基化与非甲基化引物均扩增出目的条带,表现为部分甲基化．统计结果显示胃癌组织中Caveolin-1基因外显子2启动子区域甲基化率显著高于癌旁正常胃组织．结论：胃癌组织中存在Caveolin-1基因外显子2启动子区域高甲基化,且可能参与胃癌的早期过程．     

舌癌患者 p16基因启动子 CpG 岛甲基化及其与临床病理的关系

目的：研究舌癌与 p16基因启动子区域的 CpG 岛甲基化的潜在关系,并了解 p16基因甲基化与临床病理的关系。方法观察组舌癌标本及对照组正常舌组织标本所提取的 DNA,经亚硫酸氢钠处理改变甲基化碱基,设计相应引物（p16－M、p16－U）Q －MSP 扩增,检测样本中的甲基化比例。结果观察组甲基化阳性率为64．58％（31／48）,对照组阳性率仅2．08％（1／48）,差异有统计学意义（P ＜0．05）;舌癌个体中 pl6基因甲基化比例与病理分期、发生淋巴转移、组织学分化程度相关,与年龄、性别无关。结论p16基因启动子 CpG 岛甲基化现象与舌鳞癌的发生发展关系密切;癌症发展越晚期、肿瘤浸润更深、发生转移、更低分化者 p16基因启动子 CpG 岛甲基化的频率更高,但与患者年龄、性别等因素无关。     

胰液中p16基因启动子区5'CpG岛甲基化改变及其意义

目的：探讨胰液中p16基因启动子区5’CpG岛甲基化检测在胰腺癌诊断中的价值。方法：2005～2006年30例来自长海医院消化内镜中心的胰腺疾病患者入选，采用内镜逆行胆胰管造影（ERCP）下放置鼻胰管收集胰液，沉渣涂片H-E染色进行细胞学检查，甲基化特异性PCR（MSP）法检测胰液及组织中p16基因甲基化状态。结杲：单纯胰液细胞学检查诊断胰腺癌的敏感性为40％（8／20），特异性为100％（10／10），阳性预测值为100％（3／8），阴性预测值为45．4％（10／22），诊断准确性60．0％（18／30）。所有胰液标本均成功抽提出DNA，30例胰腺疾病患者胰液标本进行p16基因启动子区5＇CpG岛甲基化检测，其中20例胰腺癌患者胰液中p16基因甲基化率为35％（7／20），慢性胰腺炎和胰腺囊腺瘤患者胰液中无p16基因甲基化。胰液中p16基因甲基化与常规细胞学联合诊断胰腺癌的敏感性为55％（11／20），特异性为100％（10／10），阳性预测值为100％（11／11），阴性预测值为52．6％（10／19），诊断准确性70％（21／30）。结论：鼻胰管收集的胰液可用于分子生物学检测，检测胰液中p16基因甲基化改变与细胞学联合更有助于胰腺癌的诊断。     

胃癌组织中Runx3的变化机制及其与 p53突变的对比

目的：探讨胃癌组织中runx3的变化机制及胃癌中runx3甲基化改变和p53突变的区别及意义。方法：采用聚合酶链反应－单链多态性（PCR-SSCP）检测runx3的2～4外显子及p53基因5～8外显子在胃癌中的突变情况，采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）技术对30例胃癌组织甲基化状态进行检测，对runx3甲基化率和p53突变率进行分析。结果：2例胃 癌标本在runx3的第3外显子发现突变，第2、4外显子未发现突变改变。 87％（26/30）胃癌 标本runx3基因检测到甲基化改变， 53.3％（16/30）胃癌标本p53基因发现突变，runx3甲 基化率高于p53突变率（P<0.05）。结论：runx3突变不是胃癌的遗传易感因素，runx3启动子区CpG岛的高甲基化是胃癌中runx3的主要改变机制。与p53突变率比较，runx3高频甲基化改变更具有胃癌的遗传学特异性，可能是引起胃癌的关键性基因。     

