实时RT-PCR定量检测前列腺癌患者外周血DD3 mRNA及其临床意义

目的探讨前列腺癌（PCA）患者外周血DD3mRNA的检测方法及其临床意义。方法建立SYBRGreenⅠ实时RT-PCR定量检测DD3mRNA,分别检测39例不同分期PCA患者（PCA组）、32例前列腺良性增生（BPH组）患者和26名健康男性（健康组）外周血中DD3mRNA含量,并进行对比分析。结果建立的SYBR Green实时RT-PCR方法最少可检测到10拷贝的核酸,在原始模板101-107拷贝范围内,CT值与起始模板浓度具有良好的线性关系;扩增后仅有的溶解曲线峰显示很好的特异性;批间变异系数范围为6.0%～14.8%。健康组DD3mRNA均为阴性,27例BPH组患者中4例结果检测在101数量级,而39例PCA组中26例阳性。PCA组未治疗患者和去势治疗患者DD3mRNA阳性率及定量值比较差异均有统计学意义（P〈0.01）,PCA组无骨转移患者和骨转移患者阳性率和定量值比较差异也均有统计学意义（P〈0.05）。结论基于双链嵌合染料SYBRGreen建立的RT-PCR定量检测DD3mRNA方法具有敏感性高、线性检测范围广、特异性强及重复性较好的特点。外周血DD3mRNA的丰度与前列腺癌的发生、发展及转归都有密切关系。     

前列腺液中DD3mRNA定量检测无侵入性诊断前列腺癌的意义

目的探讨前列腺按摩后前列腺液沉渣中DD3mRNA含量在前列腺癌诊断中的应用价值。方法在前列腺穿刺活检前或术前麻醉后收集前列腺按摩后患者的前列腺液。其中前列腺癌（Pca）患者31例,前列腺增生患者（BPH）59例,离心取细胞沉淀物,用荧光实时定量逆转录-聚合酶链反应（Real time RT-PCR）方法检测DD3mRNA和PSAmRNA含量,以PSAmRNA作为管家基因校正前列腺液沉渣中的前列腺细胞,以DD3mRNA/PSAmRNA比值表示DD3mRNA含量。SPSS 13.0分析相关数据,以穿刺活检或术后病理检查结果为金标准,用受试者工作特征曲线（ROC）对DD3mRNA诊断性能进行分析,并与血清tPSA进行比较,同时探讨前列腺液DD3mRNA相对定量值阳性率与病理分级的关系。结果前列腺癌患者前列腺液DD3mRNA表达量明显高于BPH,差异具有统计学意义（P〈0.05）。ROC曲线分析结果显示,曲线下面积（ROC-AUC）=0.879（95%CI=0.795～0.964）。DD3mRNA相对定量值截断值取0.015313时,其诊断效能最大。其灵敏度为0.806,特异度为0.864,准确性0.67,阳性预测值75.8%,阴性预测值89.5%,阳性似然比、阴性似然比分别为5.97、0.224。若血清tPSA分别以4ng/ml和10ng/ml为截断值时,灵敏度分别为83.8%和54.84%,特异度分别为61.02%和83.05%,不同病理分级之间DD3mRNA的阳性率差异无统计学意义（P〉0.05）。结论前列腺液中DD3mRNA测定的诊断性能明显高于血清PSA,作为前列腺癌的一种非损伤性诊断方法具有良好的应用前景。     

荧光实时定量PCR检测前列腺癌抗原3评分方法的建立

目的 前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3,PCA3)基因表达具有前列腺癌特异性,文中建立荧光实时定量PCR(FQ-RT-PCR)检测PCA3评分的方法.方法 分别以LNCap和PC-3细胞株为阳性和阴性对照,用TaqMan探针建立检测PCA3和前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA) mRNA的荧光实时定量PCR方法,评价特异性、重复性和计算扩增效率,建立PCA3评分计算公式.结果 检测PCA3和PSA mRNA的批内变异系数分别为1.19%、1.09%、0.84%和0.06%、0.71%、0.79%,批间变异系数分别为1.03%和0.56%;扩增效率分别为0.98和1.00;以2-ΔCt表示PCA3评分.结论 荧光实时定量PCR检测PCA3评分方法的特异性好,重复性高.     

DD3 mRNA及DD3 mRNA/D定量检测对前列腺特异性抗原灰区前列腺癌诊断的临床价值

目的研究前列腺组织中DD3 mRNA及DD3 mRNA/D定量检测在前列腺特异性抗原(PSA)灰区前列腺癌临床诊断中的应用价值。方法选择sPSA 4~10 ng/ml的前列腺增生(BPH)患者1 12例和前列腺癌(PC)患者25例,进行RT-PCR、PSA检测、B型超声检查及前列腺穿刺活检。观察其DD3 mRNA、DD3 mRNA/D、血清PSA(sPSA)、前列腺穿刺活检标本PSA(uPSA)、总PSA/游离PSA比值(f/tPSA)、s/uPSA、PSA密度(PSAD)等参数的差异,并应用ROC曲线分析各参数的诊断价值。结果 2组患者年龄、前列腺体积比较差异无统计学意义(t=12.87、12.31,P>0.05);tPSA、PSAD比较差异均有统计学意义(t=7.31、6.89,P<0.05);PC组DD3 mRNA/PSA mRNA比值明显高于BPH组(t=7.86,P=0.009);PC组DD3 mRNA/D比值明显高于BPH组(t=7.28,P=0.05)。ROC曲线分析结果表明,以0.27为截断值,DD3 mRNA/PSA mRNA的曲线下面积为0.841(95%C1 0.666~0.997);以2.01为截断值,DD3 mRNA/D的曲线下面积为0.907(95%C1 0.790~0.869)。结论 DD3 mRNA含量、DD3 mRNA/D定量检测可以显著提高检出PSA灰区前列腺癌的敏感度,对PSA灰区前列腺癌的早期筛查诊断意义重大,DD3 mRNA/D具有更好的诊断效能。     

胃癌组织Twist基因的荧光实时定量PCR检测

目的探讨Twist基因在人胃癌组织、癌旁组织、胃癌转移灶组织中表达及临床意义。方法应用Trizol法提取总RNA，以总RNA为模板经逆转录合成cDNA，用实时荧光定量PCR的方法检测8例正常胃粘膜，27例胃癌原发灶，19例胃癌转移灶组织中Twist mRNA的表达情况并分析其与临床病理指标的关系。结果荧光实时定量PCR扩增结果显示，Twist基因在正常胃粘膜组织中表达量很低，而在原发性胃癌组、转移性胃癌组中均有较高的表达，原发性胃癌组织及腹膜转移组织中的表达明显高于正常胃粘膜组织（P〈0．05）；Twist基因在淋巴转移组织中的表达与原发组中的表达差异显著（P〈0．05）。结论Twist基因在胃癌中过度表达可能促进胃癌的发生与发展，并与胃癌转移密切相关，又可能成为预测胃癌转移潜能的分子基础。     

实时荧光定量PCR技术检测iASPP基因在肝癌组织中的表达及其临床意义

目的 建立iASPP基因的实时荧光定量检测方法,并观察原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中iASPP mRNA的表达情况,分析临床病理学因素在肝癌iASPP基因和扩增中的作用.方法 对46例病理学证实的HCC患者,利用荧光定量RT-PCR检测肝癌组织及癌旁组织iASPP mRNA...     

实时荧光定量PCR技术用于MDS患者基因检测

目的探讨实时荧光定量PCR SYBR Green I探针技术用于骨髓增生异常综合征（MDS）患者基因检测的可行性。方法运用实时荧光定量PCR SYBR GreenI技术，检测21例MDS患者的SLCTA5基因表达情况，并以IDA、ITP、增贫及其他贫血19例为对照组。结果实验组和对照组SLC7A5基因的表达无明显的统计学差异。结论。eal-time PCR技术检测目的基因的表达是非常方便、快捷、准确的方法。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测人c-myc基因方法的建立