瘤组织和血浆中P16基因CpG岛甲基化与脑肿瘤生物学行为的关系

目的检测不同类型脑肿瘤患者肿瘤组织和血浆DNA中P16基因启动子区CpG岛甲基化状态，探讨P16基因甲基化与脑肿瘤发生发展的关系以及血浆DNA中甲基化状态对脑肿瘤的早期诊断和预后评价的意义。方法收集新鲜的脑肿瘤癌组织及其对应的血浆标本58例（其中胶质瘤26例，垂体瘤16例，脑膜瘤13例，转移瘤3例），10例健康人血浆标本作为对照。应用半巢式甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测脑肿瘤组织及血浆DNA中P16基因启动子区CpG岛甲基化状态。结果①脑肿瘤患者P16基因甲基化总检出率肿瘤组织中为37．9％，血浆中为22．4％（x^2=3．31，P〉0．05）；②瘤组织和其对应血浆中P16基因甲基化发生率在不同脑肿瘤中的分布为：胶质瘤为42．3％和26．9％，垂体瘤为37．5％和25．0％，脑膜瘤为23．1％和7.7％，转移瘤为66．7％和33．3％，四组比较无显著性差异（x^2=5．17，P〉0.05）；③高恶度胶质瘤组织中P16基因甲基化率为62．5％，显著高于低恶度者10．0％（x^2=3.91，P〈0．05），7例血浆中P16基因甲基化者均来自高恶度胶质瘸患者。结论P16基因启动子区CpG岛甲基化在脑肿瘤中是一个广泛事件，均为甲基化和非甲基化并存，与胶质瘤恶性程度密切相关；血浆DNA中P16基因甲基化与脑肿瘤组织中甲基化状态呈平行关系，血浆中P16基因甲基氍检测可作为脑肿瘤早期诊断和预后判断的监测指标之一。     

高低发区食管癌p16基因甲基化及其表达的比较

目的比较p16基因甲基化在食管癌高发区广东揭阳和低发区广东佛山之间的异同,探讨p16基因甲基化在两地食管癌变过程中所起的作用。方法采用甲基化特异性PCR方法（MSP）分别检测两地食管癌组织、癌旁组织和切缘组织p16基因启动子区域CpG岛甲基化状态。采用EnVision免疫组化法检测两地食管癌组织及癌旁组织的p16蛋白的表达。结果高发区75例标本中,食管鳞癌、癌旁及切缘组织的p16基因甲基化率分别为41．3％（31／75）、13．3％（10／75）和6．7％（5／75）。鳞癌及癌旁组织p16蛋白的阳性表达率分别为29．3％（22／75）和56．7％（17／30）。31例甲基化阳性标本中有2例（6．4％）检测到p16蛋白表达,而44例甲基化阴性的标本中有20例（45．5％）检测到p16表达;低发区55例标本中,食管鳞癌、癌旁及切缘组织的p16基因甲基化率分别为18．2％（10／55）、5．5％（3／55）和0（0／55）。食管鳞癌、癌旁组织p16蛋白阳性表达率分别为36．4％（20／55）和66．7％（20／30）。10例甲基化阳性标本中有1例（10．0％）检测到p16蛋白的表达;而45例甲基化阴性的标本中有19例（42．2％）检测到p16表达。两组鳞癌组织的p16基因甲基化率均明显高于癌旁及切缘组织（P〈0．05）;p16蛋白表达与p16基因甲基化呈负相关。高发区癌组织p16基因甲基化率明显高于低发区,差异有显著性（P〈0．05）。两组间癌组织p16蛋白表达率差异无显著性（P〉0．05）。结论p16基因异常甲基化可能是高发区食管癌癌变过程的重要事件,而在低发区p16基因异常甲基化可能不是其失活的主要机制。高、低发区可能存在不同的食管癌致癌机制。本研究从环境因素和p16基因之间的相互作用方面,为高发区和低发区食管癌的发生提供了一定的理论依据。     

人原发性肝癌中p16基因表达及CpG岛甲基化状态的研究

目的　进一步探讨人原发性肝癌中 p16基因 m RNA转录水平变化与其基因启动子区 Cp G岛甲基化的关系 ,及其在肝癌发生中的意义。方法　采用狭缝印迹杂交检测 2 0例人原发性肝癌及相应的癌旁、远癌组织及 2例正常人肝组织中 p16基因 m RNA表达水平 ,以甲基化特异性 PCR分析各组织中 p16基因启动子区 Cp G岛的甲基化状况 ,并进行统计分析。结果　 2 0例人原发性肝癌中 14例 (70 % ) p16 m RNA水平比远癌组织显著降低 ;13例 (6 5 % )显示 p16基因启动子区 Cp G岛甲基化 ,其中 84 .6 % (11例 )伴 p16 m RNA转录水平降低。结论　人原发性肝癌中存在高频率的 p16基因表达失活 ,其主要机制可能是启动子区 Cp G岛甲基化抑制了基因的转录 ,在人原发性肝癌的发生发展中有重要作用。其临床诊断和治疗意义有待进一步深入研究。     

中药成分CDP抑制肿瘤细胞生长及其去甲基化作用的研究

目的探讨中药成分CDP对肿瘤细胞系的生长抑制作用及其对抑癌基因p 16启动子区CpG岛的去甲基化作用。方法培养人肝癌细胞系Huh-7和乳腺癌细胞系T 47D,用M TT法检测药物对肿瘤细胞生长的抑制作用;分别用不同剂量、同一剂量不同时间的CDP和5-azacytid ine(5-aza-C)作用细胞;同时提取细胞的DNA,用甲基化特异性PCR(m ethy lation-spec ific PCR,M SP)的方法观察肿瘤细胞系p 16基因启动子区CpG岛甲基化/去甲基化的状态。结果①Huh-7和T 47D细胞系皆为抑癌基因p 16启动子区CpG岛完全发生甲基化的肿瘤细胞系。②CDP和5-aza-C以时间、剂量依赖方式抑制Huh-7和T 47D增殖。③在25、50、75和100μm o l/L的CDP持续作用6 d后,Huh-7和T 47D p 16基因启动子区CpG岛甲基化特异性条带仍然存在;Huh-7在四个剂量CDP作用下,非甲基化特异性条带被扩增出,T 47D则在50、75和100μm o l/L CDP作用下,非甲基化特异性条带被扩增出。④在50μm o l/L CDP作用后,Huh-7和T 47D p 16基因启动子区CpG岛甲基化特异性条带仍然存在;Huh-7非甲基化特异性条带自12 h出现并持续到144 h,而T 47D非甲基化特异性条带72 h出现并持续到144 h。结论中药成分CDP可以抑制肿瘤细胞的生长并可以逆转高甲基化的p 16基因,具有开发并成为抗肿瘤药物的潜在价值。     

胃癌及癌旁组织多个肿瘤相关基因超甲基化

目的检测胃癌及癌旁组织肿瘤相关基因超甲基化状态,探讨多个肿瘤相关基因启动子超甲基化与胃癌发生的关系。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应,检测23例手术切除的胃癌组织、癌旁组织和10例胃镜活检正常的胃黏膜组织的hMLH1、E-cadherin、GSTP1、p16和p15基因启动子区域的超甲基化状态。结果正常胃黏膜组织未检测到所选基因的超甲基化,22例(95.7%)胃癌组织和7例(30.4%)癌旁组织中检测到超甲基化。在17例(73.9%)胃癌组织和5例(21.7%)癌旁组织可以检测到2个以上基因的超甲基化;E-cadherin、p15和p16三个基因的甲基化率分别为78.3%、82.6%、60.8%,明显高于hMLH1和GSTP1的34.8%和17.4%。结论胃癌组织和邻近的癌旁组织中可以同时检测到多个肿瘤相关基因的甲基化,启动子区域超甲基化导致的基因功能失活可能发生在胃癌肿瘤形成的早期。     

甲基化特异PCR方法对p16肿瘤抑制基因的研究

目的：研究肺癌、结肠癌组织中p16肿瘤抑制基因甲基化状态及其临床意义。方法：采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）方法,特异扩增分析甲基化和非甲基化两种状态。结果：p16基因在人胚肺组织处于非甲基化状态;在人肺巨细胞癌细胞系（PLA801-D）呈甲基化状态;在检测的肿瘤标本中,60%肺癌组织及70%结肠癌组织出现甲基化状态。结论：p16基因的甲基化状态是肺癌、结肠癌组织中p16基因异常形式之一,有可能成为肿瘤分子诊断的重要标志,MSP方法有临床普及应用前景。     