目的构建含有c-myc基因的重组质粒并以其为模板,建立以SYBR GreenⅠ染料为荧光指示剂的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测c-myc的标准曲线,为FQ-PCR准确检测c-myc奠定基础。方法用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人食管鳞癌组织的总mRNA中反转录扩增c-myc cDNA,将纯化的PCR产物与pGEM-T Easy载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后挑选阳性克隆重组质粒,分别用PCR扩增、限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切进行鉴定并测序分析。用紫外分光光度计测质粒浓度,计算拷贝数制备FQ-PCR浓度梯度标准品。最后对质粒标准品进行FQ-PCR检测。结果PCR扩增、酶切鉴定及测序分析均证实c-myc重组到pGEM-T Easy载体上。建立了人c-myc标准曲线,其对数与相应的Ct值(循环阈值)具有良好的相关性,相关系数r2=-0.99～-1,斜率为-3.1～-3.6。结论所构建的人c-myc质粒标准品应用SYBR GreenⅠ荧光染料技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏性和特异性高,准确可靠,此方法可作为FQ-PCR检测c-myc基因的标准方法。     

热带假丝酵母菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用初步评价

目的建立、优化快速检测临床标本中热带假丝酵母菌的实时荧光定量PCR方法 ,并对其临床应用进行初步评价。方法用自行设计的高效引物、探针检测5种临床标本中的热带假丝酵母菌,对该方法的敏感性、特异性进行评价,并与真菌培养法进行比较。结果检测临床标本中热带假丝酵母菌的灵敏度可达10 copies/ml,与人类基因组、细菌及其他真菌无交叉阳性反应。与真菌培养法的检测一致性好(Kappa值为0.916,P<0.01)。结论实时荧光定量PCR检测热带假丝酵母菌灵敏度高、特异性强,可直接用于各种临床标本中热带假丝酵母菌的检测,而且可大大缩短报告时间,为临床诊断提供可靠依据。     

SYBR荧光实时定量PCR检测NSCLC中ERCC1基因表达

目的:建立检测核苷酸切除修复基因ERCC1mRNA的SYBR Green I实时定量PCR的方法,了解肺癌组织及其癌缘肺组织中ERCC1的表达水平,研究肺癌组织中ERCC1的表达水平与各种临床病理特征之间的关系.方法:应用SYBR荧光实时定量PCR(Real-time PCR)技术检测30例肺癌组织和离肿瘤边缘5cm处正常癌旁组织中的ERCC1mRNA表达水平,同时分析ERCC1表达水平在不同肺癌临床分期和病理类型各组间的关系.结果:肺癌中ERCC1mRNA的表达(5.16±2.51)低于正常癌旁组织(11.17±4.79)(P<0.05).但在不同肺癌临床分期、组织类型各组之间差异均无统计学意义.结论:所建立的SYBR Green I实时定量PCR方法可以成功地检测ERCC1基因的表达量.     

人前列腺特异性抗原mRNA实时荧光PCR定量标准品的构建

目的构建实时荧光定量PCR(FQPCR)的标准品以定量检测人前列腺特异性抗原(PSA)mRNA的表达。方法以Trizol裂解抽提法提取LNCaP细胞的总RNA。以RTPCR法制备PSAcDNA目的片段并进行扩增;以AT载体克隆法制备重组质粒,并转化E.coliDH5α菌提取重组质粒,联合用氨苄青霉素筛选法和α筛选法、EcoRⅠ限制性酶切和序列分析法鉴定特异性重组质粒。用聚乙二醇沉淀法提纯质粒并检测λ260nm吸光度,确定原液的重组质粒的拷贝浓度并以此制备FQPCR梯度标准品。结果PSAcDNA目的片段成功制备并获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列的完整性。结论成功构建了实时荧光定量PCR标准品。     

人前列腺特异性抗原mRNA实时荧光POR定量标准品的构建

目的 构建实时荧光定量PCR（FQ-PCR）的标准品以定量检测人前列腺特异性抗原（PSA）mRNA的表达。方法 以Trizol裂解抽提法提取LNcaP细胞的总RNA。以RT-PCR法制备PSAcDNA目的片段并进行扩增；以A-T载体克隆法制备重组质粒，并转化EcoliDH5。菌提取重组质粒，联合用氨苄青霉素筛选法和筛选法、EcoRI限制性酶切和序列分析法鉴定特异性重组质粒。用聚乙二醇沉淀法提纯质粒并检测）．260nm吸光度，确定原液的重组质粒的拷贝浓度并以此制备FQPCR梯度标准品。结果 PSAcDNA目的片段成功制备并获得稳定的重组质粒。保持了目的片段的特异性和序列的完整性。结论 成功构建了实时荧光定量PCR标准品。     