胃癌组织及转移组织中DNA甲基化差异的研究

目的 研究胃癌原发灶和转移淋巴结组织问基因组DNA甲基化程度的差异以及寻找胃癌淋巴转移抑制基因。方法应用甲基化CpG岛扩增（MCA）方法富集甲基化的基因组DNA序列,以转移淋巴结MCA产物为检测子,原发灶MCA产物为驱赶子,进行代表性差异显示分析（RDA）。将获得的甲基化差异片段克隆、测序,获得碱基序列,用生物信息学进行分析。结果获得19个差异序列,分布于5端,外显子,内含子及3’端。其中KL59位于9p21,为p16基因的第一外显子内;KL22位于PTPRG基因启动子区。以KL22作探针与驱赶子、检测子及3轮RDA产物杂交,除驱赶子外都有杂交信号。结论胃癌原发灶与转移淋巴结组织问DNA甲基化存在差异,MCA-RDA方法为一种较好的分析方法。     

p16基因CpG位点甲基化在维吾尔族宫颈鳞癌及HPV16感染中的意义

目的:探讨p16 基因启动子区CpG 位点甲基化及HPV16 感染与新疆维吾尔族宫颈鳞癌的关系及其意义。方法:采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱方法(MALDI-TOF MS) 对20 例维吾尔族宫颈鳞癌及20 例对照组维吾尔族宫颈组织中的p16 基因启动子CpG 位点甲基化进行定量检测;采用聚合酶链反应(PCR) 的方法检测两组HPV16 的感染状况。结果:宫颈鳞癌及对照组中p16 基因启动子区16 个CpG 位点中CpG1-2, CpG6 为甲基化差异位点, 宫颈鳞癌组中CpG1-2, CpG6 位点甲基化水平明显高于对照组;宫颈鳞癌组的HPV16 感染率明显高于对照组, 差异有统计学意义(P<0.05);所检测的维吾尔族宫颈鳞癌组织中p16 基因启动子区CpG 位点甲基化与HPV16 感染无明显相关。结论:p16 基因启动子区CpG1-2, CpG6 位点高甲基化及HPV16 感染均与维吾尔族宫颈鳞癌的发生有关系, 但为两个独立事件。     

γ射线诱发小鼠白血病模型中p16基因的改变

目的：研究γ射线诱发小鼠白血病模型中p16基因的失活机制。方法：应用聚合酶链反应(PcR)扩增39例γ射线诱发的白血病和对照小鼠胸腺组织中p16基因第1、第2外显子，检测等位基因纯合性缺失；用限制性内切酶-PCR法检测p16基因的甲基化发生情况；并应用PCR-单链构象多态性分析银染方法检测p16基因碱基突变的发生。结果：在白血病模型中，外显子2的缺失率为33．3％，甲基化的发生率为23．1％。结论：γ射线诱发的小鼠白血病模型发生、发展过程中伴有p16基因的改变，其失活以纯合性缺失和甲基化为主。     

急性ST段抬高心肌梗死患者LDLR基因启动子区的甲基化修饰

目的分析急性ST段抬高心肌梗死(STEMI)患者低密度脂蛋白受体(LDLR)基因启动子区CpG岛甲基化修饰程度。方法选择经急诊确诊的STEMI患者48例(STEMI组),立即抽取静脉血查血脂和保存用于DNA提取;以健康人群36例为对照组,亚硫酸氢盐修饰后测序检测其LDLR基因启动子区甲基化程度。结果STEMI组患者血清低密度脂蛋白(LDL)水平较对照组升高,在LDLR基因启动子区CpG岛(-383,-140)片段中所包含的7个CG位点均无发生甲基化。结论 STEMI患者血清LDL水平改变与LDLR基因启动子区CpG岛(-383,-140)的甲基化修饰无关。     

胃癌中IRX1的表达与启动子区甲基化的相关性

目的探讨胃癌中同源盒基因IRX1的表达与启动子区甲基化修饰之间的关系。方法生物信息学软件分析IRX1基因启动子区;RT-PCR检测胃癌细胞株及手术切除胃癌组织IRX1基因mRNA表达水平;MSP及BSP法检测启动子区甲基化状态;检测去甲基化试剂5-杂氮-2’-脱氧胞苷的干预对胃癌细胞IRX1基因表达的逆转效应。结果经生物信息学预测IRX1基因转录起始点上游启动子区富含CpG岛;胃癌细胞株及胃癌组织IRX1基因表达有不同程度下调;MSP及BSP检测显示所有胃癌细胞株启动子区呈高甲基化状态;经5-Aza-CdR处理的细胞株IRX1基因的表达有不同程度上调。结论胃癌中IRX1基因的表达下调与启动子区甲基化修饰有一定关系,为探讨IRX1基因作为去甲基化治疗靶点的可能性提供了实验数据。