前列腺癌中DD3的表达及意义

目的 检测DD3 mRNA在前列腺癌中的表达,探讨其在前列腺癌诊断中的作用,并分析其与前列腺癌临床分期和病理分级之间的关系.方法 采用SYBR-Green I实时荧光定量RT-PCR.法检测DD3 mRNA在34例前列腺癌、20例前列腺增生组织及3种前列腺癌细胞株中的表达,同时收集临床病例数据,分析其表达含量与临床分期和病理分级之间的关系,应用SPSS13.0对数据进行统计分析.结果 ①DD3 mRNA在前列腺癌组织和前列腺癌细胞株中的表达量明显升高,与其在前列腺增生组织中的表达量相比,差异具有显著性(P<0.001).②在不同的临床分期与病理分级中,DD3 mRNA的表达量随临床分期和病理分级增加而增加,其差异亦具有显著性(P<0.001).结论 DD3 mRNA在前列腺癌中呈高表达,可作为前列腺癌的一项特异性早期诊断标记物,其与前列腺癌的临床分期和病理分级具有相关性,提示其有可能在前列腺癌的发生发展中起重要作用.     

实时荧光定量PCR检测CD258在前列腺癌组织中的表达

目的 应用实时荧光定量PCR(RQ-PCR)法检测CD258(肿瘤坏死因子14,TNFSF14)在前列腺癌(PCa)组织中的表达,以探讨CD258基因与PCa的关系.方法 提取正常前列腺组织、良性前列腺增生(BPH)组织及经病理确诊的PCa组织中的总KNA,并逆转录为cDNA,应用RQ-PCR.法检测CD258的表达.结果 在正常前列腺、BPH及PCa组织,CD258的阳性表达率均为100%.在正常前列腺组织中,CD258基因平均相对表达强度为(10.2±1.53),BPH组织中为(9.91±2.01),而在PCa组织中为(3.14±1.72).BPH组及正常对照组比较无统计学差异(P＞0.05),Pca组与BPH组及正常对照组比较有统计学意义(P＜0.05).结论 CD258在PCa组织中出现较低的表达强度,提示其有可能与PCa的发病相关.     

DD3mRNA在前列腺癌早期诊断中的应用现状

摘要：DD3mRNA仅表达在正常的前列腺组织及前列腺肿瘤组织,且在前列腺癌组织中表达量显著增高,对前列腺癌的早期诊断上其特异性及敏感性要明显优于血清PSA,使用DD3基因检测使前列腺疾病患者的活检率降低了49％。DD3mRNA具有高度的前列腺癌特异性,可以减少许多不必要的前列腺穿刺活检,有着较好的临床应用前景。     

巢式RT-PCR检测前列腺癌患者外周血中PSA mRNA和PSM mRNA的比较

目的　盲法比较研究巢式反转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测前列腺癌 (PC)患者外周血中前列腺特异性膜抗原(PSM)mRNA和前列腺特异性抗原 (PSA)mRNA在PC诊断中的真实性和可靠性 .方法　根据PSM和PSA的cDNA序列设计合成引物 .应用巢式RT PCR方法分别检测 36例PC患者和 2 3例前列腺增生 (BPH)患者外周血中PSMmRNA和PSAmRNA .结果　PSAmRNA和PSMmRNA阳性表达的灵敏度 (Sen)分别为 :2 9.7% ,6 7.6 % (P <0 .0 1) .特异度 (Spe)分别为 :86 .4 % ,10 0 .0 % (P <0 .0 5 ) .准确度 (Ac)分别为 :5 0 .8% ,79.8% (P <0 .0 5 ) .卡柏值 (κ)分别为 :0 .13(差 )、0 .6 (一般 ) .结论　应用巢式RT PCR方法 ,患者外周血中PSMmR NA在PC的诊断、微转移、术后随访、人群筛选中的真实性和可靠性明显优于PSAmRNA .